Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

Özet

Burada, birincil hücreleri, doku modellerini ve punch biyopsilerini 28 güne kadar mikroakışkan çok organlı bir çipte kokültür yapmak için bir protokol sunuyoruz. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri, karaciğer agregatları ve deri biyopsileri ortak bir besiyeri dolaşımında başarılı bir şekilde birleştirildi.

Özet

Piyasaya sürülen yeni maddelerin giderek artan miktarı ve mevcut in vitro test sistemlerinin sınırlı öngörülebilirliği, madde testi için yeni çözümlere yüksek ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. İlaca bağlı karaciğer hasarı nedeniyle piyasadan kaldırılan birçok ilaç, toksik potansiyellerini ancak insanlarda birkaç doz kronik testten sonra serbest bıraktı. Bununla birlikte, kontrollü bir mikro çevre, uzun süreli çoklu dozlama deneyleri için çok önemlidir, çünkü hücre dışı koşullardaki küçük değişiklikler bile hücre fizyolojisini büyük ölçüde etkileyebilir. Araştırma programımızda, çip üzerinde bir pompa tarafından dinamik olarak perfüze edilebilen ve çok organlı uygulamalar için en az iki kültür alanını birleştiren mikromühendislik ürünü bir biyoreaktörün üretilmesine odaklandık. Bu dolaşım sistemi, birincil hücre kültürlerinin in vivo koşullarını daha iyi taklit eder ve hücrelere daha istikrarlı, daha ölçülebilir bir hücre dışı sinyal iletimi sağlar.

Gösterim amacıyla, farklılaşmış HepaRG hücrelerinin asılı damla plakalarında insan hepatik yıldız hücreleri ile toplanmasıyla oluşturulan insan karaciğeri eşdeğerleri, mikrobiyoreaktör içinde 28 güne kadar insan derisi punch biyopsileri ile birlikte kültürlendi. Hücre kültürü eklerinin kullanılması, cildin hava-sıvı arayüzünde kültürlenmesini sağlayarak topikal madde maruziyetine izin verir. Mikrobiyoreaktör sistemi, bu kokültürleri fizyolojik sıvı akışına yakın ve hacim-sıvı oranlarında destekleyerek stabil ve organotipik kültür koşulları sağlayabilir. Uzun süreli kültürlerin olasılığı, maddelere tekrar tekrar maruz kalmayı sağlar. Ayrıca, insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri kullanılarak mikroakışkan kanal devresinin vaskülarizasyonu, fizyolojik olarak daha uygun bir vasküler model verir.

Giriş

Ilaç gelişimi için mevcut tek tabaka veya süspansiyon hücre kültürü deneyleri, insan hücre mikro-taklit etmek ve bu nedenle, hızlı bir farklılaşmanın giderilmesi ve primer insan hücre kültürleri içinde fonksiyon kaybına yol başarısız kalmaktadır. Yüksek fizyolojik alaka ile Doku modelleri klinik çalışmalarda bunları kabul önce bileşiklerin etkinliğini ve güvenilirliğini tahmin etmek gereklidir. Son zamanlarda, in vitro hücre kültürü teknikleri standart in vivo doku mikroçevresinin taklit amaçlayan, üç-boyutlu, çok-hücreli modellerine doğru iki boyutlu tek tabaka kültürlerinden gelişmiştir. Bu sistemler zaten bileşiklerin ^1,2 eylem tarzının daha doğru tahmin yolunda önemli gelişmeler göstermiştir. Bundan başka, hücrelerin yüksek özel ihtiyaçları için, in vitro kültür koşulları adapte özellikle tercih edilir.

In vitro koşullarda altında standart, önemli cul çeşitligenellikle hücreleri üzerinde etki gibi besin ve oksijen beslemesi, biriken ürünlerinin ayrılması, ve mekanik bir güç olarak Ture parametreleri, bir çok durumda iyice kontrol edilemez. Birçok organ maddeler ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu fizyolojik ilgili gradyanlarını sahip. Ancak, bu son derece düzenlenir ve optimize edilmiş koşullar son derece istikrarsız ortama açan ve hücresel gelişimini ³ sınırlayıcı, in vitro koşullarda dokuların etrafında kontrol edilemeyen difüzyon geçişlerini açık muhalefet vardır. Böylece, istikrarlı ve in vitro koşullarda özellikle daha ölçülebilir uzun süre boyunca canlı ve farklılaşmış hücrelerin tutmak için gereklidir. Orta bileşenler düzenli kaldırılır ve ikame edilmiş perfüze sistemler, genellikle dokuların doğrudan çevreleyen ilgili statik kültürler daha karakterize ve kontrol edilebilir. Statik şartlar, hücre sekresyon difüzyon geçişlerini ve kültür ortamı besin altındakültür hücreleri ³ çevreleyen olabilir. Dokuların etrafında Tanıtımı iyi karakterize orta akım hızları hücre salgıları perfüzyon yoluyla zengin ortamla karıştırmak için izin verir. Bu istikrarlı hücresel fenotip sağlanması ve bütün tahlil süresi ⁴ boyunca enzim ifade metabolize, tanımlanan hücresel mikroçevrelerde üretilmesini sağlar.

Çoklu organ çip (MOK) son gelişmeler sistemleri test sırasında gerekli maddenin azaltılmış miktarda açan, etrafında mikro biyoreaktörlerin küçük, orta ve hücre kütlesi gereksinimleri ile dokulara mühendislik kontrollü orta akış faydalarını birleştirir tabanlı. Doku kültürü için çok sayıda mikro-akışkan sistemler şu ana kadar ^5,6 tarif edilmiştir. Bu sistemler içinde Doku-to-akışkan oranları fizyolojik ilgili hücresel karışma taklit bir özellikle önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, bu tür dış pompa ve rezervuar medya kullanımı gibi teknik sınırlamalar için, inciÇoğu sistemde e genel dolaşan medya hacmi doku hacimleri ile karşılaştırıldığında çok büyük. Shuler ark. grup hücre kültürü bölmeleri içinde ve in vivo ilgili doku-to-sıvı oranları ^7,8 maddelerin uygun ikamet sürelerini sağlayan bir sistem geliştirmek için ilk idi. Bu aynı zamanda "diğer dokular" bölme temsil eden 96 oyuklu plakaya aşağı doğru, dış hazne ölçeklendirme ile elde edilmiştir. Bizim MOK platformu içinde dolaşan medya sesini en aza indirmek için, harici medya devreler için ihtiyacı ortadan kaldırarak, peristaltik on-chip mikropompayı entegre. Bu mikropompa medya akım hızları ve kayma gerilmesi oranları ⁹ seçilebilir sayıda sistemi çalıştırmak mümkün. 500 um genişliğinde ve 100 um yüksekliği bir mikroakışkan kanal sistemi, her bir 96-çukurlu plaka tek bir kuyunun boyutu olan iki standart doku kültürü boşluk birbirlerine bağlar. Endüstri standardı plaka boyutları bağlılıks transwell formatında üretilen mevcut doku modelleri entegrasyonunu sağlar. Ayrıca, Transwell hücre kültürü ekler dikey konumu sadece doğrudan sıvı akışına maruz olmayan doku modelleri ekimi sağlayan, ayarlanabilir, ama aynı zamanda yukarı kaldırdı ve altta yatan akım korumalı olabilir. Benzer şekilde, hava-sıvı arayüz kültürleri bu sistem ile kullanılmak için uygun bulunmaktadır.

MOC platformu bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka 2 mm yüksekliğinde ve sürekli sıvı-geçirmez mikroakışkan devre oluşturmak üzere düşük basınçlı bir plazma oksidasyonu ile bağlandıkları 75 x 25 ^mm2 bir ayak izi, bir cam mikroskop lamı ile imal edilir. İlgili kanalları ve hücre kültürü bölmeleri içeren PDMS katmanı standart yumuşak litografi ve çoğaltma ⁹ kalıp üretilir. Bu çalışma esnasında kullanılan MOC mikrofluidik tasarım, her iki hücre c tutarak, çip başına iki ayrı mikroakışkan devrelerin oluşuyordu100 um yüksek bir kanal sistemi ile birbirine ulture bölmeleri. Bu bir çoklu organ çip kullanan iki ayrı iki doku cocultures performansını izin. Pompa frekansları 40 ul / dk arasında orta akış oranlarını elde etmek üzere ayarlandı.

Bu iki doku MOC tasarımı fizyolojik akış koşullarında kombine medya devresinde olsa, ayrı kültür alanlarda bir karaciğer sfero ve cilt punch biyopsi kokültürü yeteneği sağladı. Homojen sferoidler oluşturmak üzere 1: Ayrılmış HepaRG hücreleri 24 oranında insan hepatik yıldız şeklinde hücreler (HHSteC) ile bir araya toplanır edildi. Olsa bile, hepatosit yaklaşık iki kat sayısı, in vivo duruma göre kullanıldı, önceki deneylerde ¹⁰ de görüldüğü gibi, bu oran, en uygun olduğu bulunmuştur. Böylece deri topik madde maruz kalmasını sağlayarak, bir Transwell hücre kültür kabı içinde bir hava-sıvı ara yüzeyinde yetiştirildi. Bu doku modelleri 28 gün boyunca birlikte yetiştirilmiş edildiMOC olarak ays bu sistemin kapsamlılığını göstermek için. Ayrıca, cips mikroakışkan kanal devresi tamamen daha yakın damar sistemini simüle etmek için, insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) ile kaplandı.

Protokol

NOT: İnsan çocuk sünnet rutin sünnet sonrası bir çocuk cerrahiden, ilgili yasalara uygun olarak, aydınlatılmış onam ve etik onayı (Etik Komitesi Charite Üniversitesi Tıp Berlin, Almanya) ile elde edilmiştir.

MOC içinde Yetiştirme Doku Benzerleri 1. Üretim

1. Karaciğer sferoidler oluşturmak için açılan plakaları asılı HepaRG ve HHSteC agrega.
   1. , Birleşmiş ortamın farklılaşmış tek tabaka kültürleri çıkarın ⁽² 75 cm) hücre kültürü şişelerinde büyütülmüştür HepaRG hücrelerinin tripsinizasyon elde etmek için, iki kez PBS ile yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C'de 3 ila 5 dakika boyunca inkübe ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun.
   2. 5 dakika boyunca 150 x g'de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücre sayımı Santrifüj HepaRG hücreleri. Hücre canlılığı>% 90 olmalıdır.
   3. Içinde, HHSteC hücrelerinin trypsinization elde tek tabakalı kültürlerden gelen orta kaldırmak, PBS ile iki kez yıkayın ve% 0.05 tripsin / EDTA 3 ml eklemek için sipariş. 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun.
   4. Santrifüj 5 dakika boyunca 150 x g'de, süpernatant kaldırmak HepaRG hücre kültürü ortamı, 1 ml hücre pelletini ve hücrelerin sayısı en HHSteC hücreleri.
   5. 24 bir oranda HepaRG ve HHSteC Birleştir: 1 HepaRG hücre kültür ortamı içinde. Bunu yapmak için, HepaRG hücre kültür ortamı içinde hücre süspansiyonları seyreltilmesiyle hücre sayıları ayarlayın ve 4.8 x 10 ⁶ hücre / mL HepaRG hücreleri 1 x 10 ⁵ hücre / mi HHSteC ekleyin. Dikkatle karıştırın.
   6. Asılı damla ve alıcı plaka PBS 2 ml ilave etmek suretiyle, bir asılı bırakma plakası hazırlayın.
   7. Pipet Asılı damla plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 20 ul. Her zaman yaklaşık% 10 daha fazla asılı bazı büyüklükler Duri kaybolur gibi, agrega almak için ihtiyacınız olandan damla hazırlamakprosedür ng. Dikkatlice 37 ° C inkübatör plaka koyun. Küresel şekiller oluşturmak için 48 saat bekleyin.
   8. Sferoidler almak için, geniş uç sonları ile pipet uçları kullanın veya yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril bir bıçakla 1 ml pipet ipuçları ipuçları kesmek için emin olun. Onları aksatmadan sferoidler işlemek için bu pipet ipuçlarını kullanın.
   9. Arka arkaya, bir pipet kullanılarak Asılı damla plakasının deliklerinin üstüne ortam 1 ml ilave etmek suretiyle asılı bırakma plakası dikkatle sferoidler yıkayın. Tüm sferoidler düşmüş kadar plaka yıkayın. Küresel şekiller hafif disk şeklinde 300 um ila 400 orta çap ve bu noktada 200 ila 300 arasında bir yüksekliğe sahip bulunmaktadır.
   10. Alıcı plakasındaki sferoitleri toplayın ve iyi hazırlanmış pipet ipuçlarını kullanarak başına 20 sferoitlerin maksimum 24-kuyu, ultra-düşük bağlanma plakaları aktarabilirsiniz. 0.5 ml her bir ortam hacimleri ayarlayın. Ino 20 agrega kullanarakin vivo hücre sayıları ile ilgili olarak 1 / 100.000 minyatür oranını elde etmek için bir MOK devre hesaplanmalıdır.
   11. MOC de kullanılana kadar _CO2 37 ° C'de inkübe edin sferoidler ve% 5. Karşılaştırılabilirliği sağlamak için kullanmadan önce sferoitlerin daha uzun üç gün saklamayın. Homojen sferoidler almak için ultra-düşük bağlanma plakalar, en az bir gün için agrega geliştirin.
2. Cilt dokusu eşdeğerleri oluşturmak için iki yaklaşımdan birini takip: punch biyopsi (1.2.1) veya hazır in vitro doku modelleri (1.3.1) 'de kullanılması kullanımı.
   1. Bir sonraki kullanıma kadar steril koşullar altında, 96-gözlü hücre kültür uçlar ve deposu hazırlamak için dirsek altında bir akkor bıçakla transwells kesin.
   2. 30 saniye için% 80 etanol içinde sünnet örnekleri sterilize ve açık halka kesti. Numuneler 2 mm arasında bir ortalama bir yüksekliğe sahip olmalıdır.
   3. Eşit miniaturiza elde etmek için 4.5 mm çapında biyopsi kesmek için bir biyopsi yumruk kullanınkaraciğer ve cilt hem de siyon oranı. Forseps ile ekler Transwell hazırlanan 96-kuyuya biyopsi yükleyin. Epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde biyopsi konumuna dikkat edin.
   4. Talep hücre kültürü MOC de kullanılana kadar HepaRG hücre kültür ortamı ve mağaza 37 ° C'de ve% 5 _CO2 içeren bir alıcı plaka biyopsileri olan ekler. 3 saat kadar 2'den değil mağaza örnekleri daha uzun yapın.
3. MOK'ye içine, çeşitli tedarikçilerden satın onlar 96-de Transwell formatta olduğundan emin yapma, hazır vitro deri modellerinde entegre. Satıcı tarafından veya başka bir dokuya sahip bir kokültürünün bir sonraki adımda öngörülür ise, her iki destek dokular en az bir orta kullanmak verilen hücre kültürü ortamı kullanın. Dokuları desteklemek kapasitesi için önce statik deneylerde ilgili asgari orta sınayın.
   1. Tutucu plaka cilt modellerini almak ve bir akkor bıçakla dirsek altında 96-kuyu ekler kesti.
   2. MOC de kullanılana kadar _CO2 37 ° C'de geri alıcı plaka ve deposuna ekler yerleştirin ve% 5. Bir gün daha uzun değil mağaza örnekleri yapın.

2. MOC Fabrikasyon

1. 10 bir oranda PDMS ve sertleştirme maddesi karıştırma: 1 (h / h) ve hava kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika boyunca vakum altında karışımı yerleştirin.
2. Bununla birlikte, 20 dakika süre ile 80 ° C'de silikon kauçuk katkı maddesi ile bir polikarbonat kapak plakasını tedavi.
3. Micropump olan, 500 mikron kalınlığında dört PDMS serbest hücre kültürü bölmeleri ve altı PDMS membranlar, oluşturmak için kapak plakası ilgili deliklere teflon Vidaları yerleştirin.
4. İki mikrovasküler devrelerin ana kalıp hazırlanan kapak plakasını takın ve gazı alınmış PDMS enjekte. Sisteme hava kabarcıkları entegre dikkat edin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, cihazı eğerek bunları kaldırmak için çalışın.
5. PDMS tabakasını sertleştirmek için 60 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edin sistemi.
6. Master kalıp ve cihazdan teflon vidaları çıkarın ve düşük basınçlı plazma oksidasyonu kullanarak 75 x 25 mm ² kaplayan bir cam slayt PDMS katmanı bağlamak.
7. Kapak plaka dört hücre kültürü bölmelerine özel iplik MOC adaptörleri Vida.
8. Kadın Luer x ¼-28 erkek adaptörleri kültür ortamı içeren şırınga bağlayın ve onlara kapak plaka MOK adaptörleri vida.
9. Tekrar tekrar aşağı iterek ve şırıngalar pistonları yukarı çekerek mikroakışkan devreye orta enjekte edilir.
10. Mikroskop altında orta kanallarda doğru doldurulmasını kontrol edin.

MOC 3. endotelizasyon

1. Endotelial hücre büyüme ortamı ile MOC, gömme her MOC devre endothelializing ve _CO2 37 ° C'de üç gün boyunca statik inkübe ve% 5 önce.
   1. Bir etanol kullanılarak MOKSL silme sterilize bir laminer akış tezgah altına yerleştirin. Benn Ayrıca, forseps iki çift ve bir sonraki kullanım için iki altıgen tuşları sterilize.
   2. Altıgen tuşlarını kullanarak MOC doku kültürü bölmesinin kapaklarını gevşetin ve forseps kullanarak kapaklarını çıkarın. Orta yerleştirdikten sonra, aynı şekilde Kendi yaptığım şeyler için geri vidalı kapakları.
2. Insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) olarak tripsinizasyon elde etmek için, tek tabakalı kültürleri orta kaldırmak PBS ile iki kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA, 3 ml ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir ve tripsin inhibitör 6 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun.
3. Santrifüj HDMEC 5 dakika boyunca 220 x g, kaldırma süpernatan, endotel hücre büyüme ortamı, 1 ml hücre topağı tekrar süspansiyon ve hücreleri sayın. Hücre canlılığı>% 90 olmalıdır.
4. Endotelial hücre büyüme ortamı ile seyreltilmesi, 2 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu içinde hücre sayısını ayarlama ve bunun 250 ul transfer1 ml şırınga. Bütün organları için 1 / 100.000 minyatür oranını korumak için MOC hücrelerin bu konsantrasyon uygulayın.
5. Bir kadın Luer x ¼-28 erkek adaptör şırınga bağlayın, bu uydurma dışında havayı dışarı atmak, ve özel bir iplik MOC adaptörü vida. Her MOK devrenin iki bölmeden birine adaptörünü bağlayın.
6. MOC devresinin ikinci bölmeye aynı şekilde boş bir enjektörü.
7. Ardışık şekilde birkaç kez aşağı iterek ve iki şırınga pistonunu yukarı çekerek eşit hücreleri enjekte edilir. Mikroskop altında hücre infüzyonu kontrol edin.
8. Hücreler kanal duvarlarına yapışmasının sağlanması için 3 saat boyunca statik koşullar altında _CO2, 37 ° C'de inkübe edin MOC ve% 5.
9. , Inkübatör çipi çıkartın bir laminer akış tezgah altına yerleştirin ve özel iplik MOC hücre kültürü odaları ile şırınga ve MOK adaptörleri değiştirin.
10. Bir com taze orta 400 ul ekleyinHer MOK devre bölmesindeki ve hidrostatik basınç kanallardan yıkayın edelim. Daha sonra, taze ortam 300 ul, her iki bölme içinde orta yerine.
11. 3.1.2 tarif edildiği gibi, kapaklar kullanılarak bölmeleri kapatın.
12. Pompa kontrol ünitesine çip takın. 0.475 Hz frekansında pompalama hızını ayarlamak ve _CO2 37 ° C'de çip yetiştirmek ve% 5.
13. Her MOK bölmenin orta iki gün her biri değiştirin ve ışık mikroskobu ile hücre morfolojisi izlemek.

Chip 4. Yükleme

1. Laminer akış tezgah altında MOC yerleştirin ve adım 3.1.2 açıklandığı gibi, açın.
2. Doku kültürü bölmelerden Ortamı çıkarın ve taze HepaRG hücre kültür ortamının 300 ul ile değiştirin.
3. Geniş açılması ile pipet uçları kullanarak her MOK devrenin bir doku kültürü bölmesine 20 önceden sferoitleri aktarın (bkz adımları 1.1.8 / 9). C kapatınap forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak.
4. Forseps kullanarak her MOK devrenin kalan doku kültürü bölmesine cilt eşdeğer içeren transfer 96-kuyu hücre kültürü ekler. Cilt eşdeğer zarın altındaki kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bunu yapmak için, bir hafif eğik açıyla transwells eklemek ve yavaşça aşağı doğru itin. Transwell çevresinde aşırı orta çıkarın bir pipet ile aşağıdan yukarıya itilir.
5. Forseps ve altıgen tuşlarını kullanarak kapağını kapatın.

5. Pompa Kontrol Birimine Chip Bağlama

1. Değerlere kontrol ünitelerinde Set operasyonel parametreler istenen. 0'dan 8.000 mbar, 0'dan -800 mbar vakum ve 0.24 2.4 Hz frekans pompalama hava basıncını değiştirin. Saat yönünde ya da saat yönünün tersine pompalama yönünü ayarlayın.
2. Laminer akış tezgah altından MOK içeren doku benzerleri çıkarın ve pompa kontrol birimlerine bağlayın.
3. Numerat ardındantüpler iyon MOK'ye üzerindeki ilgili bağlantı parçaları hava basıncı tüpünü yerleştirin.
4. 37 ° C ısı ve çip enkübatör dışında çip yetiştirmek için MOC destek kullanarak canlı doku görüntüleme durumunda, 37 ° C'de MOC yetiştirmek ve% 5 _CO2, bir kuluçka makinesi içinde ya da. Standart mikroskop altında MOC hücreleri yetiştirmek için ısıtılmış destek kullanın.

6. Maddeler Medya Değişimleri, Örnekleme Medya ve Pozlama Sahne

1. Dokusunda kültür ve hücrelerin metabolik aktivitesinin türü dikkate alınarak, her gün veya her gün rutin medya değişimi gerçekleştirin.
   1. Inkübatör Gider Al ve medya akış oranlarını kontrol ve kirlenme kontrol etmek için mikroskop altında gözlemlemek.
   2. Hava basıncı hortumu çıkararak pompa kontrol ünitesinden MOC ayırın. Etanol mendil kullanarak MOC sterilize ve laminer akış tezgah altına koymak.
   3. Doku kültürü comp açmaAşama 3.1.2 tarif edildiği gibi, karaciğer kürecikler içeren artment.
   4. Küremsilerin bozmadan, bir pipet kullanılarak bölmesinden 200 ul kadar çıkarın ve derin-yuvalı plakanın bir boş kuyudaki ortam saklayın. Doğrudan ortam numunesi analiz veya derin oyuklu plaka kapatmak ve daha fazla analiz için -80 ° C'de ortam numuneleri muhafaza.
   5. 250 ul taze bir hücre kültürü ortamı ile MOC ortamını yerine yerleştirin ve kapağı kapatın. nedeniyle sistemin kapatırken çipin üzerinden sızıntı az miktarda ortam çıkarıldı ve kaybının yerini tutmaktadır ikame miktarındaki farklılık.
   6. Doku devamlılığı için denetlemek için bu noktada deri eşdeğerleri tutan doku kültürü bölmesinin kapağını açın. Sisteme giren hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Kapağı kapatın.
   7. 5.3 adım ve bir kuluçka makinesi içinde MOC yerleştirmek için uygun MOC pompa kontrol ünitesinin boru bağlayın.

7. Günlük Medya Örnekleri analiz ve gerçekleştirin On-line Analizi

1. On-line canlı hücre görüntüleme veya çevrimdışı kullanarak, günlük medya örnekleri analiz edilerek doku kültürü performansını analiz. Standart rutin enzimatik tahliller (örn laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesi) veya ELISA (örn albümin konsantrasyonu) tarafından ikincisi gerçekleştirin. Bir online analiz aşağıda açıklanmıştır.
2. (Içerisinde seyreltilmiş 6.1.1 6.1.4 adımları tarif edildiği gibi, endotelize MOC ortamını çıkarın ve 10 ug 200 ul her iki doku kültürü bölümlerinde / ml fluorofor asetile konjuge düşük-yoğunluklu lipoprotein (LDL) çözeltisi yerine Hücre kültür ortamı).
3. Kapaklar kapatın. 5.3 aşamasına göre, pompa kontrol birimine MOC bağlayın ve mikroakışkan devre içerisinde eşit bir şekilde, solüsyonun dağıtımı için 0.475 Hz 30 dakika için pompa.
4. Pompalama durdurun ve 37 ° C'de 3.5 saat ve% 5 CO ₂ için statik MOC kuluçkaya yatmaktadır.
5. Benzer tO, 7.2 adım, her iki bölme ile ilgili asetillenmiş LDL çözeltisi kaldırmak ve iki bölmesinden biri içinde taze ortam 400 ul ile değiştirin.
6. 3 ila 5 dk hidrostatik basınç mikroakışkan kanal devresi aracılığıyla orta sürücü izin için bekleyin.
7. Taze ortam 300 ul akması ve aynı zamanda taze ortam 300 ul ikinci doku kültürü bölmesini doldurmak olan orta değiştirin.
8. Adım 3.1.2 göre, MOC kapatın. Flöresanlı bir mikroskop altında koyun ve hücre büyümesini ve canlılığını izleyin.
9. Ekimi devam etmek için geri inkübatör lekeli MOC yerleştirin. Her aşağıdaki ortam değiştirme ile hücrelerin dışarı sızdıran leke çıkarın.

8. MOC gelen doku Eşdeğer almak ve Bitiş noktası Analizleri gerçekleştirin

1. Son nokta analizleri için deney sonunda MOC doku eşdeğerleri alın.
   1. Karaciğer ve cilt e almak içinadımlar 6.1.4 için 6.1.1 de açıklandığı gibi MOC gelen quivalents, her doku kültürü bölmesindeki ortamı çıkarın.
   2. Forseps kullanılarak MOC cildi içeren 96 gözlü hücre kültür ekleri çıkarın. Forseps ile bir tarafta o sürükleyici ve aşağı doğru çekerek ekleme dikkatle zarı soyulabilir. Bu noktada cilt eşdeğer kaybetmek değil dikkat edin.
   3. Cryo-gömme bileşik cilt eşdeğer tutan membran Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C'de saklayın.
2. Kesim pipet uçları kullanarak onları pipetleme doku kültürü bölmesinden benzer karaciğer eşdeğerleri çıkarın (adım 1.1.8 / 9).
   1. Cryo-gömme bileşik karaciğer sferoidlerinden gömün. Çok fazla sıvı aktarmak ve bir pipet ile herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için dikkat edin. Gömme bileşik üzerine sferoitleri yerleştirerek ve orta çıkardıktan sonra, bunları tam olarak çevrelemek için sferoitlerin üst üzerine daha cryo bileşik ekleyin.
   2. Karaciğer benzerleri Freeze ve daha fazla analiz kadar -80 ° C'de saklayın.
3. Daha önceki protokollarda ^10'da tarif edildiği gibi, doku-spesifik belirteçler 8 um bölüm ve boyama için kriyo-mikrotom doku benzeri kesilerek nokta analiz.

Sonuçlar

Standart in vitro doku kültürleri dokulara oksijen ve besin kaynağı difüzyon sınırlama, statik koşullar altında gerçekleştirilir. Gelişmiş tedarik özelliklerini gösteren akışkan sistemler, genellikle doku oranları olmayan fizyolojik yüksek orta sahip, onların büyük orta gereksinimleri tarafından engellenmektedir. Böylece, metabolitler seyreltilmiş ve hücreler çevrelerini kondisyon mümkün değildir. Bu çalışmada sunulan MOC mikroakışkan kanal sistemi, iki ayrı doku kültürü bölmeleri, bir standart 96 oyuklu plaka tek bir oyuk birer çift bağlar. sistem ve çip üzerinde pompanın entegrasyon küçük ölçekli sistemi sadece 200-800 ul ortam hacimleri de çalışmasına izin verir. 1-31: Bu 8 doku oranı toplam sistemik ortama karşılık gelen 1, sırasıyla, (yaklaşık 26 ul toplam doku hacmine sahip), karaciğer ve deri dokusu alt kültürler için. Bir adam 7 ağırlığında toplam ekstra-hücresel sıvı hacmiIntercapillary sıvı hacmi 1 doku oranında fizyolojik hücre dışı sıvı yol açan, 5.1 L, ki bunun 3 kg, 14.6 L: 4. Bu nedenle, MOK bütün dolaşım sistemi medyanın miktarı fizyolojik duruma göre hala daha büyüktür; ve henüz bu çoklu organ sistemleri ⁵ için bugüne kadar bildirilen doku oranı en küçük medyayı temsil eder. Endüstri standardı doku kültürü formatları korunur gibi, araştırmacılar ortak bir sıvı akışı içinde mevcut ve zaten valide statik doku modelleri birleştirmek mümkün. 1 olası MOK tek doku veya çok doku cocultures deneysel bir set-up şematik göstermektedir. Birincil doku biyopsisi ve in vitro olarak hücre kuşakları ya da birincil hücreler doku benzeri 96 gözlü hücre kültür ekleri kullanılarak ya da ekili ya da doku kültürü bölmelere doğrudan yerleştirilmesiyle edilebilir -generated. Hücre kültürü bölmeleri birbirine kanal sistemi sadece 100 μ olduğu gibim yüksekliğinde, bu boyutları aşan doku kültürü benzerleri bölmeleri içinde muhafaza edilecektir. Primer HDMECs ile MOK devresinin endotelizasyonunun biyolojik damar yapısını sağlayarak ileriye daha fizyolojik kültür koşulları bir adım daha sağlar.

Şekil 1:. MOK kültürlerin şematik gösterimi Doku benzerleri MOC inoküle ve dinamik koşullar altında tek kültürleri veya cocultures olarak yetiştirilen, standart in vitro koşullarda hazırlanır. Günlük medya örnekleri ve uç nokta analizleri yapılmaktadır. Pompayı sürücü Hava basıncı yukarıdan MOC bağlı üç mavi tüpler aracılığıyla uygulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, endotelizasyon protokol izlenerek, mikroakışkan kanal devresinin bir konfluent HDMEC kapsamı, dinamik kültürü dört gün içinde elde edilir. Hücreler, hali hazırda MOC kanal duvarlarına bağlı konfluent tek tabaka oluşturmak ve kesme boyunca uzunlamasına stres (Şekil 2B). Daha önce rapor edildiği ^{gibi, 9} Ayrıca hücreler, kanal tüm çevresini kaplar. Endotel morfoloji daha başka bir değişiklik kültür sonuna kadar ekimi dört gün sonra gözlenmiştir.

Şekil 2:. Endotelize MOC kanal insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (HDMEC) mikroakışkan devresinde bir konfluent tek tabaka oluşturulmuştur. Hücreler MOK kültür 23 gün sonra asetillenmiş LDL ile boyandı. (A), bütün m,icrovascular devre kesme stresi boyunca uzatılmış hücreleri ve (B) 'hücreleri ile kaplandı. Ölçek çubukları: (A), 1.000 mm ve (B) = 100 um.

Bir başka deneyde, tutarlı bir disk şeklinde karaciğer hücre sferoidler Bu model sistemi, daha önce, ilaç metabolizması için uygun olarak bildirildiği gibi, asılı damla kültür iki gün boyunca HepaRG ve HHSteC oluşan ¹¹ çalışmalar ^- 13'de belirtilmiştir. Gösterim amacıyla, her bir MOC devrenin bir doku kültürü bölmesi 96 oyuklu hücre kültürü ekler 20 küremsiler ile tohumlanmış ve dokuların olmayan endotelize MOKSL kullanarak dinamik koşullar altında 14 gün boyunca yetiştirilmiştir. Agrega veya birincil madde miktarı, herhangi bir sayıda, doğrudan bölmeler içine ya da hücre kültürü kalıpları kullanılarak ya da entegre edilebilir. MOC gelen alma sonrası sferoitlerin immunofluorescent boyama li için güçlü, homojen ifadesini gösterirver tipik sitokeratin 18/08 ve faz I enzimleri sitokrom P450 3A4 ve 7A1 metabolize (Şekil 3A ve 3B). Kanalikülde taşıyıcı çoklu ilaç direnci proteini 2 boyanması (MRP-2) bir polarize fenotip ve ilkel safra Kanalikülleri benzeri ağların varlığını (Şekil 3C) saptandı.

Şekil 3 :. MOC 14 gün kültive MOC. Karaciğer agrega insan yapay karaciğer mikro-dokuların yetiştirme (A), sitokeratin 18/08 (kırmızı) ve (B), sitokrom P450 3A4 (kırmızı) ve 7A1 (yeşil) için boyandı. Kanalikülde taşıyıcı MRP-2 (yeşil) (C) Anlatım, mavi nükleer boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron.

Albumin üretim karaciğer doku kültürlerinin temel bir ön koşuldur gibi, arı vardırn MOC karaciğer-tipik aktivitesini izlemek için seçti. Albümin üretimi için günlük ortam numuneleri analiz statik kültürleri (Şekil 4) ve literatürde ^11'de bildirilen değerlerle karşılaştırıldığında MOC kültürlerde üretim hızında önemli bir artış göstermektedir. albümin sentezi oranındaki artışın MOC kültürlerde artan oksijen ve besin kaynağına bağlı olabilir. Bu nedenle, MOC, albümin üretimi gibi karaciğer tipik bir hareketi, arttırıcı, metabolik açıdan aktif bir halde 14 günlük bir kültür dönemi boyunca karaciğer agrega sürdürmek edebilmektedir.

Şekil 4: MOC Ondört gün karaciğer sfero performansı MOC ve statik kültüründe karaciğer tek doku kültürleri Albümin üretim.. Veriler ortalama ± SEM (n = 4).

Che ve Subsystemic tekrarlanan doz toksisite testleriOECD rehberinin tarafından tanımlanan hayvanlarda micals ve kozmetik hayır, maruz kalma 21-28 gün gerektirir. 410 "Doz Dermal toksisitesi Tekrarlanan: 21/28 günlük Çalışması." Uzun süreli cilt karaciğer cocultures düzenleyici gereksinimlere başa kadar 28 gün süreyle burada örneklenmiştir. Bir hava-sıvı arayüzü 96-kuyu hücre kültürü ekler cilt biyopsi yetiştirilmesi daha sonra dermal madde maruziyeti sağlanır. kokültürünün deney, bir araya getirilen ortam devresinde üç doku kokültürünün uygulanabilir ve 28 gün boyunca metabolik olarak aktif tutulabilir olmadığını kanıtlamak için endotelize Kendi yaptığım şeyler için örnek olarak gerçekleştirilir.

Ortam üst sıvı kısımları içinde bir LDH aktivite analizi bundan sonra da yaklaşık 80 U / l (Şekil 5) sabit kaldı kültürün ilk sekiz gün boyunca giderek azalan seviyesi saptandı. Bu, daha sonra zaman noktalarında sistemde yapay ama istikrarlı bir doku ciro gösterir. Karaciğer single üç-doku kokültürü karşılaştırılması-Doku ve karaciğer-endotel kokültürünün deneyleri, bir ölçüde azalmış LDH düzeyi, özellikle deri dahil değil kültürlerde ilk günlerinde, bulunamadı. Deri, tek doku MOC kültürleri ortaya yüksek LDH aktivite ilk süre içinde hücre ölümü (veriler gösterilmemiştir), deri kültür bölmesinde, öncelikle oluştu. Bu cilt delme sonucu biyopsi çevredeki yaralı bölgeye bağlı olabilir.

Şekil 5:. Endotelize MOC içinde endotelize Kendi yaptığım şeyler (MOK Li-Va) ve karaciğer-cilt cocultures karaciğer tek doku kültürlerinde (MOK Li), karaciğer kültürlerin medya Süpernatantları MOK LDH aktivitesinde Onbeş gün doku performansı (MOC Li -Va-Sk). Veriler ortalama ± SEM (n = 4).

28-günlük kültür döneminde, karaciğer sferoidler MOC a altına yapıştırılırnd hücreler komşu sferoitler arasında bir bağlantı oluşturan çok katmanlı, büyümüştür. Bu doku işlevini engel yoktu. Bağışıklık fluorışıması yoluyla Son nokta analizi sitokrom P450 3A4 boyama (Şekil 6A) ile gösterildiği gibi, karaciğer sferoidler MOC ko-kültürü 28 gün sonra hala metabolik olarak aktif olduğunu göstermektedir. Vimentin boyama (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi HHSteC, bütün karaciğer eşdeğer dağıtıldı. Vimentin boyama yoğunluğunda bir artış hücrelerin sferoitlerin üzerinden büyümüş olan alanlarda gözlenebilir. Von Willebrand faktörü (vWF) için boyama endotel hücreleri dokuya derinlemesine nüfuz etmediğini gösterdi, ancak dış hepatositler (Şekil 6C) ile doğrudan hücre-hücre teması vardı.

Statik kontrol boyama ELEVAT gösterdi iken deri biyopsisi İmmünohistokimyası boyama, tenaskin C ve bazal membran (Şekil 6D) kollajen IV bir ifade gösterditenaskin C (Şekil 6E), ed seviyeleri. Tenascin Cı, yara iyileşmesi, iltihap süreçleri ve fibroz sırasında yukarı regüle ettiği gösterilmiştir dinamik kültürler ^14,15 fibrotik statik süreçleri ancak neden göstermektedir.

Stabil hücre canlılığı ve MOC olarak 28 günlük bir birlikte-kültür sonrası dokuların işlevi sistem ortak bir ortam devre üçe kadar dokular bir arada tutmak mümkün olduğunu kanıtlamaktadır. Birincil hücreler, hem de doku modelleri ve biyopsi MOC sisteminde aynı anda yetiştirilebilir.

Şekil 6:. Çoklu doku kültürleri Performans 28 gün boyunca karaciğer benzerleri ve deri biyopsileri bir endotelize MOC ve hücre fonksiyonu kültive (A) Birinci aşama, immün ile gösterilmiştir bir sitokrom P450 enzimleri3A4 karaciğer dokusunda (kırmızı), (B) vimentin (kırmızı), (C) sitokeratin 8/18 (kırmızı) ve vWF (yeşil). Statik koşullar altında MOC veya (E) 'de 28 gün (D) birlikte yetiştirilmiş deri biyopsileri tenaskin c (kırmızı) ve kolajen IV (yeşil), mavi nükleer boyama için boyandı. MOC kültürü 28 gün sonra, deri (F) H & E boyama. Ölçek çubukları: 100 mikron.

Tartışma

Burada anlatılan MOK platformu uzun kültür dönemleri ^10,16 üzerinde dinamik orta akış koşullarında çeşitli kökenlerden dokuları yetiştirilmesi için istikrarlı ve güçlü bir araç temsil eder. Bu örnekte, bir platform birincil hücreler (HDMEC), bir hücre hattından elde edilen doku eşlenik (karaciğer agregalar), bir doku biyopsisi ile daha önce zikredilen bir birlikte-kültür yetiştirmek için kullanıldı. MOK kombine orta devredeki kadar 28 gün süreyle üç-doku kokültürü sürdürmek başardı. Yazarların bilgimize göre, bu biyopsiler, primer hücreler ve hücre çizgileri dahil olmak üzere bir çok doku kokültürünün dört hafta boyunca gerçekleştirilmiştir ilk kez.

Mikroakışkan sistemlerinin başlıca sakıncalarından biri, akışkan devresinin yüzey malzemesine yapışma küçük moleküllerin eğilimidir. Hacim oranında yüzey mikroakışkan sistemlerinde, özellikle de yüksek olduğu için, bu etki daha da belirgin hale gelir ¹⁷ kadar. Burada tanıtılan kanal sabit HDMEC kapsamı, MOK'ye moleküllerin yapışmasını önleyen, biyolojik bir bariyer olarak hareket edebilir. Bundan başka, kan pıhtılaşmasının önlenmesi, tam kan dolaşımı için bir hemocompatible kabı olarak hizmet edebilir. Organ eşdeğer tam bir vaskülarizasyon henüz elde edilmemiştir Ancak, orta ikamesi olarak tam kan kullanımı mümkün değildir. In vitro -generated dokuların damarlanmaya çalışmalarını Mevcut umut verici ve ileri çalışmalar ^18,19 yolunu yönlendirir.

Bu hepatositler in vitro statik iki-boyutlu kültür koşulları altında ²⁰ zamanla karaciğer-özel işlevlerini kaybetme eğilimindedir ki iyi bilinmektedir. Belirli bir ilacın metabolizması üzerinde çalışılacak olan bu tür sitokrom P450 aile olarak metabolize edici enzimlerin, özel bir önem taşımaktadır. Sitokrom P450 3A4, birçok ksenobiyotiklerin biyotransformasyon ile ilişkili bir enzim, ve sitokrom P450 7A warada tutarak 14 gün boyunca karaciğerde eksprese edildiği zaman, içinde safra asidi sentezinde MOC kültürlenmiş agrega yer almaktadır. Bu ilaç metabolizma çalışmaları sağlayan, metabolik açıdan aktif bir fenotip koruma gösterir. Statik kültürleri ile karşılaştırıldığında MOC agregaların yüksek albümin üretim oranı yeterli kültür koşulları için ek bir göstergesidir. ²³ Bununla birlikte, değerler birincil insan hepatosit kültürlerinde ²⁴ olanlar ulaşamadı ^- Bu çalışma sırasında gözlenen albümin üretim oranları ²¹ HepG2 hücreleri de dahil olmak üzere mikroakışkan cips elde daha önce bildirilen değerlerden daha karşılaştırılabilir veya daha yüksek idi. Ayrıca, MOC sistemi, geçici düzeninde, safra ayrı ayrı tutulması için izin vermez. MRP-2 boyama ile gösterildiği gibi toplam polarize ve oluşan safra Kanalikülleri-benzeri yapılarda hücreler. Ancak, bu Kanalikülleri safra toplama bir teknik kanala bağlı değildi. Bu fizyolojik olmayan karışımıKan bölmesi ile safra ing sisteminin gelecekteki yeniden tasarımı ele alınacak vardır.

Akış özelliklerinin ayarlanması özellikle karaciğer gibi kesme stresine karşı hassas dokular, söz konusu olduğunda, çok önemli ²⁵ taşımaktadır. doku tarafından algılanan kesme stresi miktarı iki şekilde değiştirilebilir: İlk olarak, pompa membranlar doğru itmek için kullanılan hava basıncı düşürülebilir, sistemdeki en yüksek kesilme baskısı değerleri düşer. İkinci olarak, doku, hücre dışı matris katman içine gömülü ya da Transwell kültür ekleri kültürlenmiştir edilebilir. İkinci bir gözenekli membran ile altta yatan akım dokuları kalkan. Bu ayarlamalar MOK deney başlamadan önce her organ eşdeğer bireysel bazda yapılması gerekir. 144 atım yüksek, ama yine de fizyolojik, kalp aktivitesi karşılık örneğin 2.4 Hz'lik bir pulsatil operasyonu, at / dak insanlarda, kayma gerilmesi ölçülenmikrovasküler devrenin kanal, yaklaşık 25 din / cm ² ulaşır. Bu kanallar bir endotelizas- içeren deneyler için, bu nedenle, iyi uygulanabilir mikrovasküler ölçek yüksek ucunda bir fizyolojik kesme direncine karşılık gelir ve bir. Sunulan MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni iki organı bölmeleri bağlayan tek bir medya devresi oluşur Ancak, bir pompalama hızı ve kayma gerilmesi oranı tüm sistem için seçilecek olan. Bu nedenle, her bir organın ihtiyaçlarına akış karakteristiklerinin tam bir ayarı, her zaman mümkün değildir.

Ayrıca, bakım ortak ortama hücreleri ayarlayarak alınacak etti. In vitro hücre kültürü için standart olarak hücreler, bir araya getirilen ortam devresinde MOC geliştirilmiştir, bu nedenle hiç bir hücre kültür ortamı, her bir doku modeli için de kullanılabilir. Minimal kombine medya formülasyonu önceden ve t tanımlanması gerekirO hücreleri bu yeni ortama adım adım ayarlanması gerekir. Iki gün için yeni ortama eski% 80 /% 20 bir ayarlama yöntemi, daha sonra% 50 /% 50% 20 /% 80 oranında, ardından ve tam değişimi her zaman elinde kültürlerin makul hücre canlılığı ve fonksiyonelliği yol açtı.

MOK sistemin mevcut mikroakışkan düzeni kadar üç dokuların kokültürü izin verir. Insan vücudunun en azından en önemli on organların bir kokültürünün homeostazını ulaşmak için gereklidir. Bu nedenle, sunulan sistem, belirli doku doku etkileşimleri, ancak bir maddeye gerçek sistemik yanıt tahmin etmek mümkün. Daha fazla Organ boşlukları dahil etmek MOC bir başka gelişme öngörülmektedir. Dahası sistemin çalışmaya geçerlilik referans bileşikler bir dizi kullanılarak gösterilebilir etmektir. Tercihen, (örneğin, troglitazon gibi) klinik deneyler sırasında başarısız olan bileşikler MOC kendi performansı için test edilecektir. Oysa, bu tür karmaşık sistemlerin bir gerçek doğrulama hala b engellemektediry Bu ve benzeri sistemlerin toksikolojik performansı hakkında daha fazla veri toplama fonksiyonel değerlendirme için biyomarkerları ve bitiş noktaları ile ilgili standardizasyon eksikliği, onların güvenilirliğini ve uygulama alanını genişletecek.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HepaRG hücreleri	Biyopredik Uluslararası		farklılaşmamış hücreler
HHSteC	ScienCell Araştırma Laboratuvarları		hücreleri ve tüm kültür takviyeleri
HepaRG Medium	Sigma-Aldrich		William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penisilin 100 &mikro; g/ml streptomisin 5 &mikro; g/ml insan insülini 2 mM L-glutamin 5 x 10-5 M hidrokortizon hemisüksinat
HDMEC Ortamı	PromoCell		Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV2, Ek Paket MV2 ve %1 penisilin-streptomisin
ile Dimetil sülfoksit	Carl Roth		HepaRG ortamına %2 ekleyin
Tripsin/EDTA	Biowest
Tripsin İnhibitörü	Carl Roth
MAXYMum Kurtarma İpuçları	Corning		1,000 & l Pipet Uçları Geniş Delikli
384 Kuyulu Asma Damla Plakası	3D Biomatrix		Perfecta 3D 384 Kuyulu Asılı Damla Plakası
Doku kültürü şişeleri	Corning		75 cm2< / sup
> Ultra düşük bağlantı plakası	Corning		24 kuyulu
Transwell hücre kültürü ekleri	Corning		96 kuyulu birim, 0.4 ve mikro; m gözenek boyutu
Derin kuyu plakaları	Corning		96 kuyulu, 1 ml
Biyopsi yumruğu	Stusche		4.5 mm
Cam mikroskop lamı	Menzel		ayak izi 75 x 25  mm
Polidimetilsiloksan	Dow Corning		Sylgard 184
Silikon kauçuk katkı maddesi	Wacker Chemie		Wacker Primer G790
Hava basıncı için tüpler	SMC Pneumatik GmbH		Polyurethan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISA	Bethyl Laboratuvarları		İnsan Albümini ELISA Kantitasyon Seti
Laktat dehidrojenaz testi	Stanbio Laboratuvarı		LDH Liqui-UV kiti
Alexa Fluor 594 asetillenmiş LDL	Invitrogen		1 mg / ml