Bir Otomatik Görüntü İşleme Yaklaşımı ile Fare Sosyallik Deneysel Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol Fare sosyallik ölçmek için bir yöntemi anlatmaktadır. onlar hareket ve özel kafese etkileşim olarak fareler videoya. Film işleme mükemmel doğruluk ve güvenilirlik sosyallik otomatik ölçümü için izin verir.

Özet

Fare sosyallik artırmak için tasarlanmış ilaçların test etmek için tercih edilen bir model organizmadır. Biz Test fare standart aparat yerleştirilir ve ilgili davranışlar üç farklı oturumlarda (denilen oturum I, II, III ve) değerlendirildiği fare sosyallik ölçmek için bir yöntem mevcut.

Cihaz üç bölmeleri (Şekil 1) sahiptir, sol ve sağ bölmeleri ( "uyaran fare" olarak adlandırılır) bir fare evi olabilir ters fincan içerir.

Oturum, test, fare kafesine yerleştirilir ve hareket bölmeleri arasında yapılan geçişlerin sayısı ile karakterize edilir. Oturumda II, bir uyarıcı fare ters bardak birinin altında yerleştirilir ve test fare sosyallik boş ters fincan vs kapalı uyaran fare içeren fincan yakın harcadığı zamanın miktarı ile ölçülür. oturumda III, ters bardak kaldırılır bir d Her iki fareler serbestçe etkileşimde. oturumda III test fare sosyallik o uyaran fare doğru yapan sosyal yaklaşımların sayısına göre ve teşvik fare ile bir sosyal yaklaşım önler kez sayısına göre belirlenir.

Filmin otomatik değerlendirme oturumu I ve II tüm açıklanan sosyallik önlemlerinin belirlenmesini sağlar test fare, burun algılar (oturumunda III, yaklaşımlar otomatik olarak tanımlanır ama elle sınıflandırılır). burnu bulmak için, boş bir kafes görüntüsü dijital film her çerçeve çıkarılır ve elde edilen görüntü fare pikselleri tespit çiftlendirildi edilir. fare kuyruğu otomatik olarak kaldırılır ve kalan farenin iki en uzak noktaları belirlenir; Bu burun ve kuyruk tabanına yakın. fare hareketi analiz ve süreklilik argümanlar kullanarak, burun tanımlanır.

"Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
3 seans sırasında Sosyallik Şekil 1. Değerlendirme Oturum (üst):.. Kafesine Test fare Acclimation Oturum II (orta):. Uyaran fare ters fincan içine ise test fare kafes içinde serbestçe hareket Oturum III (alt): Test fare ve uyarıcı fare Hem birbirleri ile serbestçe hareket ve etkileşim için izin verilir.

Giriş

Bozulmuş sosyallik otizm spektrum bozukluğu (ASD'ler) ^1,2 dahil olmak üzere nöro bozuklukları, bir dizi ana semptomu etki biridir. Bu ciddi ilişkileri geliştirmek için hastaların yeteneğini sınırlar ve büyük ölçüde hastaları, aileleri ve bakıcıları ^2,3 etkiler.

Daha iyi tedaviler engelli sosyallik altında yatan mekanizma anlamak ve geliştirmek için bir çaba, birkaç fare modelleri ^1,4-9 çalışılmıştır. Böyle bir suş BALB / c fare, ASD5 ^8-12 hastalarda görülen özellikler andıran çarpıcı düşük sosyallik sergileyen bir kendilenmiş türdür. Örneğin, BALB / c fare sosyal yaklaşımlar ve İsviçre Webster karşılaştırma suşu ¹⁰ daha uyaran fare (örneğin, sosyal kaçınma) tarafından sosyal yaklaşımlara bir çoğunlukla olumsuz yanıt düşük bir frekansı gösterir.

önerilen tedavi effectiv olup olmadığını test etmeksosyallik artan e nesnel ölçütler ihtiyaç vardır. Yaygın olarak kabul görmüş bir çerçeve, üç bölmeye sahip standart bir cihaz içinde sosyallik analiz etmek (bakınız Şekil 1).

sol ve sağ bölmeler her bir sosyal belirgin uyarıcı fare barındıran bir ters tel fincan içerir. test faresi, üç, 10 dakika aralıklarla (oturumları I-III) aygıt içine salınır; oturumları II ve III testi farenin sosyallik farklı yönlerini değerlendirmek ederken oturumu I test fare lokomotor aktivitesini değerlendirir.

Oturum, test, fare cihazının gelmesini bırakılır. Bu oturumda, test fare farklı bölmeleri arasında kılan geçişler sayısı ölçülür. Önemlisi, sosyallik önlemleri standart üç bölmeli tertibatında lokomotor aktivite bağımlı elde edilen ve azaltılmış lokomotor aktivite sosyo yanlış yorumlanmasına neden olabiliryeteneği veri.

oturumda II, test fare serbestçe hareket ediyor ve bir uyarıcı fare ters bardak birinin altında yerleştirilir (denge). uyaran fareler 4 haftalık outbred erkek ICR fareleri yaş ve cinsiyet uyumlu testi farelere vardır. uyaran fare sosyal bölmesi olarak belirlenen yan ters fincan içine alınır ve boş bir ters fincan nonsocial bölmesi olarak belirlenen tarafına yerleştirilir. Oturumda II, test fare sosyallik o (en az 2 cm uzakta) o "nonsocial" ters fincan yakın geçirdiği zaman karşı "sosyal" ters fincan yakın geçirdiği zamanı karşılaştırılması ile ölçülebilir ve zamana göre bir o nonsocial bölmesinde geçirdiği süre vs sosyal bölmeye geçirir. İsviçre Webster karşılaştırma farenin sosyal bölmesine ve sosyal için önemli bir tercih gösteren, BALB / c farelerine göre sosyal ters fincan yakınındaki önemli ölçüde daha fazla vakitters fincan ya da sosyal bölme ^12.

oturumda III, test ve uyarıcı fareler (ters bardak kaldırılır) serbestçe etkileşime izin verilir. bölmeleri arasında sosyallik ölçüleri, stereotipik davranışlar ve geçişler güvenilir test ve uyarıcı fare ve analiz arasındaki serbest etkileşimin üçüncü 10 dakika oturumunda elde edilir. Bu raporda, test farenin sosyallik iki tedbirlerle ölçülür: Bir sosyal yaklaşım uyaran fare doğru (burun önce) ileriye doğru hareket olarak tanımlanan uyarıcı fare, doğru yapar, sosyal yaklaşımların 1) sayısı, böylece burun az 2 cm uzakta uyaran fare olduğu; 2) uyaran fare sosyal yaklaşımlar uzaklaşma sayısı. o açar veya uyarıcı fare uzaklaştığı ya da geçici olarak uyaran fare sonra ( "davranışı donma") hareket durursa Test fare yaklaşmıştır sınama fare yaklaşımını kaçınarak olarak kabul edilir. BALB /c fareleri, İsviçre Webster kıyaslama soyu ¹⁰ göre uyaran fare ve uyaran fare sosyal yaklaşımlar negatif tepkilerin sayısının artmasına doğru yapılan sosyal yaklaşımlar sayısında bir azalma göstermektedir.

Davranışsal filmlerin değerlendirilmesi, geleneksel olarak (muhtemelen düşük hızda) dikkatli film izlerken ve fare belli bir bölmede veya ters bardak ¹⁰ birinin yakınında geçirdiği süre stopwatches aktive ederek, yani elle yapılmıştır. Bu yöntem, bu nedenle, sürekli film izlerken gerektirir ve çok zaman alır. Ayrıca, doğruluk fare ters fincan 2 cm olup olmadığını algılamaya kronometre ölçümleri ve yeteneği değerlendirici en reaksiyon süresi ile sınırlıdır. Son çalışma, iki bileşiğin, (D-serin D-sikloserinin), BALB / c farelerinde ^9,10,12 sosyallik düzeltmede etkili olduğu kanıtlanmıştır. Her iki bileşeni modu bilinmektedirGeç bilinen NMDA reseptörü, sosyal davranış ^2,12 merkezi bir rol oynamaktadır. Bileşiklerin büyük bir dizi iyi-tanımlanmış çeşitli şekillerde NMDA reseptör aktivitesini modüle etmek için bilinen ve ASD tedavisinde önemli bir hamle potansiyeli, bu bileşiklerin bir öncelik ve son derece arzu edilen bir değerlendirme için hızlı bir otomatik yöntem hızlandırılmış bir değerlendirme yapar.

Aşağıda tarif edilen fare sosyallik değerlendirilmesi için geliştirilmiş bir otomatik analiz işlemdir. Bu fare veya farelerin konumunu belirlemek için fare filmlerin tüm kareleri görüntü işleme yöntemlerini kullanır. I ve II oturumlarında, daha fazla burun konumunu algılar ve sosyallik önlemleri hesaplamak için kullanır. oturumda III, otomatik olarak tüm yaklaşımları algılar, ancak manuel sınıflandırma (sosyal yaklaşım, sosyal kaçınma, ya da diğer) gereklidir.

Protokol

1) Deney prosedürü ve 2) Otomatik analiz: açıklama kolaylığı için protokol 2 bölüme ayrılmıştır. Bütün hayvanlar Laboratuar Hayvanlarının ¹⁵ Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre tedavi edildi ve tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Deneysel Prosedür

1. Nonsocial sosyal ve nötr orta bölmesi (Şekil 1): siyah yansıtıcı olmayan pleksiglas dikdörtgen kutu üç bölmeye ayrılmıştır (52 x 25 x 23 cm ³⁾ 'dir kafesi, ayarlayın. oturumları sırasında uç bölümlerinde her ters tel bardak yerleştirin I ve (aşağıda açıklanmıştır) II ve seans II sırasında uyaran fare ev.
2. Kafes görüş alanını doldurur şekilde kamerayı ayarlayın. aydınlatma fare davranışı ile karışabilir olduğundan, dolaylı ışık gelen kafes içinde en fazla 3.5 lux bir parlaklık korumakBir akkor ampul ve yukarıya doğru kafesin ölçülmüştür. Ayrıca anlamda değil ancak kamera tespit edebilir fareler bir kızılötesi ışık kaynağı kullanın. 720 x 480 standart tanımlı tüm film kaydetmek.
3. ( "Referans çerçevesi" olarak adlandırılır), daha sonra görüntü işleme için boş bir kafes tek bir kare kaydetmek ve gri tonlu görüntü olarak kaydedin.
4. I. Oturum: kafesin içine Test fare tanıtmak ve oturumun başlangıç ​​(Otomatik Analizi karşılaştırın) gösteren, kafes üzerinde el sallamak. 10 dakika boyunca rekor filmi. 10 dakika sonunda, özgün kafesin içine geri fare koymak.
5. Oturum II: ters bardak birinin altına uyaran fare koyun (denge).
6. uyaran fare solda veya sağda ters fincan ters fincan olup olmadığını belirlemek için "Sosyal sol" ya da "Sosyal sağ" düğmesini kullanın.
   NOT: uyaran fare ile ters fincan diğer ise "toplumsal fincan" denirfincan "nonsocial fincan". bulunduğu sosyal fincan sosyal bölme denir kompartman, nonsocial fincan bölme nonsocial bölmesi ve orta bölme "nötr bölme" dir.
7. kafesin içine Test fare tanıtın. kafes üzerinde dalga El oturumunun başladığını göstermek için. 10 dakika boyunca rekor filmi. Önemlisi, Oturum III başlamak için ters bardak çıkarmadan önce sosyallik aparatı fareler tutmak.
8. Oturum III: ters bardak çıkarın hem fareler bırakın ve test ve uyarıcı fareler birbiriyle serbestçe etkileşim sağlar. kafes üzerinde dalga El oturumunun başladığını göstermek için. 10 dakika boyunca rekor filmi. 10 dakika sonunda, tekrar kendi kafeslerine iki fareler koydu.

2. Otomatik Analizi

Not: Bölüm 2 komutları bir grafik kullanıcı arabirimi üzerinden verilen o con (bakınız Şekil 2)Bizim yazılım Trols. Burada bizim yazılım izin verir adım adım işleme açıklamak; Yazılım, aynı zamanda, kullanıcı girişi kesikli modda analiz gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.

1. her film için aşağıdaki işlem adımlarını yürütün:
   1. Yük film (Yük düğmesini tıklatın).
   2. Analiz programı kafes sınırları, bölme sınırları ve kupa yerleri konumunu söyler kafes yapılandırmasını seçin. Dört kaydedilmiş yapılandırmaların birini seçin ya da manuel tüm koordinatları ayarlayın.
      NOT: Yapılandırma genellikle bir deneyden sonraki değişmez ve bu nedenle tekrar kullanılabilir.
   3. Filmin her kare için, aşağıdaki işlem adımlarını (2.1.3.1-2.1.3.6) gerçekleştirin.
      1. "Grayscale" butonuna tıklayarak gri tonlamaya çerçeve dönüştürün.
      2. Dijital "Çıkart" düğmesini tıklayarak gri tonlama referans çerçevesi (adım 1.3) çıkarın. NOT: Bu adımın amacı piksel va yapmaktırçok yakın çerçevenin lues fare pozisyon haricinde her yerde sıfır.
      3. siyah belli bir eşik düzeyin altındaki tüm pikselleri ayarlayarak çerçeveyi binarize, beyaz bu seviyenin üzerindeki tüm pikseller ( "binarize" düğmesine tıklayın).
         Not: Fikir fare piksel genellikle kalan pikselden daha yüksek değerlere sahip olduğundan, fare piksel beyaz ve diğer tüm pikseller siyah olacak olmasıdır. en uygun eşik seviyesi aydınlatma durumuna bağlıdır ve bir film boyunca fare şeklini değerlendirerek tespit edilebilir. eşiği çok düşük seçilirse, fare çok büyük görünür ve fare ait olmayan pikseller beyaz renkli olabilir. eşik çok yüksek ise, fare küçük olur ve bağlantısız parçalara parçalanır olabilir. Kaydedilen Film, en uygun eşik 20 ve 35 arasında (0 ile 255 arasında bir ölçekte) her zaman oldu.
      4. Ero çiftlendirildi resim e süreleri, daha sonra, ¹³ 2e kez dilate ¹³ aşındırmakde yine e kere, lütfen "EROD / Dil" iterek.
         Not: Bu prosedür amacı kuyruk kaldırmaktır. kullanılan çözünürlük (x 480 720), e = 3 her koşulda çalıştı.
         Not: Yazılım resimde bir elin varlığı için otomatik olarak kontrol eder (film kayıt sırasında, eller bir oturumun başladığını belirtmek için resmin içinden el salladı edilir). bir el varsa elden bir fare daha büyük olduğu için, ikilileştirilmiş çerçevede alışılmadık sayıda beyaz piksel olacak. bir el varlığı koşulu çiftlendirildi çerçevede 10.000'den fazla beyaz piksel olmasıdır. Yazılım I, II ve III, el hareketleri meydana geldiği kare aralığını tespit ederek oturumların başlangıçlar belirler.
2. aşağıdaki gibi oturumlarda I ve II, devam:
   1. beyaz piksel kümesi büyük bağlı bileşen Algılama ( "LComp" tıklayın). Not: Amaç of Bu adım fare, örneğin oturumda II uyaran fare hareketinden kaynaklanan ait olmayan beyaz pikseller ortadan kaldırmaktır. en büyük bağlantılı bileşen neredeyse tüm kareleri faredir.
   2. "Ends Find" tıklayarak (fare "biter" de denir) iki en uzak beyaz pikseller belirleyin.
      Not: Yazılım ilk karede uçların her biri için, yani iki uç, devamlılığını tesis ait oldukları daha sonra dilimlerinde uçlarının olduğu. Genel bir fikir çerçeveleri yüksek hızında kaydedilir beri, uçları sonraki bir çerçeveden uzak seyahat edemez ki, böylece sonraki bir çerçeveden uçların doğru sürdürülmesi için uzaklığın toplamını en aza indirir olduğunu çok uçları hareket ettirin. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
   3. burun fare hangi sonu belirleyin.
      1. yönünü belirlemek hangi gözlemleyerek bir fare hareket nasıl ağırlık merkezi (COG)çerçeveden değişiklikler (COG en hareket tüm fare piksellerin toplamı hareket olduğunu) çerçeveye.
         Not: piksel p ₁ bir dizi COG, ..., koordinatları p _{n, 1,} .., X, _N ile tanımlanır X:
         
         Fareler genellikle (kendi burnuna doğru, yani) ileriye taşımak. birkaç yüz kare bir bölümünde, baş / kuyruk tespiti çok yüksek güven her zaman vardır.
         Not: Yazılımın otomatik olarak algılanan hangi doğru fare hareket ediyor biter belirler; Bu uç burun olarak tanımlanan ve filmde kırmızı bir daire ile işaretlenir. tespit edilen burun her karede kırmızı bir daire ile işaretlenmiş, kullanıcı algılama kalitesini kontrol edebilirsiniz.
3. aşağıdaki gibi oturumda III, devam:
   1. beyaz piksel en büyük iki bileşeni algılar.
      1. Her iki am için kabul edilebilir boyutta iseouse ve ağırlık onların merkezleri (SMM) bir önceki kareye fare dişleri, bu iki bileşenleri iki fareler dikkate uyumludur.
      2. Bu mesafe izler (önceki çerçeve beri% 20'den fazla tarafından değiştirilmiş değil varsa fare kabul boyutlarını düşünün ve onların fark fare kareler arasındaki zaman içinde seyahat edebilirsiniz mesafeden daha büyük olmayan ise uyumlu olarak iki ardışık kare dişleri dikkate birkaç tek tek farelerin hareketini izleyerek bir deney serisi preparatlar bir parçası olarak belirlenmiş olan maksimum fare hızı, gelen (I ve II oturumları olduğu gibi).
         Not: En büyük iki bileşenleri bir fare için kabul edilemez boyutlarda, ya da cogs önceki çerçevede olanlardan çok farklı ise, en büyük iki bileşenler kabul edilebilir boyutta kadar yazılım otomatik olarak çiftleme eşiğini yükselttiği ve SMM ile uyumludur bir önceki çerçevenin olanlar.
   2. test fareyi tıklayınİlk kare. oturumun III her karede testi ve uyarıcı fare hem belirlemek için 2.3.1 analiz kullanın.
   3. bir fare sosyal diğer yaklaşımları hangi oturumda III kareleri belirleyin. Not: Yazılım otomatik olarak fareler arasındaki mesafe farelerin tipik etkileşim mesafesinden daha az olduğunu kontrol ederek bu adımı uygulayan (biz 2 cm kullanın).
   4. Yazılım kullanıcıya algılanan yaklaşımı ile film kısa bir segment çalarken, bu yaklaşım testi fare ya da ne test fare, sosyal kaçınma ile bir sosyal yaklaşım olarak nitelendirir olup olmadığını belirtmek için bir düğmesini tıklatın.
      Not: Test fare hangi fare biliniyorsa Adım 2.3.4 automatized edilebilir. Bu bilgiler fareler birbirlerine çok yakın olsun kaybolur (ya da birbirinin üstüne tırmanmaya) ve biz var çünkü henüz bizim yazılım tarafından güvenilir bir şekilde tespit VE yapar edilebilir bir şekilde fareler etiketlemek için bir yol bulmuş değil alır çünkü onların davranışını etkilemez, biz geri intikal etmişŞimdilik manuel sınıflandırılması.
4. Yükle düğmesini kullanarak işlenmiş filmleri, yük film değerlendirmek.
   1. oturumun 1 ilk kareyi görüntülemek için Başlat Oturum 1 tıklayın (veya oturum 2'nin ilk kareyi görüntülemek için Oturum 2 Başlat).
   2. filmleri oynatmak ve durdurmak için Çal / Durdur üzerine tıklayın.
      Not: İşlenmiş filmler farklı renkli çevreleri ile işaretlenmiş baş ve kuyruk ile fare gösterecektir. Tüm sosyallik önlemleri ekranda görüntülenir ve film oynar gibi güncellenir.
   3. "Export" tıklayarak Excel formatında ihracat sosyallik verileri.
   4. Tek bir excel dosyası içine bir klasördeki tüm filmlerin tüm verileri derlemek için "Derleme Veri" tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 3 boş bir kafes ile davranışsal filmin bir renk çerçeve gösterir. Fare henüz kafese girmiş değil. (Sosyal ve nonsocial) bardak ve bölme sınırları pozisyonu üst üste. Şekil 4'te gösterilen ve bir referans çerçevesi olarak kullanılan boş bir kafes rengi çerçevesi 8 bit gri ölçekli dönüştürülür. referans çerçevesi Çekilen filmin diğer her çerçeveden çıkarılır.

Şekil 5 bindirilmiş bölme sınırları ve kupa pozisyonları ile tekrar oturum I sı...

Tartışma

videoya fareler ve otomatik film analizi birleştirerek, uygun fiyatlı, güvenilir, yüksek verimli tarama tekniğini oluşturduk.

otomatik analiz doğruluğu 100'den filmler için el ile analiz sonuçları karşılaştırılmıştır. kare kare ezici çoğunluğu (>% 99), fare burun iyi hassasiyetle tanımlanır. Filmlerin yaklaşık% 80'i herhangi bir düzeltme gerekmez böylece (birkaç) misdetections çoğu sosyallik tedbirler üzerinde hiçbir etkiye sahip.

bugüne kadar en yaygın sorun ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pleksiglas kafes	Norva Plastics, Norfolk, VA	ısmarlama	El yazmasında açıklanan boyutlar ve düzen, ihtiyaca göre ayarlanabilir. Görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için yansıtıcı olmayan pleksiglas kullanın
Tel bardaklar	Mutfak artı	315	Uyaran fareyi barındırmak için bir tane, boş
bir Video kamera	SONY	HDR-PJ790	kullanınHerhangi bir kamera ile değiştirilebilir Karşılaştırılabilir özellikler
OpenCV (Görüntü işleme kütüphanesi)	Willow Garage	N/A	Herhangi bir modern görüntü işleme kütüphanesi kullanılabilir.