Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çekirdek Biyoloji Kavramları öğretmek için Fare Meme Tümör Hücreleri kullanma: Basit Lab Modülü

12.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52528

⸱

18 Haziran 2015

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Bu makalede

Özet

Biyoloji lisans öğrencileri için hayvan hücre kültürünü kullanarak ileri hücresel ve moleküler kavramları araştıran uygun bir laboratuvar modülü açıklanmıştır. Öğrenciler, kemoterapi ajanlarına maruz kalarak bir meme kanseri hücre modelini büyütür, karakterize eder ve manipüle eder. Hücre canlılığı, hem standart hem de yeni bir yöntem kullanılarak hücre sayımı yoluyla test edilir.

Özet

Lisans biyoloji öğrencilerinin biyomedikal, lisansüstü ve profesyonel programlara veya bilimdeki kariyerlere hazırlanırken çeşitli hücresel ve moleküler biyoloji kavram ve tekniklerini öğrenmeleri, anlamaları ve uygulamaları gerekmektedir. Bunu ele almak için, hayvan hücre kültürü tekniklerinin uygulanması yoluyla hücre bölünmesi, hücresel iletişim ve kanser kavramlarını öğretmek için basit bir laboratuvar modülü tasarlandı. Burada fare meme tümörü (MMT) hücre hattı, meme kanserini modellemek için kullanılır. Öğrenciler, bu hayvan hücrelerini kültürde büyütmeyi ve karakterize etmeyi öğrenir ve geleneksel ve geleneksel olmayan kemoterapi ajanlarının hücre çoğalması üzerindeki etkilerini test eder. Spesifik olarak, öğrenciler hücrelerin kaplanması ve büyütülmesi için en uygun hücre konsantrasyonunu belirler, ilaç çözeltilerinin nasıl hazırlanacağını ve seyreltileceğini öğrenir, antiproliferatif ajanların en iyi dozajını ve tedavi süresi seyrini belirler ve çeşitli tedavilere yanıt olarak hücre ölümü oranını belirler. Modül, hem bir hemositometre kullanan standart bir hücre sayma tekniği hem de mikroskopi yazılımı kullanan yeni bir hücre sayma yöntemi kullanır. Deneysel prosedür, öğrenciler homeopatik ajanların ve reçetesiz satılan ilaçların test edilmesi de dahil olmak üzere protokolün kritik adımlarını değiştirebildikleri için açık uçlu sorgulamaya katkıda bulunur. Kısacası, bu laboratuvar modülü, öğrencilerin hücre döngüsü, hücresel sinyal yolları, kanser ve tedavi yöntemleri hakkındaki bilgilerini uygulamak için bilimsel süreci kullanmalarını gerektirirken, hücre kültürü ve deneysel verilerin analizi de dahil olmak üzere bir dizi laboratuvar becerisi geliştirirken lisans sınıfında rutin olarak öğretilmez.

Giriş

Genellikle lisans genel biyoloji derslerinde, hücre döngüsü düzenlenmesi ve kanser konuları değindi ama bu derslerden içeriğin genişliği derinliği için çok az zaman bırakır, çünkü ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Buna ek olarak, lisans biyoloji öğrenciler genellikle hayvan hücre kültürü ile ilişkili gelişmiş teknikler maruz değildir. Uygulanması ve öğrendiklerini analiz ederken öğrencilerin bu kavramları daha derin bir anlayış geliştirmelerine yardımcı bir laboratuvar faaliyeti laboratuvar faaliyeti 1 uzatılmış Araştırma Walter Reed Ordu Enstitüsü (WRAIR) bir modifikasyonu olarak geliştirilmiştir. Laboratuar modülü olarak anormal hücre sinyalizasyon yolları büyüyen bir kanser hücresi modeli karakterize geliştirilmesi ve hücre sayımı yürütme yöntemleri, anti-proliferatif ajanlar ile hücrelerin tedavisi için uygun bir zaman ve dozajların oluşturulması ve tanımlanması içeren bir adım adım, deneysel strateji kullanır . Deney da açık veriyor-ended soruşturma.

Bu etkinlik için gereken teknikleri çoğu tipik biyoloji öğretim laboratuarda gerçekleştirilebilir. aktivitesi, fare meme tümörü (MMT) hücre çizgisinin morfolojisi ve büyüme hızı, insan göğüs kanseri 2 için bir model karakterize öğrenciler ile başlar. Meme kanseri nedeniyle nüfusta yaygınlığı, üniversite çağındaki öğrencilere yönelik aşinalık ve mevcut yaygın veri modeli kanseri olarak seçildi. MMT hücre hattı özellikle de karakterize, kolayca elde edilebilir, çünkü seçilen kısa katlama süresi vardır ve büyümek kolaydır edildi. Buna ek olarak, MMT hücreleri estrojene bağlı en kadın, göğüs kanseri ile tutarlı olan bulunmaktadır. Öğrenciler daha sonra kimin etki mekanizması iyi öğrenciler sağlayan çeşitlidir ilaçlar ve tedavilerin uzunluğu belirlendiğine konsantrasyonu kemoterapi ilaçları ile hücrelerin tedavi ederek MMT hücrelerinde anormal hücre sinyal yolları belirlemekhücre bölünmesi oranı üzerinde bu değişkenlerin etkisini değerlendirmek için. Bu etkinlik için anahtar tahlil sadece iki yöntemden birini kullanarak, hücre sayımı gerektiren hücre canlılığı, belirlenmesidir. Her yöntemin güçlü mikroskopi becerileri bağlıdır. Öğrenciler standart, hemositometre yöntemi ve yeni bir fotomikroskopi yöntemini kullanarak hücre canlılığı belirlemek ve önermek. Onların bulgularına dayanarak, teklif ve aktivite değişiklikleri test edin. Öğrenciler daha sonra kendi veri temsil ve hipotez rafine ve yeni deneysel stratejiler hazırlamak için sonuçları yorumlama.

Bu laboratuvar faaliyeti biyolojik bilimlerde bölümünden birinci veya ikinci sınıf düzeyinde öğrenciler için uygundur. Bu, bir ilk yıl genel biyoloji ya da ikinci yıl, moleküler / hücresel biyoloji dersi tamamlanabilir bir haftalık laboratuvar modülü içine yoğunlaşır. Faaliyetin uygun tamamlanması için gerekli becerileri c bir dizi temel aritmetik ve cebir, aşinalık dahilCevher laboratuvar becerileri (örneğin, pipet, çözüm yapımı, steril tekniği) hücre kültürü ve elektronik tablo yazılımı eğitmen bilgisi ile birlikte, veri analizi, temel ışık mikroskobu ve zaman yönetimi. Gereken belirteçleri (örneğin, fare meme tümörü hücreleri, MMT 2), kemoterapi maddeleri kanser için bir hayvan hücre çizgisi modeli, (örneğin, tamoksifen, kurkumin, metformin, ve aspirin), tripan mavi ve hücre kültür ortamı (örneğin, Eagle Minimum Essential Medium , uygun takviyesi (örneğin, donör At ve fetal inek serumu) ile EMEM). (Sınıf II BSC) hemasitometre ve dijital mikroskopi yazılım gerekli aletler ters ışık dijital kamera eki, bilgisayar, 100 mm ve 24 oyuklu doku kültür plakaları, CO2 inkübatöründe (veya eşdeğeri), biyo-güvenlik kabini ile mikroskop bulunmaktadır.

TEAC hayvan hücre kültürü güveniyor belirli laboratuvar faaliyetlerinin iyi örnekler vardırhücre biyolojisi 3 kavramlar hakkında h lisans öğrencisi. Ancak pek çok (örneğin, radyoaktif izotoplar, canlı hayvan dokusu, ileri görüntüleme donanımları 1,4,5), (400 seviye kurs 6 için uygun gibi) oldukça gelişmiş protokolleri tarif kolay erişilebilir olmayan malzemeleri veya teknikleri gerektiren, ya da çok-haftalık veya dönem uzun projelere 6,7 gerektirir. Burada anlatılan laboratuvar aktivite basittir ve ortak laboratuar ekipmanları ile tek bir hafta içinde yapılabilir.

Özetle, bu laboratuar modülü etkin bir tanıtır ya da temel ve ileri laboratuar becerileri, deneysel veri analizi, hayvan hücre kültürü yöntemi ve bilimsel süreç öğretirken hücre döngüsü, hücresel sinyal yolları ve kanser kavramlarını güçlendirmektedir. Laboratuvar modülü basit ve ekonomik erişilebilir ve açık uçlu soruşturma için esneklik ve fırsat hem de sağlar. etkinlik öğrenci yaratıcılığı teşvikBir reçete rehber olarak değil, hareket eden bir şablon deneysel bir strateji sağlayarak. O hatırlayarak gerektirir En önemlisi, etkinlik tatmin Blooms Taksonomi 8 tüm öğrenme alanları, anlayış, uygulanması, analiz etmek, değerlendirmek ve ders kitabı dışında ve bilimsel araştırma dünyasına onları çeken bir süreçte öğrencilere yaparak yaratır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Notlar: Davranış Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde hücreler ve hücre kültürü reaktifleri ile tüm iş (BSC) 9. Biyolojik risk orta düşük poz olarak MMT hücreleri, Biyogüvenlik Seviyesi I olarak sınıflandırılır. Kullanımlar (örneğin, ultraviyole ışık,% 70 etanol aşağı silin) ​​arasında BSC uygun temizleme ve dekontaminasyon prosedürleri uygulayın.

1. MMT hücreleri büyütün

  1. Besin yönünden zengin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) oluşur ortam, 2 mM glütamin ve% 1 antibiyotik / antimikotik 10 ml içeren 10 cm'lik doku kültür tabakları hücreleri (10 birim penisilin büyümek , 100 ug streptomisin, 0.25 mikrogram amfoterisin B). 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 odası içinde hücrelerin kültive edilmesi. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir yoğunlukta Plaka hücreleri (aşama 2'de hücre sayımı bakınız).
  2. Her 48 saat Unl taze ortam ile hücre kültür ortamının yarısı yerineess aksi belirtilmedikçe. Ters faz kontrast ışık mikroskobu ile incelenmesi ile hücre canlılığını ve morfolojisi kontrol edin.
    1. Not ve 100 ° C'de altında büyüklüğü, yapısı, şekli, organizasyon ve tahmini sayısı için hücreleri karakterize - 200X büyütme. Bu yoğunluk, hücreler bir düzlemde yer almalıdır, birbirlerine tepesinde ve yakın topaklaşan değildir. Her hücre bir noktaya geldik ondan genişleyen ince, uzun, dal gibi uzantıları olan kalın, küresel çekirdek oluşur (Şekil 1).
  3. Onlar 7.2 x 10 6 hücre / cm2 hücre yoğunluğu ulaştığınızda hücreleri bölmek. Hücreler 1.8 x 10 6 hücre / cm 2 24 saat başına bir iki katına oranı sergilemektedir. Onlar bölünmüş olan sayısını göstermek için hücreler Passage X (Px) atayın.
    1. Kuşak 3 de (örneğin, üç geçiş noktası, P3 sonra) hasat, sayısı ve 3.6 x 10 6 arasında bir yoğunlukta bir 24 oyuklu doku kültürü plakası üzerine hücreleri plaka hücre / cm2 kadar.
  4. Görünüm hücreleri her gün ve kayıt dijital fotomikrograflarıdır. Not ve hücre morfolojisi (örneğin, boyut, şekil, ışık yansıtıcı özellikler) tarif eder. Düzenli hücrelerin sayımı ve hücre sayısına geçen zamanı ile ilgili hücre iki katına zaman belirleyin.

2. MMT Hücreleri sayın

Not: Hücreler alt kültürleri gerekiyorsa belirlemek için hücreleri sayın, bir deney için kurmak veya hücre canlılığını belirlemek için. Burada sunulan iki yöntem vardır.

  1. Bir hemasitometre kullanımı, standart bir teknik hücreleri saymak için.
    1. Parlak-çizgi hemasitometre, tripan mavi boya, bir bileşiğin ışık mikroskobu, steril bir test tüpleri, pipet ve manuel hücre sayacı bir% 0.2 solüsyon elde edilir.
    2. BSC altında, 10 cm doku kültürü çanağı hücreleri çıkarmak için, bir 10 ml'lik bir pipet kullanın. Hücreler 24 plaka üzerinde yetiştirilen varsa ortamı çıkarmak için 1 ml pipet veya 1000 ul mikropipet kullanın.
    3. , Pipet içine hücre ortamını çizin çanak alt karşı pipet ucu yerleştirin ve plaka üzerinde pipet kaydırırken medya sınırdışı. , Hücreleri çıkarmak yardımcı kümeleri ayırmak ve daha doğru bir hücre sayımı yol 5 kez - 4 tekrarlayın.
    4. Bir 15 ml'lik steril bir tüpe (veya 1 ml mikro santrifüj ya da diğer küçük hacimli tüp) ile sonuçlanan hücre süspansiyonu yerleştirin. Aksi takdirde, orijinal doku kültür plakasına hücrelerin terk / oyuk.
    5. Steril olmayan bir mikro santrifüj ya da diğer küçük hacimli bir tüp içinde: (1 oranında 1) BSC altında, tripan mavisi çözeltisi 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul birleştirir.
      Not: Tripan mavisi, sağlıklı canlı hücreler tarafından emilir değildir hayati leke olduğunu. Hücreler hasarlı veya ölü, tripan mavisi ölü hücreler sayılır sağlayan hücreye girebilirsiniz (aka dışlama yöntemi boya). Canlı hücreler renkte bir aydınlık ve ışık ise nedenle mikroskop altında, ölü hücreler koyu mor görünür.
    6. Tasarlamak5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
    7. Hemasitometre kapak kayma yerleştirin. Oluğa tripan mavi hücre süspansiyonu 10 | il karışımı uygulanır. 200X büyütme - 100 hemasitometre görüntüleyin. Dört köşe ızgara açıktır (Şekil 2).
    8. Her ızgarah alanda toplam hücrelerin karşı (lekesiz) canlı hücrelerin sayısını. Dört ızgaraları ortalama ve hücre / ml elde etmek için 1 x 10 4 ile çarpın.
      1. Çanak başına hücreleri (veya hücre / cm 2) toplam sayısını tahmin. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 istenen yoğunlukta yeni bir doku kültürü plakası, tohum ya plaka üzerinde ya da iyi olarak canlı hücre sayısını belirlemek için kullanmak hücre süspansiyonu doğru hacmi belirlemek için, ya bu numarayı kullanarak.
        Not: Bir hemasitometre kullanımına ek rehberlik, 10 bkz.
  2. Canlı hücreleri saymak için yazılım ve dijital fotoğraf makinesi kullanın.
    1. Bir di ediningital makinesi, eşlik eden program, tripan mavi boya, bir bileşiğin ışık mikroskobu, steril bir test tüpleri, pipet ve bir bilgisayar bir% 0.4 çözeltisi.
      Not: Burada kullanılır Motic Yazılımı ile birlikte A Moticam 2.000 dijital fotoğraf makinesi. Herhangi bir karşılaştırılabilir kamera ve yazılım yeterlidir. Dijital kamera yazılımı (üreticinin protokolüne göre) önceden kalibre edilmiş olduğundan emin olun.
    2. BSC altında, 24 iyi doku kültürü çanak büyüyen MMT hücrelerinden ortamı çıkarmak için 1 ml pipet ya da 1,000 ul mikropipet kullanın. Sonra yavaşça plakaya küçük bir miktar un takviye (yani, EMEM herhangi bir ek olmadan) taze medya (yaklaşık 500 ul) uygulayarak kaldırarak yapışık hücreleri yıkayın. Kuyuya doğrudan% 0.2 tripan mavisi 10 ul uygulayın (BM-EMEM ile 1: 1 seyreltilmesi).
    3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin.
    4. 200X büyütme w - 100 mikroskop altında plaka görüntülei bir dijital kamera takılı. % 2 tripan mavisi ile boyanarak çok karanlık ise plaka katkısız ortam ile yıkanabilir.
    5. Bilgisayar a yazılım açın nd yazılım ayarları sekmesinden kullanılan hedefe kalibre doğrulayın. FOV bir görüntü görünmelidir.
    6. Tedbir sekmesinden Izgara seçin. Kareler bir ızgara yaklaşık genişliği 0.005 cm görünecektir. Her bir karenin alanını doğrulamak için Izgara Bilgisi seçin.
    7. Hücreleri saymak için ızgaranın belirli bir alan seçin (örneğin, 5 kare x 9 kareler). Tedbir sekmesinden Dikdörtgen seçin. Bir kare köşesini tıklayın ve seçim kareler kapsayacak şekilde imleci sürükleyin.
      Not: yeşil bir gölge seçimi ve genişlik, yükseklik, alanı sağlar köşesinde görünecek bir beyaz kutu ve seçilen ızgara bölümünün çevresinin kareler kapsayacak (bakınız Şekil 3).
    8. Viab sayısınıBelirlenen alanda le hücreleri. Mikroskop altında plaka hareket ettirerek aynı kuyuda veya plaka diğer iki yerler için aynı işlemi uygulayın.
    9. Ölçülen alan aynıdır ve büyütme değişmedi emin olun. Alanda yaşayan hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın. Oyuk alanı kullanarak için ızgara tarif alandan yaşayan hücrelerin sayısını tahmin (24 gözlü bir plaka için, bir de, bir 100 mM için alan 2 78.6 cm çanak, 2 cm2'lik bir alana sahip) oyuk (hücre / cm2) olan hücrelerin toplam sayısı.

3. anti-proliferatif Agents ile MMT Hücreler davranın

  1. Seçilen, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ve BSC altında isteğe bağlı bir ilaç, aspirin oluşan çözeltiler hazırlayın.
    1. 27 mM'lik bir stok konsantrasyonu oluşturmak için% 100 etanol içinde kurkumin ve tamoksifen çözündürülür. Unsupplement metformin ve aspirin çözündürülüred ENEM sırasıyla 500 mm ve 15 mM'lik bir stok konsantrasyonu oluşturmak için.
  2. Bir Doz Yanıtı kurun.
    1. 96 saat bir doz tepki eğrisi oluşturmak için değişen konsantrasyonlarda üç, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ve isteğe bağlı bir ilaç (aspirin) ile MMT hücreleri tedavi edin. Başlangıçta yayınlanan raporlar 1,11-16 göre bir konsantrasyon aralığında ve daha sonra yayınlanan daha konsantrasyonları büyük veya daha küçük de tüm ilaçları uygulayın.
      Not: bir doz tepkisi istenen sonuçları üretmek için gerekli olan, bir ilacın minimum konsantrasyonu belirlenir. Burada arzu edilen sonuç, kontrol ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunun bir azalmadır.
      1. Tamoksifen ve kurkumin için, 0.054 mM (1 ul), 0.108 mM (2 ul), 0.162 mM (3 | il) ve 0.216 mm (4 ul), konsantrasyonları (ve karşılık gelen hacimleri) kullanın.
      2. Metformin için, 2 mM konsantrasyonlarda (ve karşılık gelen hacim) (2 ul kullanımı), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 ul) ve 10 mM (10 ul).
      3. Aspirin, 0.030 mM (1 ul), 0.060 mM (2 ul), 0.099 mM (3.3 ul), 0.150 mm (5 ul) ve 0.216 mM (6.7 ul), konsantrasyonları (ve karşılık gelen hacimleri) kullanın.
    2. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir konsantrasyonda, 24 oyuklu bir plaka üzerinde 10 cm'lik bir tabak, MMT hücreleri Böl. Her iki hücre-sayım yöntemleri (Aşama 2), başlangıç ​​hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücrelerin bu yeni 24 kuyu plaka "Gün Bölünmüş" arayın.
    3. 24 saat Hücre sonra kaplama, Aşama 3.2.1 tarif konsantrasyonlarda, çoğalma karşıtı terapötik maddeler, tamoksifen, kurkumin, metformin ve aspirinin her biri, MMT hücreleri tedavi. "Gün 0" olarak bakın.
      1. Her kuyu 500 medya ul, kullanım mikropipetler steril mikropipet ipuçları ve yeni bir ipucu yeni bir kuyu cr önlemek için tedavi her zaman maksimum tutmak gibioss kirlenme. Varlığı% 100 etanol (çözücü kontrolü) yetiştirilen herhangi bir ilaç tedavisi (negatif kontrol) ve hücrelerin yokluğunda yetiştirilen hücreler: İki kontrol grubu olarak kuyu kullanın.
    4. Hücrelerin büyümesine ve hücreler her gün beslenir zaman açıklanan konsantrasyonlarda uyuşturucu yeniden yönetmek 96 saat boyunca (Adım 1.2) (kadar Günü 4) Gün 1 Açık -. Tedavinin 4, mikroskop altında hücreleri gözlemlemek ve kullanma sayısı Adım 2.2 yöntemi (Şekil 4).
    5. Denemeyi en az üç kez tekrarlayın.
    6. Deneyin uzunluğu boyunca, hücre canlılığı ve ilaç dozaj arasındaki ilişkiyi grafik her ilacın optimal konsantrasyonunu belirlemek (bakınız Şekil 5).
  3. Bir Zaman Kursu oluşturulması.
    1. Zaman dilimlerinin değiştirilmesi için sabit bir konsantrasyonda, üç, çoğalma karşıtı terapötik maddeler (tamoksifen, kurkumin ve metformin) ile MMT hücreleri tedavi edin. Optimal konsantrasyon IDENTIF kullanınDoz Tepki deneyler yoluyla ied (Adım 3.2).
      1. 0.216 mM tamoksifen, 0.216 mM kurkumin ve 10 mM metformin: Aşağıdaki konsantrasyonları kullanın.
        Not: Bir ilacın optimum istenilen sonucu elde etmek için bir zaman süreci gerekli süre miktarını belirler. Burada, arzu edilen sonuç, kontrol ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunun bir azalmadır.
    2. 3.6 x 10 6 hücre / cm2 'lik bir konsantrasyonda, 24 oyuklu bir plaka üzerinde 10 cm'lik bir tabak, MMT hücreleri Böl. Her iki hücre-sayım yöntemleri (Aşama 2), başlangıç ​​hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücrelerin bu yeni 24 kuyu plaka "Gün Bölünmüş" arayın.
    3. 24 saat Hücre sonra kaplama, Aşama 3.2'de tanımlanan uygun konsantrasyonlarda, çoğalma karşıtı terapötik maddeler, tamoksifen, kurkumin, metformin ve aspirinin her biri, MMT hücreleri tedavi. "Gün 0" olarak bakın.
      1. Her Yanı sıra, bize medya 500 ul maksimum tutabilirSteril mikropipet ipuçları ve yeni bir ipucu yeni bir kuyu çapraz kontaminasyonu engellemek için tedavi her zaman e mikropipetler.
      2. Varlığı% 100 etanol (çözücü kontrolü) yetiştirilen herhangi bir ilaç tedavisi (negatif kontrol) ve hücrelerin yokluğunda yetiştirilen hücreler: İki kontrol grubu olarak kuyu kullanın.
  4. Hücrelerin büyümesine ve hücreler her gün beslenir seçilen konsantrasyonda ilaçlar yeniden yönetmek (Gün 4 kadar) 96 saat boyunca (Adım 1.2). Gün 1 Açık - Tedavinin 4, mikroskop altında hücrelerin gözlemlemek ve Adım 2.2 (bakınız Şekil 4) yöntemini kullanarak saymak.
  5. Denemeyi en az üç kez tekrarlayın.
  6. Seçilen konsantrasyonda hücre canlılığı ve ilaç tedavi süresi (saat) arasındaki ilişkiyi grafik her ilaca MMT hücrelerin optimal pozlama süresi belirlemek (bakınız Şekil 6).

4. Lab Modülü

Not: Aşağıdaki, bir 5 günlük birlaboratuvar modülü. Şekil 7 laboratuvar çizelgesi 5 gün içinde gerektirecektir ne bir akış şeması. Bu etkinlik beş gün içinde tamamlanacak bir zaman ders veya bir doz yanıt eğrisi ya oluşturulur. Her iki eğrileri oluşturmak için yeterli bir süre yok. Bir doza cevap deneyi, aşağıda tarif edilmektedir. Bir zaman ders deney kolayca değiştirilebilen olabilir

  1. Gruba sınıfı bölünmüş: bir grup, bir doz tepkisi ve önerilen doz tepki konsantrasyonları ortasında bir konsantrasyon tercih farklı bir zaman süreci kurmak var.
    1. Uygun konsantrasyonlarda yeterli kültür ve ilaç stoklarını korumak. Aksi belirtilmedikçe, BSC altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
  2. 1.Gün
    1. Doğrudan öğrenciler medyayı yapmak ve (adım 1 gibi) hücreleri büyümek.
    2. Öğrenciler 10 cm plaka üzerinde MMT hücrelerinin bir stok elde olarak, öğrenciler hücre kültürü ortamı hazırlamak için yönlendirmek ve hemocytome kullanımında bir öğretici vermekter, dijital mikroskopi ve (adım 2'de olduğu gibi) dijital kamera mikroskopi yazılımı.
    3. Şimdi üreticinin protokolü kullanılarak mikroskop kullanılan hedefleri (örneğin, 4X, 10X, 20X) yazılımı kalibre.
  3. Gün 2
    1. Öğrenci (Aşama 2'de olduğu gibi) toplam hücre sayısı ve hücre canlılığı teyit yazıldı.
    2. Öğrenciler benzer sonuçlar elde edilir onaylamak için, mikroskopi yazılım ve hemositometre yöntemleri her ikisini de kullanarak 100 mm çanak hücreleri saymak var.
    3. Doğrudan öğrenci (aşama 1 'deki gibi) arzu edilen çıkış hücresi ile kaplanmış 24 yuvalı plakalara 100 mm tabak bir 24 oyuklu plaka ve bölünmüş hücreleri elde etmek için. Bu Gün Bölünmüş olarak kabul edilir. 24 saat süre ile, bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 24 gözlü plaka koyun.
  4. 3. Gün
    1. 24 plaka üzerinde 24 saat MMT hücreleri büyütün. Öğrenciler mikroskop altında hücrelerin gözlemlemek ve (adım 2'de olduğu gibi) mikroskopi yazılımını kullanarak saymak gerekir.
    2. Öğrenci / te verKanser tedavisi ilaç stoklarının örnekleri duyuyorum. Onları hazırlamak ve (adım 3 gibi) orijinal stok solüsyonu sulandırmak var. Bir doz-yanıt eğrisi elde etmek hücrelerine çeşitli ilaç konsantrasyonları ekleyin. Bu Gün 0 denir.
    3. 48 saat arasında süre için ilaç ile hücrelerin (aşama 1.2) inkübe edilir.
  5. 4. Gün
    1. Öğrenciler 24 saat sonra tedavi hücreleri gözlemlemek var. Bu Gün 1 olduğunu.
    2. Her bir kuyunun kullanarak mikroskopi yazılımını güvenin. Tutanak her fotoğraf iyi böylece sayma (adım 2'de olduğu gibi) laboratuar dışında yapılabilir.
    3. Başka bir 24 saat için ilaç ile hücrelerin (aşama 1.2) inkübe edilir.
      Not: Öğretim Ek öğreticiler ve veri analizi ve grafik sunum yorumlar sağlar. Öğrenciler veri toplama ertesi gün rakamları, araziler ve istatistiksel analiz oluşturmak için öğrenirler.
  6. 5. Gün
    1. 48 saat, 2. gün sonra hücreler öğrencilerin tedavi etmiş.
    2. Her Sayısıiyi mikroskobu yazılımı kullanarak. Tutanak her fotoğraf iyi böylece sayma (adım 2'de olduğu gibi) laboratuar dışında yapılabilir.
    3. Hasat ve (adım 2'de olduğu gibi) etkin bir şekilde mikroskopi yazılım yöntemi kullanmak için, öğrenci yeteneği doğrulayarak bir araç olarak geleneksel hemositometre yöntemi ile sayım için hücreleri toplamak.
      Not: buna göre, veri toplamak ve sonuçlar çıkarmak veya hipotezler revize.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MMT hücrelerini Büyüyen ve sayma yöntemleri karşılaştıran.

Fare meme tümör hücreleri başarıyla (Şekil 1) ve Motic Software, bir mikroskop için dijital kamera ile ilişkili yazılım programı kullanılarak geliştirilen yeni bir hücre sayımı yöntemi büyüdü ve karakterize edilmiştir. Bu yeni yöntem, hücre sayımı bir hemasitometre (Şekil 2) kullanılarak geleneksel bir sayım yöntemine göre ve hücre sayısı (Tablo 1) belirlenmesinde aynı hassa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir laboratuvar modülü hayvan hücre kültürü gelişmiş teknikler sayesinde hücre biyolojisinde çeşitli konuları öğretmeyi amaçlamaktadır olduğu sunulmuştur. Modül insan göğüs kanseri modelinde hücre replikasyonu üzerindeki anti-proliferatif kimyasal bir dizi etkisini analiz ederek, bu elde edilir. Birincil tahlil hücre sayımı temel tekniği dayanır ve mikroskopi yazılımı kullanarak hücreleri saymak için yeni bir yol sunuyor. modülü içeren faaliyetler aletleri ve çoğu biyoloji programlarında mevcut ekipman ile yapılabilir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar Motic hiçbir maddi veya benzer destek aldı.

Teşekkürler

Bu çalışma, Joseph Alexander Vakfı, ASBMB Lisans Araştırma Ödülü, 2013-2014 ve Marymount Manhattan College, 2012-2013 Bilim Ödülü Bursu tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Doku Kültürü DavlumbazıESCO Labculture ReliantClass II Tip A2 Biyolojik Güvenlik Kabini
Waterjactor CO2 İnkübatörCEDCOModel 1510
Parlak Çizgili Hemositometreİki ayrı ızgaralıAmerikan Optik
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 veya üstü
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30 / CK40 Kültür MikroskobuOlympus4 objektif ters ışık mikroskobu
, kamera 200 ve # 956 ile; l Pipet uçlarıMidSci40200C
1.000 & # 956; l Pipet uçlarıMidSciAVR4
10 ml Seriolojik PipetlerTPPTP94010
24 oyuklu plakalarCoStar- Doku Kültürü Kümesi352424 kuyulu, 16 mm kuyu çapı, radyasyonla sterilize
edilmiş Tripan Mavisi Çözeltisi %0.4SigmaT8154100 ml, hücre kültürü test edilmiş pus olmayan
Parlak çizgili Hematitometre yedek lamel , pus olmayanSigma
Fare Meme Tümörü (MMT) hücreleriATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Orta (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Fetal Sığır SerumuSigmaF0926500 ml
Metformin HidroklorürSigmaPHR1084500 mg
TamoksifenSigmaT5648beyaz veya beyaz-sarı toz
CurmuminSigmaC1386sarı-turuncu toz
AspirinSigmaA2093USP test spesifikasyonlarını karşılar
Z375357

Kaynaklar

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180(2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865(2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücre Kültürü TeknikleriHücre Proliferasyon AnaliziKemoterapi Ajanı TestleriHemositometre SayımıMikroskopi Yazılımı AnaliziHücre Döngüsü KavramlarıHücresel Sinyal YolaklarıKanser Biyolojisi EğitimiLaboratuvar Becerilerinin Geliştirilmesi
Çekirdek Biyoloji Kavramları öğretmek için Fare Meme Tümör Hücreleri kullanma: Basit Lab Modülü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.