Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Protein ilaçlar biofarmasötik endüstrisinin en hızlı büyüyen sektör olan ve hormonal bozukluklar, kanser ve otoimmün hastalıklar ¹ olmak üzere daha önce inatçı hastalıklar için umut verici yeni tedaviler sunuyoruz. 2012 yılında, küresel Biyoterapötikler pazarı 138.000.000.000 $ ulaştı ve yıl 179.000.000.000 $ ulaşması bekleniyor 2018 ^2. Proteinler büyük ve geleneksel küçük molekül ilaçların daha kırılgan ve böylece bozulması ³ birçok türleri daha hassastır. (Örneğin, dondurularak kurutulmuş) bir katı madde tozlar liyofilize yeterli raf ömrü ve stabilitesini sağlamak için, protein ilaçlar genellikle formüle edilir. Bununla birlikte, bir protein yine doğal yapısı Liyofilizasyon işlemi esnasında ^{4,5 'korunmaz,} özellikle katı halde bozulma tabi olabilir. Bu yapı muhafaza edilmiştir sağlanması sufficien ile katı halde protein yapısını sondalamak analitik yöntem bulunmaktadır geçerli olabilmesit çözünürlüğü.

NMR spektroskopisi ⁶ ve X-ışını kristalografisi ⁷ çözüm ve kristallerin ⁸ protein yapısını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yüksek çözünürlüklü yöntemleri vardır. Için yardımcı maddeler ve kullanılan işleme yöntemlerinin doğası, iyofilleştirilmiş protein, formülasyonlar, genellikle amorf yerine ⁹ kristaldir. homojenlik ve mikroskopik seviyede olmaması şekilsiz katılar proteinler için, yukarıda belirtilen teknikler kullanışsız hale getirir. Fourier kızılötesi spektroskopi (FTIR) ¹⁰ dönüşümü, Raman spektroskopisi ¹¹ ve yakın kızılötesi spektroskopi (NIR) ¹² düzenli yerli çözüm devlet yapısının buna liyofilize tozlar protein ikincil yapısını karşılaştırmak için biofarmasötik endüstrisi tarafından kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin düşük çözünürlüklü ve sadece ikincil yapı küresel değişimler hakkında bilgi verebilir. FTIR kullanılarak katı-hal yapısal karakterizasyonuUzun vadeli depolama stabilitesi zayıf ^13,14 veya kötü ¹⁵ korelasyon ya göstermiştir. Bu sınırlamalar uygun yüksek çözünürlüklü yöntemleri solid-state protein yapısal tedirginlikler tanımlamak için ihtiyaç vurgulayın.

Proteoliz ve kütle spektrometrik analiziyle birlikte kimyasal etiketleme, sulu çözelti içinde, protein yapısı ve molekül etkileşimleri izlenmesi için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. İlaç gelişmede, HDX-MS protein ilaçların ¹⁹ uyum post-translasyonel modifikasyonlar etkilerini izlemek için, reseptör-ilaç etkileşimleri ¹⁸ harita ve karşılaştırmak için, antijen-antikor etkileşimleri ^16,17 epitop haritalama için kullanılır olmuştur biyobenzerlerin ²⁰ gelişmekte olan partiden partiye varyasyonu. Benzer şekilde, foto-aktifleştirilebilen ligandlar ilaç hedeflerini tanımlamak ve bağlanma afinitesini ve ilaç-reseptör etkileşimleri ^21,22 özgüllüğünü belirlemek için kullanılmıştır. Extend liyofilize formülasyonlar bu yöntemlerin uygulanması, bizim grup geliştirdi katı-hal hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi (ssHDX-MS) ve katı-hal fotolitik etiketleme kütle spektrometresi (Sspl-MS) liyofilize örneklerinde protein konformasyonlar ve yardımcı madde etkileşimleri çalışmak için Yüksek çözünürlükte.

SsHDX-MS ve Sspl-MS Her iki protein, liyofilize katı madde ideal tepkime koşulları altında işaretlenir, ve numuneler daha sonra tekrar oluşturulmuş ve veya proteolitik sindirim olmayan kütle spektrometresi ile analiz edilir. Sspl-MS yan zincirlerinin çevre bilgileri (Şekil 1) içerir ise ssHDX-MS, döteryum buhar ana zincir maruz hakkında bilgi sağlar. iki yöntem böylece katı halde protein yapısındaki hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Burada, biz Mb, (Şekil 2) ssHDX-MS ve Sspl-MS kullanılarak liyofilize katı proteinleri okuyan kullanımı için genel bir protokol sağlamakbir model, bir protein. Iki farklı yardımcı maddeler ile formülasyonlar farkını ayırt etme iki yöntemden kabiliyetini gösterir.

Şekil 1:., Farklı etiket mekanizmalarla liyofilize katılar ssHDX ve Sspl ölçer protein yapı (A) 'HDX olarak, omurga amid, bir protein yapısı ve fonksiyonu ve D ₂ O erişim olarak döteryum ile değişimi hidrojenlerin. Katı halde, hızı ve döteryum değişimi derecesi D ₂ O sorpsiyon protein hareketlilik (yayılan ve olayları tekrar katlama) ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğası düzeyine bağlıdır. PLeu bölgesinin diazirine işlevsel grup ara ürün, bir reaktif karben oluşumunu başlatır ve bir XH bağı (X, herhangi bir atomu olması durumunda) veya reklama spesifik olmayan sokulur mil PL (B), 365 UV ışınlamayakın çevresinde bir C = C bağı boyunca pro-. Katı halde ise bu oran ve etiketleme ölçüde lokal işaretleme maddesi konsantrasyonu, uygulama süresi, protein yapısı ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğasına bağlıdır. Paneller A ve B proteininin, sırasıyla omurga ve yan zincirler üzerinde oluşabilecek maksimum teorik etiketleme göstermektedir.

Şekil 2: şematik gösterimi katı hal HDX-MS (A) ve liyofilize edilmiş bir formülasyona protein PL-MS (B) gerçekleştirildi.

1. Numune Hazırlama ve Liyofilizasyon

1. 0.22 um'lik steril bir filtre ile uygun bir tampon ve filtre karşı Mb stok çözeltisi gerekli hacmi Dialyze.
2. (; PLeu L-2-amino-4,4-azi-pentanoik asit), uygun bir tampon içinde stok çözelti katkı maddeleri ve foto-lösin gerekli hacmi hazırlayın. 0.22 um steril filtre ile stok çözelti filtre.
3. Protein, eksipiyanlar pLeu ve tampon solüsyonları kullanılarak Tablo 1 'de gösterildiği gibi, formülasyonları hazırlamak.
4. 0.22 um steril filtre içinden filtre örnekleri adım 1.3 ile oluşan herhangi bir yağ çıkarılır. 2 ml'lik cam şişelere 0.2 ml olarak ayrı ayrı örnekleri doldurun. Sspl-MS çalışmalarında pLeu etkinleştirmek için UV (365 nm) ışık şeffaf cam şişeleri kullanın.
5. Bir liyofilizerde yük flakon ve uygun bir liyofilizasyon döngüsü tasarlayarak liyofilizasyon başlatmak.
   1. Burada, -40 ° C 'de örnekleri dondurma ve ardından12 saat süre ile 25 ° C'de 12 saat ve ikincil kurutma 35 ° C'de vakum altında (70 mTorr) altında esas kurutma yapılır. Liyofilizasyon döngüleri ve kurutma yöntemleri Diğer (örneğin, sprey kurutma) de kullanılabilir.
6. Kapatma önce azot ile liyofilize örneklerini içeren şişeleri Dolgu.

Tablo 1:..., Liyofilize Mb formülasyonları Bileşim ssHDX-MS çalışma için ^kullanılan formülasyonlar, Sspl-MS çalışma için kullanılan ^b formülasyonlar ^C, L-2-amino-4,4-azipentanoic asit ya da foto-lösin (pLeu). pLeu 1x tekabül eden beş farklı konsantrasyonda (14.3 x 10 ^-3 1.43 mg / ml), Mb 10x, 20x, 50x ve ​​100x mol fazlası MBT ve MBS formülasyonları ile birlikte liyofilize edildi.

Sağlam protein 2. ssHDX-MS

1. K _2CO D ₂ O previousl bir _3-200 mi doymuş bir miktarda (~ 440 g) ilave edilirY bir desikatör alt bölme içine yerleştirilmiştir. Hava geçirmez bir desikatörde mühür ve% 43 ulaşıldığında ~ kararlı bir bağıl nem (BN) kadar 5 ° C'de dengelenmeye gelmeye bırakın. Çevrede bulunan nem değerleri farklı doymuş tuz çözeltileri ^23,24 seçilerek elde edilebilir.
2. Desikatör üst bölme içinde liyofilize proteini içeren kapaksız şişeleri yerleştirerek ssHDX tepkileri başlatın. Kurutucu hava geçirmez mühür ve HDX (Şekil 2A) yapılmasına izin vermek için 5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
3. Üçlü olarak çeşitli zamanlarda ssHDX örnekleri toplamak. Mb formülasyonlar için, dokuz zaman noktalarında, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 ve 144 saat bir numune toplayın.
4. Hemen desikatöre çekilerek sonra şişeleri Cap ve sıvı azot içinde şişeleri dondurma flaş tepkileri gidermek. Kütle spektrometrik analiz edilinceye kadar -80 ° C'de saklayın şişesi kullanılmıştır.
5. Uygun yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi-kütle Spectrom kullanarak örnekleri analiztrisi (LC-MS) bir yöntem. Tasarım veya numune analizi sırasında geri-alışverişini en aza indirmek için uygun bir soğutmalı LC sistemi satın. Sütun soğutma ünitesinin kurulumu kullanarak ve LC-MS yöntemi daha önce ²⁵ bildirilmiştir.
   NOT: amid proton değişim oranı pH ve sıcaklığa bağlıdır yana, protein dahil döteronlar, mobil faz hidrojen mevcut ("arka değişim") ile alışverişi bilgi kaybına neden olabilir. Söndürme tamponu ve HPLC çözücülerin bir asidik pH değeri (pH 2.5), sıcaklığı düşürmek için, büyük ölçüde geri-dönüşüm en aza indirmek mümkün olmakla birlikte (≤0 ° C) daha fazla geri değişimi proteini korumak uygun bir kolon soğutma sistemi ile .
6. Otomatik tuz giderme ve yıkama işlemini kontrol vana örnek döngü ve protein tuzak bağlayın. 200-3,200 m / z aralığı içinde kütle spektrometreye bir TOF düşük bir konsantrasyonu ayarlama karışımı enjekte edilerek kütle spektrometresi kalibre edin. immobilizePepsin kolonu ve analitik kolon Sağlam protein analizi için gerekli değildir.
7. ° C ≤0 ve ~ 0 ° C arasında bir sabit çalışma sıcaklığına ulaşmak için sistem beklemek soğutulmuş sistemde sıcaklığı ayarlanır.
8. Hızlı kütle spektrometrik analizi için sıvı azot içine -80 ° C ile ilgili örnekleri aktarın. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde sıvı azot her şişe çekme ve şişeye su içinde% 0.2 formik asit (FA) (pH 2.5) ve% 5 metanol içeren buz gibi soğuk söndürme tamponu belirli bir hacminin ilave edilmesiyle hazırlandı örnek sulandırın.
9. Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir gradyan kullanılarak,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 formik asit (FA) ve elute 1.7 dakika boyunca, protein tuzağı olarak 20 pmol Mb içeren desalt numune% 80 asetonitril,% 20 su ve 0.1 yükselmiştir 3.3 dakika içinde% FA. M / z aralığında 200-3,200 üzerinde kütle spektrumları toplayın.
10. Sağlam kütlesini belirlemek içinProtein, Aşama 2.9 yöntemi kullanılarak bir sulu çözelti içinde bir Dötere edilmemiş protein örnek (değil ssHDX tabi yani protein) için veri elde.
11. Veri analiz yazılımı kullanılarak ham spektrumları karmaşıklığını aydınlatmak suretiyle Dötere edilmemiş ve döteryumlu numune kütleleri elde edilir. Burada, 15,000-18,000 Da, 1.0 Da'lık kütle çözünürlüğü ve Mb kütlesinin hesaplanması için% 90 pik yüksekliğine göre kütle aralığı ayarlamak.
12. Her değişim bir zaman noktasında döteryumlu protein kitle Dötere edilmemiş proteinin kütlesini çıkarılarak sağlam protein (burada, Mb) dahil döteronların sayısını hesaplayın.
13. Aşağıdaki denklem kullanılarak teorik maksimum yüzde döteryum alım göreli hesaplayın (Denklem 1)
    
    Değiştirilebilir amidler = amino asit toplam sayısının burada toplam sayısı - prolin artıkları sayısı - N- 2 ("2" hesaplarhızlı geri değişimini tabi terminal amino grubu ve amid hidrojen).
14. Uygun bir üstel denklem kullanılarak ssHDX kinetik verileri takın. Bir bieksponensiyaldir denklem (Denklem 2), genellikle ssHDX verilerine makul bir uyum sağlar basit olduğunu. Bu çalışmada, MBT ve MBS için, "hızlı" ve "yavaş" havuzları alışverişi döteronlar atar bir bieksponensiyaldir model verileri uygun.
    
    burada _{N, hızlı} ve N _yavaş olarak değiştirilebilir amidlerin sayıda "hızlı" ve sırasıyla, havuzları alışverişi "yavaş", ve _hızlı k ve _yavaş k iki havuzları ile ilişkili birinci dereceden hız sabitleri vardır.

Peptit Düzeyde Protein 3. ssHDX-MS

1. Aşama 2.6 şu değişiklikler ile kullanılmıştır adımları 2,1-2,8 izleyerek ssHDX gerçekleştirin. Hareketsiz pepsin col bağlayınvanaya UMN ve analitik kolon önce ²⁵ rapor ve bir peptid tuzağı ile vanaya bağlı protein tuzağı değiştirme gibi. 100 1700 arasında değişen oranı şarj etmek kitle ayarlayarak kütle spektrometresi kalibre.
   Not: çözme işlemi (adım 2.8) sırasında, bir indirgeme maddesi ve denatüre edici madde, disülfür bağları (örneğin, monoklonal antikorlar) proteinlerin pepsin sindirimi kolaylaştırmak için söndürme tamponu içinde içerilebilir.
2. Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir peptid kapanında 1.7,% 10 asetonitril ile dakika,% 90 su ve% 0.1 FA% 0.1 FA, tuzağı ve desalt peptidlerle Online 20 pmol Mb içeren numuneler özet. 4.0 dakika içinde% 60 asetonitril gradyan artışı,% 40 su ve% 0.1 FA ile analitik sütun üzerine parçaları tasfiye edilir. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları edinin.
3. Bir MS / MS analizi ile peptik parçaları tanımlamakDötere edilmemiş protein örneği. Özel bir veritabanında peptit parçalarının tahmin kitlelere peptid fragmanı iyonlarının deneysel kitleleri karşılaştırmak için kütle spektrometresi yazılımını kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin 10 ppm) olarak ayarlayın. Peptidler uyumlu olarak, (i) bir peptid dizisi, (ii) şarj durumu, ve (iii) tutma süresi oluşan bir listesini hazırlamak.
4. Fragmanını sindirmek Her pepsin için dahil döteronların ortalama sayısını harita ve belirlemek için adım 3.3 oluşturulan listeyi kullanın. Bu, uygun HDX-MS verileri analiz yazılımı ²⁴ kullanılarak elde edilebilir.
5. Yüzde döteryum alımını hesaplamak için ve peptik parçalarının her biri için ssHDX kinetik verileri uygun adımları 2.13 ve 2.14 izleyin. MBT ve MBS formülasyonlar bir bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem 2) monte edildi Bu çalışmada, altı olmayan gereksiz pepsin her biri için HDX kinetik veri parçaları sindirmek.

Bozulmamış Pro 4. Sspl-MSproteindir

1. UV çapraz bağlayıcı üzerinde Fotolitik etiketleme reaksiyonu, ilk anahtarı başlayacak ve lambalar 5 dakika ısınmasını bekleyin. UV kaynağı pLeu ve diazirine grubu etkinleştirmek için dalga boyu 365 nm lambaları ile donatılmış olduğundan emin olun.
   DİKKAT: lambaları açık olduğunda UV çapraz bağlayıcı kapısını açmayın. Kaynak UV koruyucu cam kapı ile kapalı değilse, UV ışığına maruz gözleri ve cildi koruyun.
2. Kapıyı açmadan önce UV çapraz bağlayıcı kapatın. Lambaları kapalıdır sonra, liyofilize edilmiş formülasyonu içeren şişeler şapkasını çıkarmak ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi, UV çapraz bağlayıcı odasının içine yerleştirin. 40 dakika boyunca UV ışığı ile örnekleri ışın tedavisi.
3. PLeu ve (ii) pLeu ile liyofilize örnekler içinde yeniden susuz liyofilize: (i) örnekleri için 4.3'e adım 4.1 izleyerek kontrol deneyleri yapın.
4. Kapak kütle spektrometrik analiz zamanına kadar -20 ° C de küçük şişeler depolamak ve.
5. Reconstit2 uM konsantrasyonu getirmek için kütle spektrometresi dereceli damıtılmış su, uygun bir hacim ilave edilerek bir katı madde örnekleri katkı sağlayacaktır.
6. Örnek analizi başlamak için, adımları 2.6 ve 2.9 izleyin.
   NOT: Arka-değişim kovalent etiketleme ile ilgili bir sorun olmadığından, Sspl-MS özel soğutmalı LC sistemi gerektirmez.
7. Proteinin basit bir kütle belirlemek için, adım 2.9 izleyerek Sspl tabi tutulmamış olan bir protein numunesi için veri elde. Adım 2.11 açıklandığı gibi ham spektrumları çözümlenmesiyle ile etiketsiz ve etiketli örnekleri kitleleri edinin.
8. Aşağıdaki formül kullanılarak Incorporated pLeu sayısını hesaplayın:
   
   M _L işaretlenmiş proteinin kütlesi burada, _{E, N,} doğal proteinin, kütlesi ve 115 (Da), tek pLeu dahil aşağıdaki doğal proteine ​​ilave ortalama kütlesidir. İşaretleme reaksiyonu th oluşur NotN ₂ e kaybı (28 Da). pLeu bölgesinin monoizotopik kütle 143,07 olup.
9. Ekstre iyon kromatogramlardan pik yükseklikleri kullanılarak etiket farklı sayıda protein popülasyonlarının yüzdelerini hesaplayınız.
   
   "i" etiket sayısını ifade etmektedir, pH _ı kütle spektrometresi ile görüldüğü gibi, etiketlenmiş bir protein L _i ve pH için, pik yüksekliği _u işaretlenmemiş protein pik yüksekliği anlamlarına gelmektedir.

Peptit Düzeyde Protein 5. Sspl-MS

1. Adımları 4,1-4,4 takip ederek Sspl gerçekleştirin.
2. Peptid seviyesi analizi için, amonyum bikarbonat tampon maddesi (100 mM, pH 8.0) içinde bir katı madde örnekleri sulandırın.
3. Sulandırıldıktan sonra 10 de tripsin ile etiketlenmiş protein çözeltisi karıştırın tripsin proteinin 1 mol oranında ve 16 saat süre ile 60 ° C'de inkübe edin.
4. FA% 0.1 ekleyerek reaksiyonu söndürmekörnek su içinde 2 uM protein nihai konsantrasyon elde edilir.
5. HPLC sistemine bağlı vanaya örnek döngü, peptid tuzak ve analitik sütun bağlayın.
6. Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, gradyan ile analitik sütunda bir elüsyon ile,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 FA ile 1.5 dakika boyunca, bir peptit kapanında peptidler örnek döngüsünün içine sindirilmiş protein 20 pmol enjekte ve tuzunun giderilmesi 22 dakika içinde% 55 asetonitril,% 45 su ve% 0.1 FA artar. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları toplayın.
7. Böyle daha önceden sağlam protein analizi hesaplanan pLeu numaraları ile EXPASY ²⁶ gibi bir çevrimiçi araç kullanarak adüktlerinin peptid-pLeu için bir teorik kitle listesi hazırlayın. En az 4 bölünmelere cevapsız ekleyin. İşaretleme reaksiyonu _N2 kaybı ile ortaya çıkar unutmayın. Etiketsiz deneyin Bu nedenle, peptid-pLeu aduktu kütlesi = kütleptic peptid + N (pLeu kütlesi) - N "N" dahil pLeu sayısını, _(N2 kütlesi).
   NOT: sağlam proteinin kitle analizi, protein üç etiketli nüfusa kadar gösterseniz, peptid başına üç olası pLeu etiket kadar düşünün. 1 (28) = 1115 Da - 1000 Da'lık kütle ile bir peptid için, 1 pLeu dahil edilmesi ile peptid pLeu adüktün teorik kütle 1000 + 1 (143) 'dir. Benzer bir şekilde, peptid-pLeu teorik kütleleri sırasıyla vb 1230 Da, 1345 Da olacak vb 2 pLeu, 3 pLeu, ekleri de içerir.
8. Deneysel gözlenen kitleler ile adım 5.7 oluşturulan teorik kitle listesini maç kitle analiz yazılımı kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin, 50 ppm) olarak ayarlayın.
9. Peptidler eşleşti için, pLeu gerçek sayısının M _L ve M _N etiketli kitleler vardır aşama 4,8 (Denklem 3), altında formül kullanılarak dahil belirlemeksırasıyla yerli peptit.

Burada, ssHDX-MS-MS ve Sspl liyofilize Mb formasyonların uygunluğu ve katı-hal etkileşimlerine yardımcı maddelerin etkisini incelemek için kullanılmıştır. protein ve bu çalışmada kullanılan katkı maddelerinin konsantrasyonları, Tablo 1 'de verilmiştir. yukarıdaki protokollerin sunulmuştur izleyerek elde edilen liyofilize Mb ssHDX-MS, Sspl-MS analizi ile ilgili Örnek oluşur.

Sağlam protein düzeyinde döteryum alımı

ssHDX-MS sağlam düzeyde Mb formülasyonlar ayırt edebilmektedir. Formülasyon MBS ssHDX 144 saat müteakiben intakt Mb deconvoluted kütle spektrumları formülasyon MBT (Şekil 3A) daha büyük döteryum alımını göstermektedir. Ortalama olarak, MBS MBT (Tablo 2) den% 46 daha fazla döteryum alımı gösterdi.

Şekil 3: ssHDX-MS sağlam Mb için: formülasyonlar gelen döteryumlu sağlam Mb (A) deconvoluted kütle spektrumları MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi) ssHDX 144 saat takip. Dötere edilmemiş sağlam Mb deconvoluted kütle spektrumu da (noktalı çizgi) gösterilir. (B) formülasyonlarda olduğu gibi Mb için ssHDX kinetiği MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı.

sağlam MBS ve MBT için dötertumlanma kinetik erken zaman noktalarında (1-4 saat) benzer, fakat MBS zaman (8-144 saat) (Şekil 3B) artış ile döteryum değişimi artış gösterdi. Bu düşük nem ve sıcaklık koşullarında ssHDX için uzun zaman noktaları seçerek önemini göstermektedir. Ayrıca, D 2 O emme ve difüzyon süreci erken zaman po ssHDX hızını etkileyebilirint. Daha önceki çalışmalar, ssHDX nem sorpsiyon saatlik bir süre içinde tamamlanır ve bu sure geçtikten sonra kinetik alışverişi için en az bir katkı sağladığı göstermiştir. gözlenen hızı ve değişim ölçüde bu nedenle sadece D 2 O adsorpsiyon 27,28 ölçütleri değildir. Üç bağımsız ssHDX-MS örnekleri standart sapma gösteren Şekil 3B'de küçük hata çubukları, deney yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.

Tablo 2:. Mb formülasyonların ssHDX çalışmalarında döteryum alımının niceliksel ölçümleri bileşimi için Tablo 1'e bakınız kuramsal maksimum b yüzde döteryum alım görece sağlam Mb göre HDX 144 saat sonra, 5 ° C,% 43 bağıl nem (n = 3 ile. , ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon tarafından belirlenen ortalama ± SD). c Parametreleri. Sağlam Mb için döteryum değişimi zamanı ders bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem. 2) takıldı. Parantez içindeki değerler. Regresyon parametrelerinin standart hataları ölçümlerde yüzde değişim calcul vardı dated 100 x [(MBS değeri - MBT değer) / (MBT gelen değer)].

MBT ve MBS için döteryum alım kinetik için regresyon parametreleri (N hızlı, N yavaş, hızlı, k ve yavaş k) Tablo 2'de verilmiştir. N, hızlı ve N yavaş değerler MBT daha MBS, N yavaş farklılıkları daha olmasına rağmen değerleri N hızlı değerlerde farklılıklar daha fazla idi. N yavaş değer MBT daha MBS% 75 daha fazla iken Özellikle, N, hızlı değer, MBT daha MBS sadece% 18 daha fazladır. Bu MBT küçük K yavaş değerlerinin herhangi MBS D 2 O maruz kalan katkı maddeleri ile MB yapısı ya da amid gruplarının korunması daha yüksek tutma olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, detaylı mekanizmaları açıkça anlaşılamamıştır. Her iki formülasyonun için oran sabitleri (hızlı k ve yavaş k) çok benzerdir.

peptid seviyesinde Döteryum alımı

Pepsin sindirimi takiben 52 peptidlerin bir toplam tespit edilmiştir. MB dizisinin% 100'e karşılık gelen altı artıklı olmayan fragmanlar burada rapor analizi için kullanıldı. Daha önce 24 eden grup tarafından rapor edilen bilgiye, üst üste binen parçaları kullanılarak elde edilebilir. Herbir peptid için toplam yüzde döteryum alımı hesaplandı ve 144 saat numunelerden elde edilen sonuçlar (Şekil 4A) çizilmiştir. Altı peptik parçaları için HDX kinetik "yavaş", "hızlı" ve değişimi geçiren amid hidrojenin alt popülasyonlar ile tutarlı bieksponensiyaldir davranış (Şekil 4B), gösterdi.

Şekil 4: peptid seviyesinde Mb için ssHDX-MS: 6 olmayan Redu (A) yüzde döteryum alımıformülasyonlarda Mb gelen ndant peptik fragmanlar (gri) MBT ve MBS (beyaz) HDX 144 saat takip. Formülasyonlarda Mb altı olmayan gereksiz peptik parçaları için (B) ssHDX kinetik MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı.

Olmayan şekilde peptitler için regresyon parametreleri Şekil 5'te sunulmaktadır. Peptid kısımları için donatılmış hız sabitleri tek amidler, ortalama oranı sabit değildir gibi, peptik parçaları için gözlenen hız sabitleri doğrusal sağlam protein için olan ile ilişkili değildir. Formülasyonlar MBS (fragman 56-69 hariç) peptik parçalarının çoğu N hızlı değerler MBT (Şekil 5A) bu biraz daha fazlaydı. Benzer şekilde, k hızlı değerler genellikle formulatio arasında çok az bir fark gösterdiMb molekülünün (Şekil 5B) farklı bölgelerde ve ns. Ancak MBS N yavaş ve k yavaş değerler MBT (Şekil 5C ve 5D) için daha tüm parçaları önemli ölçüde büyüktür. anakartlardan yavaş yavaş N ve k önemli artış "yavaş" alışverişi havuzlarında amid gruplarının büyük hareketlilik yansıtabilir.

Şekil 5: Mb peptik peptidler için ssHDX kinetik parametreleri: Yok hızlı (A), MBT (gri) ve MBS (N yavaş (C), hızlı (B) k ve formülasyonları Mb altı olmayan gereksiz peptik peptidler için ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon elde edilen yavaş (D) değerleri k beyaz) (n = 3, ± standart hata). </ P>

Sağlam protein düzeyinde fotolitik etiketleme

LC-MS (Şekil 6A) ile tespit edildiği üzere Mb birden fazla MB-pLeu ilave maddelerin oluşturduğu 20x fazla pLeu varlığında ışınlandı. 20x pLeu etiketsiz Mb kütlesine 115, 230 ve 345 Da ilavesi ile 3 etiketlere geldi ile MBT için açılmış spektrumları 40 dakika için ışınlanmış. 20x ile benzer ışınlanmış MBS pLeu LC-MS ile tespit kadar 2 etiketli nüfusa sahip sağlam düzeyde az pLeu alımı gösterdi.

Şekil 6: Sspl-MS sağlam MB: MBT (düz çizgi) ve 20x fazlası ile etiketlenmiş MBS (kesikli çizgi) için, (A) açılmış kütle spektrumları pLeu (% 5 w / w). Doğal Mb (Mb liyofilize edildi ve pLeu yokluğunda ışınlanmış) olarak açılmış kütle spektrumu noktalı çizgi olarak gösterilmektedir. U (B) Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler). Bütün numuneler 40 dakika süre ile ışınlanmıştır. Hata çubukları, semboller içindedir. (C), formülasyonlar içinde sağlam Mb için Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve radyasyon, zamanın bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler) (ağ /% 20.7 a) liyofilize edildi ve 100x fazla pLeu varlığında ışınlandı. Hata çubukları, semboller içindedir.

Kinetik çalışmalarda, etiketli proteinin yüzde artan ışınlama zamanında (Şekil 6B) ile MBT ve MBS hem katlanarak arttı. MBS her ışınlama zamanında MBT daha az pLeu alımı gösterdi. Her iki formülasyon da 40 dakikada bir düzlüğe ulaşmamıştır ortaya çıktı. Böylece, bir kinetik çalışma bize olabilir eful tam pLeu aktivasyonunu elde etmek için gerekli olan ışınlama süresi belirlemek için. Etiketleme kinetiği pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu (Şekil 6C) olarak alındı. etiketli proteinin yüzde MBT ve MBS hem pLeu konsantrasyonu artmıştır. Bununla birlikte, pLeu ağ / ağ 20.7% 'sinde, MBT pLeu alımında bir azalma olduğunu gösterdi. Bu, yüksek pLeu konsantrasyonda protein yüzeyinden pLeu hariç olmak üzere olabilir. Bu nedenle, pLeu arasında değişen konsantrasyonlarda bir çalışma yüzeyi hariç, protein yüzeyi üzerinde yeterli bir etiketleme sağlayan uygun pLeu konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Bu çalışmada, 20x fazla pLeu fazla peptid seviyesi çalışmalar için seçildi.

Genel anakartlardan için gözlemlenen etiketleme pLeu içeren matris kötü yan zincir erişilebilirlik göstermektedir azalmıştır. Bu azaltılmış etiketleme ile sonuçlanır sorbitol mevcudiyetinde, konformasyonel bir değişim ile tutarlıdır.

Sağlam protein etiketleme çalışmalara dayanarak, 20x aşırı pLeu peptid düzeyinde MBT ve MBS karşılaştırmak için seçildi. İşaretlenmiş örnekler tripsin ile sindirildi ve LC-MS ile analiz edilmiştir. MB dizisinin% 100'e karşılık gelen 40 peptitlerin toplam MBT ve MBS örneklerde tespit edildi. Lys ve / veya Arg kalıntılarını büyük ölçüde etiketlenir, bazı durumlarda, triptik sindirme sınırlı protein sekansı kaplayabilir. Dizisi kapsamını iyileştirmek için, tripsin ve kemotripsin bir karışımı, etiketlenmiş bir protein sindirimi için kullanılabilir.

Şekil 7: Mb için Sspl-MS peptid seviyesinde: Mb Çizgi temsil trehaloz (A) ve sorbitol (B) 'nin mevcudiyetinde, 20x fazla pLeu (ağ / ağ% 5) ile etiketlenir. İşaretlenmiş protein trypsi ile sindirildin ve etiketli peptidler Mb kristal yapısı (PDB Kimliği 1WLA) üzerine eşleştirilmiş. etiketli ve etiketsiz bölgeler sırasıyla, kırmızı ve yeşil renklidir.

tripsin sindirimi ile Sspl-MS peptidler etiketli olma konusunda nitel bilgi sağlar. Sağlam düzeyde farklı etiketlenmiş popülasyonlar göz önüne alındığında, pLeu etiketlenmesi ve etiketlenmiş ve etiketlenmemiş peptidlerin iyonizasyon verimleri farklar rasgele mekanizması, sindirim sonrası Sspl-MS için niceliksel ölçümlerini elde etmek zordur. Ancak, nitel bilgiler hala peptid düzeyinde protein yapısal değişiklikler içgörü sağlayabilir. Bu çalışmada, MBT ve MBS hem formülasyonlar protein yüzey en genelinde pLeu alımı gösterdi. Mbs karşılaştırıldığında, peptid fragmanları 32-42, 134-139 ve 146-153 MBT gelen pLeu etiketleme (Şekil 7) gösterdi. Bu durum, bu amino asitlerin yan zincirleri aşağıdaki regio helislerin olarak pLeu maruz olduğunu göstermektedirns MBT matris içinde sağlam. Bunun aksine, MBS matris içinde pLeu etiketleme koruma, bu bölgelerde yapısal değişimleri ile tutarlıdır.

Genel olarak, ssHDX-MS ve Sspl-MS sonuçları yöntemler omurgasına (ssHDX-MS) ve yan zincir (Sspl-MS), liyofilize edilmiş protein formülasyonlan içinde maruz kalma ve yardımcı madde etkisi ile ilgili tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü peptid seviyesi bilgi düşündürmektedir .

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.