Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Summary

Bu protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, epigenetik belirteçlerin ve/veya protein ekspresyonunun sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tekniğini kullanmaktır.

Abstract

beyin nöronları, astrositler, mikroglia ve oligodendrosit dahil olmak üzere dört ana hücre tiplerinin oluşur. Onlar beyinde en bol hücre tipi olmasa da, nöronların en yaygın davranışlar etkileyen oluşumundaki rolleri verilen bu hücre tiplerinin okudu vardır. Beyindeki diğer hücre tipleri, aynı zamanda ürettikleri sinyal molekülleri ile nöronal fonksiyonu ve davranışını etkiler. Sinirbilimciler daha bu etkileşimler nöral fonksiyon ve hastalıkları nasıl etkilediğini anlamak için beyinde hücre türleri arasındaki etkileşimleri anlamak gerekir. Bugüne kadar, protein veya gen ekspresyonunu analiz etmek için en sık kullanılan yöntem, genellikle kan ve hücre tipi için bakılmaksızın tüm doku örneklerinin homojenizasyon kullanmaktadır. Bu yaklaşım geni veya nöral fonksiyon ve davranışlarını etkileyebilir protein ekspresyonu genel değişiklikleri incelemek için bilgilendirici bir yaklaşımdır; Ancak, bu analiz yöntemi hücresinin daha büyük bir anlayış kendisini ödünç değiltipi-özgü gen ifadesi ve nöral fonksiyonu hücre-hücre iletişiminin etkisi. Davranışsal epigenetik Analizi inceliyor büyüyen bir odak alanı olmuştur nasıl deoksiribonükleik asit (DNA) yapısını etkisi, uzun vadeli gen ifadesi ve davranış modifikasyonları; Bireysel nöral hücre tiplerinin belirli genlerin üzerinde mevcut olabilir ayırıcı soy ve böylece epigenetik işaretleri verilen bir hücre türü spesifik şekilde analiz Ancak bu bilgiler, ilgili olabilir. Aşağıda tarif edildiği gibi (FACS) tekniği THP-gen ekspresyonu, protein ifadesi ya da DNA'nın epigenetik değişiklikler daha sonraki analiz için tek tek sinir hücrelerinin izole edilmesi için, basit ve etkili bir şekilde sağlar. Bu teknik aynı zamanda daha sonra, hücre tipi özel analizler için beyinde daha özel nöral hücre tiplerini izole etmek için modifiye edilebilir.

Introduction

Aşağıda açıklanan protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, protein ekspresyonunun ve hatta epigenetik belirteçlerin müteakip analizi için heterojen bir nöral doku popülasyonundan bireysel hücre tiplerini izole etmektir. Beyin, farklı progenitör hücrelerden türetilen ve hücre tipine özgü özelliklere ve işlevlere sahip birçok hücre tipinden oluşur. Bu farklılıklara rağmen, bu farklı nöral hücre tipleri, benzer reseptörleri ve hücre içi sinyal moleküllerini ifade edebilir, bu da bu daha yaygın proteinlerin analizini, geleneksel yöntemler kullanılarak hücre tipine özgü bir şekilde ölçmeyi veya yorumlamayı zorlaştırır. Sinirbilimciler, beyindeki bu farklı hücre tiplerinin işlevini ve aktivasyonunu ve davranışı bireysel olarak nasıl etkileyebileceklerini tanımlamalıdır, çünkü bu, sonuçta nörolojik ve nöropsikiyatrik hastalıklar için daha spesifik ilaçlar ve terapötik hedefler belirlemenin ilk adımı olacaktır. Sinirbilim araştırmalarının bu kapsayıcı hedefine rağmen, gen veya protein ekspresyonunun analizi, sinyal moleküllerinin aktivasyonu veya DNA üzerindeki epigenetik belirteçlerin modifikasyonu için bireysel nöral hücre tiplerini beyinden izole etmek zor olabilir. Şu anda kullanılan tekniklerden, immünohistokimya, hücre tipine özgü bir markörün ek boyanması ile birleştirildiğinde proteinlerin ekspresyonunu hücre tipine özgü bir şekilde tanımlayabilir, ancak bu, ilgilenilen proteinler için uygun şekilde boyanabilen spesifik antikorlara dayanır ve ölçülmesi zor olabilir. Yerinde hibridizasyon, beyindeki tek tek hücrelerde haberci ribonükleik asidin (mRNA) spesifik lokalizasyonunu tanımlayabilir, ancak bu, belirli hücre tiplerinin birlikte analizini de sınırlayan ve yalnızca bir veya belki birkaç genin analizine izin veren zahmetli bir süreçtir. Lazer yakalama mikro diseksiyonu, mikroskopi yoluyla görüntülenen hücrelerin alt popülasyonlarını izole etmek için bir lazer kullanır; bununla birlikte, bu işlemin zaman alıcı doğası ve nispeten düşük verim, özellikle bu moleküllerin ekspresyonu başlangıçta düşükse, proteinlerin veya mRNA seviyelerinin sonraki analizini önemli ölçüde sınırlayabilir. Floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırma (FACS), gen ekspresyonu¹ ve/veya epigenetik hedefler^2'nin sonraki analizi için bireysel hücre tiplerini beyinden izole etmek için sinirbilim alanında nispeten yeni bir tekniktir. Bu işlem, hücre tipine özgü gen ekspresyonu, protein ekspresyonu veya epigenetik belirteçlerin daha sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için de kullanılabilir. FACS, kanser ve immünoloji gibi bir dizi tıbbi araştırma alanında, fiziksel veya biyokimyasal özelliklere dayalı olarak farklı hücreleri saymak ve sıralamak için onlarca yıldır kullanılmaktadır³. Ek olarak, akış sitometrisi klasik olarak spesifik antikorlar kullanılarak hücre başına protein ekspresyonunu analiz etmek için kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan prosedür, moleküler biyoloji uç noktalarının sonraki analizi için bireysel hücre tiplerini izole etmek için klasik akış sitometrisi tekniklerinden yararlanır. Akış sitometresi bir saniyede birkaç bin hücreyi analiz edebilir, bu da onu yukarıda açıklanan tekniklere hızlı ve verimli bir alternatif haline getirir. Ek olarak, hücreler, belirli bir proteinin (örneğin bir nörotransmitter reseptörü) hücresel ekspresyonuna veya iki veya daha fazla proteinin bir kombinasyonuna (belirli bir hücre tipinde birden fazla proteinin kolokalizasyonu) dayalı olarak izole edilebilir. Bu, kullanıcının beyindeki işlevlerini tanımlamak için moleküler özelliklerine göre çok seçici nöral hücre tiplerini izole etmesine olanak tanır.

FACS'ı gerçekleştirmek için, nöral hücreler, hücreleri taşıyan ve hizalayan bir akış hücresinden geçirilen tek hücreli bir süspansiyona hazırlanır, böylece analiz için bir ışık huzmesi ve lazerlerden tek bir dosya geçirirler. Bir bilgisayar, her hücreden verileri alır ve belirtilen parametrelerin (boyut, ayrıntı düzeyi ve floresan) analizi için bir histogram üzerinde çizer. Bu parametrelere dayanarak, hücreler hemen hatırlanmaları ve istenen herhangi bir son noktanın daha sonra analizi için ayrı tüplere ayrılabilir. Aşağıda açıklanan protokol, nöronları (bir Thymosit antijeni 1, Thy1 antikoru kullanarak), astrositleri (bir glial glutamat taşıyıcısı, GLT1 antikoru kullanarak) ve mikrogliaları (bir farklılaşma molekülü kümesi 11B, CD11b antikoru kullanarak) sıralamak için üç antikor kullanır. Bu protokol, aşağıda tarif edildiği gibi kullanılabilir veya kişinin kendi deneyleri için izole etmek istediği hücre tipine bağlı olarak farklı antikorlarla değiştirilebilir.

Bu protokolün belirli deneyler için uygun olup olmadığını belirlerken dikkate alınması gereken birkaç uyarı vardır. Önemli bir uyarı, izole etmek istediğiniz spesifik hücre tipiyle ilgili olabilir. Bu protokolde, kullanılan üç antikor, deneycinin boyama prosedürü sırasında hücre tiplerini sağlam tutmasına izin veren, böylece içindeki RNA, DNA ve proteinlerin bütünlüğünü koruyan hücre dışı antikorlardır. Belirli bir nöral hücre tipini, yalnızca o belirli hücrenin içinde ifade edilen bir proteini tanımlayan bir antikor kullanarak izole etmek isteyebilirsiniz. Örneğin, tirozin hidroksilaz için bir antikor kullanarak dopaminerjik nöronları izole etmek veya kolin asetiltransferaz için bir antikor kullanarak asetilkolin nöronlarını izole etmek isteyebilirsiniz. Bu proteinler hücre içidir ve bu nedenle uygun antikorlarla daha sonra boyama için hücre zarının fiksasyonunu ve geçirgenliğini gerektirir. Bu ^4,5'ten önce yapılmış olsa da, bu işlem bu geçirgen hücrelerden RNA veya DNA verimini önemli ölçüde azaltabilir. Başka bir uyarı, tüm antikorların FACS için uygun olmadığı olabilir. Örneğin, şu anda proteinlerin denatürasyonunu gerektiren bir teknik olan western blot için çok iyi çalışan bir antikor kullanılabilir. Bu antikor, proteinlerin bu protokolün herhangi bir noktasında denatüre edilmediği ve bu nedenle antikorun doğal antijenine bağlanmasının bir yolu olmayabileceği göz önüne alındığında, FACS kullanılarak bu hücre tiplerinin tanımlanması için mutlaka uygun olmayabilir. Şirketler, bir antikorun onaylandığı uygulamaları tanımlayan spesifikasyon formları sağlar. Bir antikor akış sitometrisi için onaylanmamışsa, bu protokolü belirli bir antikorla denemekten caydırmamalıdır; ancak, FACS'ta çalışmasının garanti edilmediğinin farkında olunmalıdır. Bu protokolün üçüncü bir uyarısı, izole edilmeye çalışılan hücre sayısı ile ilgilidir. FACS, küçük bir doku parçasından bile mümkün olan en fazla hücreyi elde etmek için mükemmel bir tekniktir, ancak nispeten seyrek bir hücre popülasyonunu nispeten küçük bir beyin bölgesinden izole etmek istenirse, bir hayvandan elde edilen verimin doğal olarak düşük olması da mümkündür. Bu durumda, sonraki analizler için gerekli hücre sayısını elde etmek için aynı tedavi grubundaki birkaç hayvandan beyin dokusunun bir araya getirilmesi gerekebilir; bununla birlikte, yakın tarihli bir yayın, daha büyük bir küme sıralanmış nöronlardan az sayıda aktive nörondan (%5-6) gen ekspresyonunun müteakip analizi için cDNA'nın gen hedefli ön amplifikasyonunu kullanmıştır, bu da çok sayıda hayvanı bir araya getirmeden küçük sinir hücrelerinin alt kümelerinden bile gen ekspresyonunu analiz etmenin mümkün olduğunu göstermektedir⁶Bu tekniğin son bir uyarısı, kişinin çok uzakta olmayan bir hücre sıralayıcıya erişimi olması gerektiğidir. Hücre sıralayıcı, düzgün bir şekilde kullanmak için önemli eğitim gerektiren karmaşık bir makinedir. Bu nedenle, bu makineler genellikle bir çekirdek tesiste kalifiye bir teknisyen tarafından çalıştırılır. Ek olarak, bu prosedürün amacı, nöral dokuyu ayrıştırmak, belirli antikorlar için boyamak ve bu örnekleri kısa bir süre içinde (belki yarım gün) hemen bir ayıklayıcıya götürmektir. Bu zaman dilimi, izole edilmiş hücrelerin hayatta kalmasını ve verimini artırmaya ve sonraki işleme ve analiz için hücrelerin bütünlüğünü korumaya yardımcı olacaktır. Yukarıda açıklanan bu parametrelerin tümü karşılanırsa, FACS, nöral dokudan gelen genlerin ve proteinlerin hücre tipine özgü ekspresyonunu analiz etmek için mükemmel bir yöntemdir.

Tüm deneyler, Delaware Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Protocol

1. Doku Toplama için Hazırlık (15 – 30 dk)

1. Azalan çaplarda üç set cam Pasteur pipetini ateşle parlatın ve bunları "1" = yaklaşık 1 mm çap, "2" = yaklaşık 0,75 mm çap ve "3" = yaklaşık 0,50 mm çap olarak numaralandırın.
2. Liyofilize Enzim A'yı, Nöral Dissosiyasyon Kiti ile sağlanan protokole göre tüm Tampon A ile yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu). Girdap yapmayın. Solüsyonu 50 μl'lik alikotlara ayırın ve daha sonra kullanmak üzere -20 ºC'de saklayın.
3. Sterilizasyon için 1 L miyelin uzaklaştırma tamponu ve vakum filtresi yapın [miyelin çıkarma tamponu = 1.000 ml 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS), 2 ml 500 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 10 g Sığır Serum Albümini (BSA)].
4. Naylon örgü levhayı, alüminyum folyo ile kaplı küçük bir beherde hücresel kalıntıları ve otoklavları filtrelemek için kullanılacak küçük 1 x 1 inç (2,5 x 2,5 cm) kareler halinde kesin.
5. 1 L yıkama tamponu hazırlayın [yıkama tamponu = 1.000 ml 0.1 M PBS, 2 ml 500 mM EDTA ve 10 g BSA].

2. Doku Toplama

1. Su banyosunu 37 ºC'ye getirin.
2. Tampon X'e 0.067 mM'lik bir nihai konsantrasyona beta-merkaptoetanol ekleyerek Nöral Ayrışma Kitinden Tampon X'i hazırlayın (4 numune için, 10 ml Tampon X'e 13.5 μl 50 mM beta-merkaptoetanol ekleyin).
3. Nöral Dissosiyasyon Kiti protokolünde açıklandığı gibi her numune için 50 μl Enzim P'yi 1.900 μl Tampon X ile karıştırarak Enzim Karışımı 1'i hazırlayın Örneğin, 4 numune için 200 μl Enzim P'yi 7.600 μl Tampon X ile karıştırın.
4. Buffer X'i 37 ºC'deki su banyosuna yerleştirin.
5. Toplanacak her numune için 2 ml soğuk Hank'in Tamponlu Tuz Çözeltisi'ni (HBSS) (Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan) steril 6 oyuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna yerleştirin ve doku diseksiyonu için buz üzerinde tutun.

3. Doku Diseksiyonu (45 dk – 1 saat)

1. Hayvana Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine göre uygun hacimde ötenazi solüsyonu (ticari barbitürat solüsyonu, örneğin Euthasol) enjekte edin ve tüm kanı soğuk% 0.9 salin solüsyonu ile perfüze edin.
   1. Sıçanları aşırı dozda ötenazi çözeltisi ile uygulayın.
   2. Anesteziyi solunum ve ayak parmağı kıstırma yoluyla izleyin. Hayvan yeterince anestezi uygulandığında (ayak parmağının kıstırılmasına ve derin, yavaş nefes almaya yanıt verilmediğinde), sıçan perfüze edilebilir.
   3. Fareyi perfüze etmek için, göğüs boşluğunu bir çift ağır hizmet tipi makasla kesin. Kalbe kadar erişim sağlamak için diyaframı kesin. Kalbe tam erişim sağlamak için kaburgaları her iki taraftan göğsün üst kısmına doğru kesin. Bu noktada, göğüs kafesi bir çift kanama durdurucu kullanılarak yana doğru tutulabilir.
   4. Kalbin sol ventrikülüne bir elektrikli pompaya bağlı 18 G'lik bir iğne (yetişkin sıçanlar için) sokarak kardiyak perfüzyon yapın. Pompa soğuk% 0.9 tuzlu su çözeltisi çekiyor.
   5. Ardından, kan ve sıvı perfüzatın vücuttan akmasını sağlamak için sağ atriyumu küçük bir makasla kesin.
   6. Tüm periferik bağışıklık hücrelerini ve faktörlerini uzaklaştırmak için sıçanları yaklaşık 10 ml (yetişkin sıçanlar için)% 0.9 salin ile perfüze edin.
2. Steril tıraş bıçağı ve uygun diseksiyon kullanarak beyin bölgesinin istenen kısmını inceleyin, ardından doku parçalarını Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} olmadan soğuk HBSS'ye yerleştirin.
   NOT: Protokol, protokolün erken aşamalarında Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen HBSS gerektirir, çünkü bu iyonlar nöral ayrışma için gerekli enzimlerle etkileşime girebilir.
3. Tüm doku örnekleri toplandıktan sonra, doku işleme için temiz tezgaha veya steril kültür başlığına geri dönün.

4. Nöral Ayrışma (1 saat)

1. Her doku örneğini, 6 oyuklu kültür plakasının kapağındaki steril tıraş bıçakları kullanarak küçük parçalara ayırın. Bu protokol yaklaşık 30 - 100 mg'lık doku örnekleri için kullanılmıştır, ancak 400 mg'a kadar olan doku örnekleri için onaylanmıştır. 400 mg'dan büyük doku numuneleri için reaktif hacimleri uygun şekilde ölçeklendirilmelidir.
2. Doğranmış doku parçalarını bir pipet ile steril 2 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen 1 ml taze HBSS kullanın. Tüm numuneler 2 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarılana kadar tüm numuneler için 4.1 ve 4.2 adımlarını tekrarlayın.
3. Numuneleri RT'de 2 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
4. Her numuneye Adım 2.2 ve 2.3'te hazırlandığı gibi 1.900 μl ılık Enzim Karışımı 1 ekleyin ve tüpleri kapatın.
5. Numuneleri 37 ºC'lik su banyosunda 15 dakika inkübe edin, çöken doku parçalarını yeniden süspanse etmek için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
6. Bu arada, 20 μl Tampon Y'yi 10 μl çözülmüş Enzim A ile karıştırarak Enzim Karışımı 2'yi hazırlayın (4 numune için 80 μl Tampon Y'yi 40 μl çözülmüş Enzim A ile karıştırın).
7. Her numuneye 30 μl Enzim Karışımı 2 ekleyin ve yavaşça ters çevirin. Girdap yapmayın.
8. Her doku örneğini Pasteur pipeti "1" ile 30 kez yukarı ve aşağı tritüre ederek ayırın.
9. Numuneleri 37 ºC su banyosunda 15 dakika inkübe edin; çökelmiş doku parçalarını yeniden askıya almak için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
10. Her doku örneğini Pasteur pipeti "2" ile 30 kez yukarı ve aşağı tritüre ederek ayırın. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
11. Her doku örneğini Pasteur pipeti "3" ile 30 kez yukarı ve aşağı tritüre ederek ayırın. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
12. Numuneleri 37 ºC su banyosunda 10 dakika inkübe edin; çökelmiş hücreleri yeniden askıya almak için tüpleri her 5 dakikada bir birkaç kez ters çevirin.
13. Büyük kalıntı parçalarını çıkarmak için 15 ml'lik bir falcon tüpünün üzerine yerleştirilen 80 mikronluk bir hücre suşuna tek hücreli süspansiyon uygulayın ve enzim reaksiyonlarını durdurmak için filtreyi ve hücreleri 10 ml HBSS (Ca²⁺ ve Mg 2⁺ ile) ile yıkayın. Her numune 15 ml'lik temiz bir şahin tüpüne aktarılana kadar tekrarlayın.
14. Numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.

5. Miyelin Tükenmesi (45 dk)

1. Hücre peletini 400 μl miyelin uzaklaştırma tamponu ile iyice yeniden askıya alın.
2. Belirtilen miktarda miyelin çıkarma boncuklarını ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
   NOT: Kullanılan miyelin çıkarma boncuklarının hacmi, dokunun boyutuna, hayvanın yaşına ve söz konusu beyin bölgesinde beklenen miyelin miktarına bağlı olacaktır. Örneğin, yetişkin bir sıçan hipokampus numunesi için (yaklaşık 300 mg), numuneyi 100 μL miyelin çıkarma boncuğu ile inkübe edin.
3. Buzdolabında 4 ºC'de 15 dakika inkübe edin.
4. Her numuneyi 5 ml miyelin giderme tamponu ile yıkayın.
5. Numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
6. Numuneleri santrifüj ederken, manyetik sıralayıcının manyetik alanına her numune için 1 sütun yerleştirin ve her sütunun üzerine 80 mikronluk temiz bir filtre yerleştirin.
7. Sütunları hazırlayın ve her sütunu 1 ml miyelin giderme tamponu ile 3 kez (toplam 3 ml) durulayarak süzün. Tüm akışı boş bir uç kutusunun dibi gibi bir atık kabında toplayın.
8. Numune toplamanın hazırlanmasında 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpü her sütunun hemen altına yerleştirin.
9. Hücreler santrifüjlemeyi bitirdiğinde, süpernatanı aspire edin ve 500 μl miyelin uzaklaştırma tamponunda iyice yeniden süspanse edin. Hemen kolona hücre süspansiyonu uygulayın ve hücreleri aşağıdaki tüpte toplayın.
10. Filtreyi ve kolonu 1 ml miyelin giderme tamponu ile 4 kez (toplam 4 ml) yıkayın.
11. Hücre koleksiyonunu RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
12. Süpernatanı aspire edin ve hücreler artık lekelenmeye hazırdır.

6. FACS için Canlı Hücrelerin Boyanması (boyama için 1 saat)

1. Peleti ayırmak için hücreleri kısaca girdaplayın (2 saniye) ve hemen 5 μl Fc bloğu (farklılaşma önleyici kümeler 32, CD32) ekleyin, tekrar girdap yapın ve buzdolabında 4 ºC'de 5 dakika inkübe edin.
2. Bu arada, yıkama tamponuna üç birincil antikoru aşağıdaki gibi ekleyerek birincil antikor karışımını hazırlayın: 0.125 μl allofikosiyanin (APC) -konjuge CD11b antikoru (1:800), 1 μl anti-GLT1 antikoru (1:100) ve 0.4 μl Floresein izotiyosiyanat (FITC) - konjuge Thy1 antikoru (1:250) her 100 μl yıkama tamponu için. Her numune, inkübasyon için 100 μl primer antikor karışımı alacaktır; Bununla birlikte, numuneniz 400 mg dokudan çok daha büyükse, birincil antikor karışımınızın hacmini buna göre artırmayı düşünebilirsiniz
3. Her numune tüpünden sadece 2 μl hücre çıkararak ve her bir leke kontrol tüpüne ekleyerek tek boyama kontrolleri için tüpleri hazırlayın. "Tek leke" kontrolleri şunları içerir: yalnızca APC-CD11b, yalnızca GLT1, yalnızca FITC-Thy1, yalnızca PE ikincil antikoru ve "boş" veya boyanmamış kontrol.
   NOT: Tüm numuneler tüm boyama kontrollerinde temsil edilmelidir, bu nedenle her bir numuneden 2 μl hücre her boyama kontrol tüpüne eklenmelidir.
4. Tüpleri kısaca vorteksleyin (2 saniye) ve her numune tüpüne 100 μl primer antikor karışımı ve her boyama kontrol tüpüne 100 μl uygun primer antikor ekleyin, tüpleri tekrar vorteksleyin, floresan antikorları herhangi bir ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve tüpleri buzdolabında 4 ºC'de 20 dakika inkübe edin. Numunelerin ve antikorların bütünlüğünü korumak için prosedürün geri kalanında numuneler soğuk tutulmalıdır (4 ºC'de).
5. Tüpleri kısaca vorteksleyin ve her tüpe 2 ml yıkama tamponu ekleyin.
6. Tüpleri 350 x g'da 4 ºC'de 5 dakika
santrifüjleyin.
7. Bu arada, her 100 μl yıkama tamponu için 0.2 μl PE konjuge anti-tavşan ikincil antikoru ekleyerek ikincil antikor karışımını hazırlayın. Her numune 100 μl ikincil antikor karışımı alacaktır; Bununla birlikte, numuneniz 400 mg dokudan çok daha büyükse, birincil antikor karışımınızın hacmini buna göre artırmayı düşünebilirsiniz.
8. Santrifüjleme tamamlandığında, her bir numunedeki süpernatanı lavaboya boşaltın ve tüpleri bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın.
9. Tüpleri kısaca vorteksleyin ve her numune tüpüne 100 μl ikincil antikor karışımı ve her boyama kontrolüne uygun ikincil antikor ekleyin, tüpleri tekrar vorteksleyin, tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve tüpleri buzdolabında 4 ºC'de 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Yalnızca GLT1 boyama kontrol tüpü ikincil antikor karışımını almalıdır.
10. İnkübasyondan sonra, tüpleri kısaca vorteksleyin ve her tüpe 2 ml yıkama tamponu ekleyin.
11. Tüpleri 350 x g'da 4 ºC'de 5 dakika santrifüjleyin.
12. Santrifüjleme tamamlandığında, her bir numunedeki süpernatanı lavaboya boşaltın ve tüpleri bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın.
13. Tüpleri vorteksleyin ve her tüpe 0.25 ml steril PBS ekleyin. Numuneler tasnif için hazır.
    NOT: Daha fazla hücre 0,5 ml steril PBS gerektirebilir; Bununla birlikte, numune hücrelerle çok konsantre edilirse her zaman seyreltilebileceğinden, daha düşük bir hacimle başlamak en iyisidir.
    NOT: Hücrelerin topaklanmasını ve dolayısıyla sıralayıcının tıkanmasını önlemek için isteğe bağlı olarak tüpe DNaz ekleyin. Numuneler, ayıklayıcının tıkanmasını önlemek için tasniften hemen önce steril bir 80 mikron filtre kullanılarak da filtrelenebilir.
14. Hücreleri buz üzerindeki sıralayıcıya götürün. Hücre popülasyonlarını, her tüpte 0.5 ml steril PBS bulunan 2 ml'lik nükleaz içermeyen santrifüj tüplerinde toplayın.
15. Sıralamadan sonra, hücreleri 4 ºC'de 2 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. PBS'nin çoğunu aspire edin ve hücreleri, RNA ekstraksiyonu (daha fazla protokol detayı için bkz. 1), DNA ekstraksiyonu (daha fazla protokol detayı için 2'ye bakınız) veya protein analizi için hücre lizisi için daha fazla işleme tabi tutulana kadar -80 ºC dondurucuda dondurun.

Results

Miyelin Tükenmesinin ve Doku Perfüzyonunun Önemi

Şekil 1, miyelin tükenmesinin önemini göstermektedir. Miyelin tükenmesi (yukarıdaki protokolün 5.1 ila 5.12 arasındaki adımları), tek hücreli süspansiyon Miyelin Çıkarma Boncukları içinde inkübe edildiğinde, yıkandığında ve ardından manyetik sıralayıcı üzerindeki kolondan geçirildiğinde meydana gelir. Bu adımların amacı, her bir numunede bulunan hücresel kalıntı miktarını azaltmaktır. Nöronlar ayrıştıkça ve tritüre oldukça, tipi...

Discussion

Diğer birçok doku ve sisteme benzer şekilde beyin, davranışı etkilemek için birlikte işlev gören heterojen bir hücre popülasyonundan oluşur. Bu heterojen popülasyon içindeki tek tek hücrelerden gen ekspresyonu, protein ekspresyonu veya epigenetik modifikasyonların analizi, sistemin bir bütün olarak işlevi hakkında bilgi ortaya çıkarma, hem normal davranışı hem de hastalık süreçlerini düzenleyen hücresel süreçleri belirleme ve potansiyel tedaviler için hücre tipine özgü hedefler sağlama potansiyeline sahiptir. Gelecekte, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nöral Ayrışma Kiti (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Miyelin Çıkarma Boncukları II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS Sütunları	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS Ayırıcı	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Naylon Örgü Levha	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inç genişlik, 80 mikron boyutunda örgü
Fc Blok / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	sıçan
için reaktivite APC-konjuge CD11b antikoru	sıçan	201809
Tavşan anti-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	sıçan veya insan
PE konjuge anti-tavşan için reaktivite ikincil	antikor eBioscience	1037259	anti-GLT1
FITC-konjuge anti-sıçan CD90 (Thy1) fare	antikoru için ikincil antikor Sıçan için biyoefsane	202504	reaktivitesi