Yöntem makalesi

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

DOI:

10.3791/52551

⸱

22 Nisan 2015

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin nöron yeni nöronlar giderek kararlı ara progenitör alt tipleri ile aktive edilmiş bir nöral kök hücre elde edildiği yüksek ölçüde düzenlenmiş bir çok-aşamalı süreçtir. Bu alt-tiplerin her biri, birlikte, özel morfolojik kriterlere göre tespit edilmek için kullanılabilen spesifik moleküler markörlerin bir dizi ifade eder. Tipik haliyle, immünofloresan teknikler ekso- ya da endojen çoğalma işaretleri ile kombinasyon halinde alt tip-spesifik antikorlar içeren uygulanır. Biz burada yetişkin hipokampal nöron tüm aşamalarında saptanması ve ölçülmesi için yöntemler immün tarif. Bu timidin analogları, transcardial perfüzyon, doku işleme, ısı kaynaklı epitop alma, ABC immünohistokimya, çoklu dolaylı immunofloresan, konfokal mikroskopi ve hücre ölçümü uygulaması içermektedir. Ayrıca biz sorunları u circumvents sıralı birden immunofloresans protokolü sunuyoruzsually aynı konak türlerinde kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak ihtiyacı doğan. Tek bir bölüm içinde bir çoğalma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt tiplerinin doğru belirlenmesini sağlar. Bu teknikler paralel farklı progenitör alt tiplerinin düzenleme, beyin patolojileri katılımlarını ve spesifik beyin fonksiyonları rollerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki beyin bölgeleri kurucu yaşam boyunca yeni nöronlar oluşturmak, lateral ventriküllerin subventriküler bölge ve hipokampusün (DG) subgranular bölge (SGZ). Yeni doğan nöronlar nöral progenitör hücrelerden elde ve olgunluğa 1,2 ulaşmadan önce morfolojik ve fizyolojik gelişimin farklı aşamalarında gitmek. Yavaş bölünmesi radyal glia-benzeri kök hücre (tip 1) transit ardışık aşamaları ara progenitör hücrelerin ortaya yükselterek. daha farklılaşmamış alt tipi (Tip 2a ve tip 2b) kısa teğet süreçleri ile düzensiz bir şekle sahiptir. Onlar (dendritler moleküler tabakası doğru genişletilmiş) ile giderek olgunlaşmamış nöronların olmak için hücre döngüsünü çıkmak ve nihayet hipokampal ağ gibi olgun granül hücreleri içine entegre Nöroblastlar (tip 3) oluşturur. Dolayı özellikle fizyolojik özellikleri bu hücreler gelişmiş plastisite 3 sugges ile devreyi sağlamakting hipokampustaki benzersiz bir rolü. Aslında, son on çalışmaları yetişkin nöron mekansal bellek, desen ayırma ve duygusal davranış 4,5 katkıda önemli kanıtlar oluşturdu.

Yetişkin nöron farklı yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Timidin analogları hücre döngüsünün S-fazında DNA içine dahil ve yeni doğan hücrelerin 6-8 doğum partner, miktar ve kader analizi sağlar. Farklı timidin analogları (örneğin, CldU, edu veya DUK) sıralı uygulama hücre yenileme ya da bir deney 9 sırasında farklı zaman noktalarında doğan hücre popülasyonlarının incelemek için kullanılabilir. Bir alternatif olarak, hücre proliferasyonu için endojen işaretleyici Ki67 olup. Hücre döngüsü (G1, S, G2, E) dinlenme aşamasında dışında (G0) ve G1 10,11 başında her safhasında hücrelerin bölünmesi ile ifade edilir. Yetişkin dentat yenidoğan hücre popülasyonlarının fenotipi analiz etmekE girus çeşitli safha spesifik moleküler markörler GFAP, Nestin, DCX ve neuN 1,6 olarak kullanılabilir. GFAP erişkin astrositlerin bir göstergesi, aynı zamanda, yetişkin önbeyin radyal glial benzeri hücrelerde ifade edilir. Nestin radyal glia-benzeri hücreler ve erken orta projenitör hücrelere özgü bir ara filamenttir. DCX ara progenitörlerle nöroblast- ve olgun nöronlarda ifade edilen bir mikrotübüle bağlı bir proteindir. + Nestin - türü 2a (GFAP - tip 1 (GFAP + Nestin +, DCX): Bu üç işaretleri ve dört ayrı progenitör hücre alt tipleri tespit edilebilir etiketli hücrelerin morfolojik özellikleri (eş) ifadesi dayanarak , DCX -), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin - DCX +) 1. Birlikte postmitotik nöronların ifade neun, ile DCX Eş-etiketleme immatür farklılaşmasını izin verire (DCX + neun +) ve olgun (DCX - neun +) granül nöronlar.

Yukarıda belirtilen belirteçler sıklıkla yeni doğmuş hücrelerin sayısını ve kimliğini analiz etmek üzere immünoflüoresan ko-etiketleme ve daha sonra konfokal mikroskopi için kullanılır. Bu, tipik olarak, istenmeyen antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı bir ev sahibi türünden antikorların gerektirir. Ancak nöron araştırma için uygun bir temel antikorların büyük bir kısmı ya da tavşanlar ya da fareler (örneğin, fare α-BrdU, fare α-neun, tavşan α Ki67, tavşan α-GFAP) yetiştirilir. Bu, tek bir dilim değerlendirilebilir antijenlerin sayısı ve kombinasyon halinde ciddi kısıtlamalara yol açar. Bu da birden fazla boyamaları girmelidirler gibi yalnızca boyama sarfedilen güç artar, ama aynı zamanda sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir. Bununla birlikte, bazı antijenler, formalin tespit kaynaklı epitop maskeleme (ör Ki67 duyarlıdırlar, Nestin). Biz burada klasik tek ve çoklu immün protokolleri değişiklikleri tanımlamak (örneğin, epitop alma, birden fazla sıralı immun, Nestin-GFP transgenik farelerin 12 kullanımı) bu sorunların çoğunun üstesinden. Özel olarak, sıralı çok sayıda imüno protokol antikorların bir kısmı da, ev sahibinden türemiş bile, dört farklı antijenlere karşı boyama sağlar. Bu aynı anda Tip 1, Tip 2a, tip 2b ve tip 3 projenitör hücrelerin saptanmasını, hem de tek bir bölüm içinde çoğalma aktivitesi sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: yaşayan hayvanları kapsayan tüm işlemler EC direktifi 86/609 / EEC sayılı laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallar ve yerel etik kurul (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) tarafından onaylanan uygun olarak yapılmıştır.

Timidin Analoglarının 1. periton içine enjeksiyon

  1. Enjeksiyondan önce hayvanlar gün tartılır. Bir sonraki gün aynı zamanda, bir 10 mg / ml stok çözeltisi, bireysel ağırlığa göre ayarlanmış enjeksiyon hacimleri planlanan tüm enjeksiyonlar için gereken timidin analoğu miktarını hesaplayın.
  2. 10 mg / ml timidin stok çözelti hazırlayın. (DİKKAT! Thymidine benzerleri zehirlidir. Bir kimyasal davlumbaz kullanmak, yani, tedarikçiler tarafından sağlanan özel Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) izleyin laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek).
    1. Dondurucudan timidin analog alın ve yaklaşık RT getirmek. 21 ° C. 10 mg tartılır ve ekleyinveya 0.04 N NaOH (BrdU ve CldU için) steril tuzlu su (steril tuzlu su içinde, IDU için), vorteks. Bir 50 ° C su banyosu ve girdap içinde, 15 dakika, her - 2 - tozu çözmek üzere 3 dk için en az 10 yerleştirin.
      Not: en fazla 24 saat için kullanımlar çözeltileri, oda sıcaklığında ve -20 ° C de bir kaç hafta içinde saklanabilir. Işık (alüminyum folyo ile kapak) çözümler koruyun. Her zaman çökeltilerin kontrol ve gerekirse-çözülür yeniden.
  3. Ense fare kısıtlamaktadır ve periton içine, 30 G iğne ile ince bir dozaj şırıngası kullanılarak (oda sıcaklığında) stok çözeltisi, uygun bir, ağırlığa göre ayarlanmış hacim enjekte edilir.
    Not: durumda CldU ve Idu, aynı hayvanda sıralı olarak uygulanabilir gerekir eşit mol konsantrasyonları enjekte düşünün (örn, 50 mg / kg BrdU uygun 42.5 mg / kg CldU ve 57.5 mg / kg Idu). Bu nedenle, buna uygun olarak, 10 mg / ml'lik stok çözeltiler enjeksiyon hacimlerini ayarlamak.

2. Doku Hazırlanması

  1. Prepaperfüzyon bir gün önce 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 formaldehit yeniden. 4 ° C'de saklayın.
  2. Transkardiyal 40 ml buz gibi soğuk formaldehid (akış oranı 5 mL / dakika) ile daha sonra 10 ml buz gibi soğuk PBS ile sol ventrikil yoluyla derin anestezi altındaki farelerin (% 3.5 izofluran) serpmek. 4 ° C'de 24 saat boyunca aynı sabitleyici beyin ve sonrası düzeltme ayır.
  3. Arka arkaya, 10% (4 ° C'de 24 saat) ve% 30 sakaroz (beyin lavabolar kadar, yakl. 48 saat) içine beyin aktarın. Kabarcıklar doku ortaya kadar donma için, yavaş yavaş -25 ° C izopentan içine Kriyo-korumalı beyinleri daldırın. -80 ° C'de saklayın.
  4. Bir dondurma mikrotomda 40 mikron kalınlığında koronal bölümleri kesin (-25 blok sıcaklığı -16 ° C). Bir 24-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuklarına içeren antifriz solüsyonu içine Sıralı aktarım bölümleri (Şekil 1 e bakınız). -20 ° C'de saklayın.

"Şekil 24-plaka içine microtome dilim aktarılması Şekil 1. şematik gösterimi. A1 başlayın ve A6 vb sonraki satır B gidin ve sonra, satır A içine sonraki dilimlerini yerleştirin. D6 ulaşan yaparken, A1 geri dönmek ve devam edin. Dilimlerin Bu düzenleme tüm beyin bölümlerinde inci her n ölçülmesini sağlar. Yenidoğan hücrelerin ölçümü için immünoflüoresans feno (tek sütun 2 alternatif satır içeriği eşdeğer) her 12 inci bölüm alır, (tek sütun içeriğine eşdeğeri) beyin bölümünde inci her 6 alır.

3. immün

Not: Bölüm 6 oyuklu plakalar bir taşıyıcı plaka ile donatılmış uçları örgü genellikle, serbest yüzer işlenir. Bir istisna olarak, antikor inkubasyon ABC Reaksiyon örgü uçlar (a başına 0,5-1 mi olmadan 12 veya 24 oyuklu plakalar içinde yapılır engellemeell) lekeli gereken dilim sayısına bağlı olarak yeterlidir. Bu adımlar sırasında, ince bir fırça yardımıyla (her yeni çözümü ile durulayın) ile bölümleri aktarmak. Bütün inkübasyonlar, sürekli çalkalama (en fazla 150 rpm) ile yapılır.

  1. İmmünohistokimya (ABC yöntemi)
    1. Tamamen antifriz çıkarmak için (10 dakika her biri için oda sıcaklığında, 5 kez, 4 ° C'de bir kez O / N), TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın.
    2. Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için TBS-T içinde% 1.5 H2O 2 30 dakika boyunca inkübe edin. Köpüren dikkat ve gerekirse bölümleri-daldırın yeniden. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    3. İsteğe bağlı: Bu arada, bir ısıtma kabini ve 37 ° C'de 2 N HCI ısıtın. DNA'yı denatüre etmek için 2 N HCI içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca bölümler inkübe edin. Bir fırça yardımıyla hafifçe ayrı bölümler.
    4. İsteğe bağlı: 0.1 M borat tamponu pH 10 dakika boyunca bölümler nötralize8.5, RT. Transfer ederken, kısaca HCI artıkları çıkarmak için kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler çubukla. 15 dakika her biri için TBS 2 kez durulayın.
    5. Doku geçirgenliği ve spesifik bir antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat bloke TBSplus inkübe edin.
    6. 4 ° C'de TBSplus O / N seyreltilmiş primer antikor içinde inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    7. TBSplus, oda sıcaklığında 3 saat içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor olarak inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. Bu arada ...
    8. Üreticinin protokolü (TBS-T içinde% 1 a + 1,% B) işlemine göre, ABC kompleksi hazırlanır. Kullanmadan önce, oda sıcaklığında 30 dakika için beklemeye bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat için AB reaktif bölümleri inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    9. Sırasıyla iki yarım ve pipet 4 ml ya da 2 ml oyuk başına bölünmüş, 6 ya da 12 oyuklu plaka başına, TBS-T içinde 50 mi, 0.5 mg / ml DAB hazırlayın. DAB çözeltisi (DİKKAT içine Transferi bölümler! DAB toksiktir. Specifi izleyinc yani, laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek, tedarikçi tarafından sağlanan MSDS) kimyasal davlumbaz kullanın.
    10. Iyi peroksidaz reaksiyonu başlatmak için her yukarıdaki gibi, geriye kalan 25 ml DAB çözeltisine 0.5 ml% 1 H 2 O 2 ekleyin karıştırın ve pipet eşdeğer birimler. 12 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    11. Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Kalıcı montaj orta ile lamel.
    12. İsteğe bağlı: lamel yerleştirmeden önce Counterstain (bakınız bölüm 3.5).
      Not: bir sinyal-gürültü oranı olduğundan, yüksek bir arka plan ve düşük ise, AB reaktifi (aşama 3.1.8) ile inkübasyondan sonra H2O 2 tedavi tekrarlayın.
  2. Çoklu-immunofloresans
    1. Tek veya aynı anda çoklu immunofloresans
      1. TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın (4 ° C'de bir kez O / N, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 5 kez her biri) tamamen bir kaldırmatifreeze.
      2. İsteğe bağlı: 3.1.3 adımları olarak - 3.1.4.
      3. Spesifik olmayan antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat doku geçirgenliği ve engellemek için TBSplus inkübe edin.
      4. Birincil antikor kokteyli inkübe (örneğin, sıçan α-BrdU, kobay-DCX α, keçi α-GFP), 4 ° C'de TBSplus O / N seyreltilmiştir. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
      5. Florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli inkübe (örneğin, Rodamin Kırmızı α-sıçan, Alexa-647 α-kobay, Alexa-488 α-keçi, tüm eşek türetilmiş), TBSplus içinde seyreltilmiş 3 saat RT veya O / N at 4 ° C'de ilave edildi. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
      6. Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Sulu yapıştırma vasatı ile lamel.
    2. Aynı konak türünden primer antikorlar ile sıralı çoklu immunofloresans
      1. 3.2.1.3 - 3.2.1.1 adımları gibi.
      2. Fi inkübeilk birincil antikor (ör tavşan α-antijen A), O / N 4 ° C'de ilave edildi. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. İlk florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Rodamin kırmızı geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      4. İlk ikincil antikor açık paratoplar doyurmak için 3 saat oda sıcaklığında birincil antikorlar aynı ana (örneğin, tavşan serumu) den% 10 normal serum içinde inkübe. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      5. 50 ug (örn α-tavşan IgG (H + L)), ikinci ikincil antikor, O / N oranında tarafından kabul edilebilir epitoplarını kapsayan birincil antikor konak karşı / ml birleşmemiş tek değerli Fab fragmanları ile TBSplus inkübe 4 ° C.
      6. 10 dakika her biri için TBS-T içinde en az 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. Transfer ederken, kısaca swab kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler herhangi Fab artıkları çıkarmak için.
      7. 4 ° C 'de, ikinci birincil antikor (ör tavşan α-antijen B) O / N inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      8. İkinci florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Alexa 488-geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
        NOT: Farklı konak türler ekleyebilirsiniz gelen antikorlar ile antijenleri etiketlemek için 3.2.2.2 adıma ve ilgili ikincil antikorlar 3.2.2.3 adıma.
    3. Primer antikor olarak aynı türden ikincil antikor bir
      NOT: Bu protokol, GFAP, Nestin-GFP ve DCX birlikte BrdU veya Ki67 karşı dörtlü-boyama için uygundur.
      1. 3.2.1.5 - 3.2.1.1 izleyin kesinlikle protokol adımları. Bu noktaya kadar TBSplus tek eşek serumu kullanın.
      2. T inkübeOda sıcaklığında 1 saat süre ile% 3 keçi serumu ihtiva eden BSplus. Bu α-keçi sekonder antikor açık paratoplar kapsar. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. AMCA-conj inkübe edin. TBSplus, 3 saat oda sıcaklığında veya O / N 4 ° C'de seyreltilmiş keçi α-tavşan. 15 dakika her biri için TBS içinde üç kez yıkayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
    4. CldU, DUK ortak boyama
      1. , Durulayın denatüre ve bölüm 3.2.1 de açıklandığı gibi bölümleri nötralize (- 3.2.1.2 3.2.1.1 adımları).
      2. Α-fare TBSplus IgG (H + L), oda sıcaklığında 1 saat 20 ug / ml birleşmemiş Fab fragmanları kuluçkalayın. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. 4 ° C'de TBSplus O / N sulandırılmış ve fare α-BrdU (350 1); (IgG2 arıtıldı 400 1), sıçan α-BrdU içeren birincil antikor kokteyli içinde inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      4. Biyotinlenmiş eşek içeren ikincil antikor kokteyli inkübe α-sıçan (1: 500) ve FITC-geçidi. eşek α-fare Fab fragmanları (1: 100). 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      5. Rodamin Kırmızı conj inkübe edin. Streptavidin, oda sıcaklığında 2 saat. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
    5. Nestin-GFP farelerde, floresan sinyalinin amplifıkasyonu
      1. Primer antikor kokteyli keçi α-GFP ekleyin.
      2. (. Bu tür Alexa 488 conj olarak α-keçi eşek) GFP benzer spektral özelliklere sahip bir florokrom konjuge sekonder antikor ekle ikincil antikor kokteyl.
  3. Epitop alma
    1. Antifriz dışarı durulama sonra epitop alma yürütmek. 99 ° C (yaklaşık 25 dakika) - 0.1 M sitrat tamponu pH 6,0-95 içeren 6- veya 12-yuvalı plakalar ile ön ısıtma gemi.
    2. (30 dakika boyunca sıcak sitrat tamponu ve buhar haline bölümleri transfer plastik l alüminyum folyo ile plakaları kaplamakkimlikleri ısıya dayanıklı değildir).
    3. Hemen soğumaya bir buz banyosu içinde plaka yerleştirin. Bu doğum sonrası hayvanların beyin kesitleri ile çalışırken özellikle önemli olan doku morfolojisi, korumaya yardımcı olur.
    4. Yıkayın ve sitrat nötralize ve boyama devam etmek 10 dakika her TBS 3 kez durulayın.
  4. Fare fare doku üzerinde antikorların
    1. -Α fare IgG 20 ug / ml tek değerli Fab fragmanları ekleyin (H + L ikincil antikor ile aynı ana-türleri), ilk blokaj aşama (örneğin, aşama 3.1.5 ya da 3.2.1.3).
    2. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın ve ilgili protokol ile devam edin.
  5. Cresyl menekşe counterstaining
    1. (Cam kavanoz içinde) 60 ° C'ye kadar ön ısıtma kresil menekşe rengi solüsyon. 3 dakika boyunca sıcak çözeltiye slaytlar inkübe edin.
    2. Sulu içinde durulayın. dest. ve% 70 oranında 1 dakika her biri,% 96 ve% 100 izopropanol 2 kez kurutmak.
      3. 6 ksilen dakika veya uyumlu kalıcı montaj ortamı ile bir ksilen yerine ve lamel - 5 için Clear.

4. Veri Analizi

  1. Kıvrımlarının tüm rostro ölçüde boyunca her 6 th bölümünde peroksidaz lekeli yenidoğan hücreleri saymak. 400X büyütmede ışık mikroskobu kullanın.
  2. Yenidoğan hücrelerin toplam sayısının bir tahmin elde etmek kavşak aralığı ile sonuçlanan hücre sayıları çarpın.
  3. Görüntü floresan uygun lazerler ve filtre sistemleri ile donatılmış bir konfokal lazer mikroskobu ile bölümleri etiketli. 400X büyütmede kıvrımlarının tüm genişliği boyunca herhangi bir konumda görüntü yığınlarını alın ve diğer belirteçler ile birlikte etiketleme için, hemisfer başına ilgi dahilindeki en az 50 rastgele seçilmiş hücrelerin analiz eder.
  4. Mutlak hesaplamak için yeni doğan hücrelerin toplam sayısı ile birlikte etiketlenmiş hücreler (/% 100) elde edilen yüzdeler çarpınBelirli yenidoğan hücre popülasyonlarının sayıları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ölçmek ve doğum sonrası ve yetişkin hipokampus yenidoğan hücreleri karakterize etmek yukarıda açıklanan yöntemleri uygulamalı. Bu nedenle, vahşi tip ve nöron-eksikli siklin D2 nöron oranı (yani, zenginleştirilmiş bir ortam, EE) 13,14 etkilediği bilinen koşullar altında muhafaza (Ccnd2 KO) fareler nakavt kullanılır. Ki67, BrdU, CldU veya DUK ya karşı immünohistokimyasal DAB boyama sürekli yabanitipte ve Ccnd2 KO farelerde (Şekil 3) 15 arasında yenidoğa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kantifikasyon ve yenidoğan hücrelerin alt popülasyonlarının belirlenmesi yetişkin nöron araştırma merkezi konudur. Yetişkin nöron spesifik aşamalarında ifade proteinlere karşı çoğalma belirteçleri ve antikorlar birleştiren bu alt popülasyonlar immünohistokimyasal algılanmasını sağlar. Antikorlar ya da antikor kombinasyonlarının bazı spesifik boyama koşulları gerektirir.

Sentetik timidin analogları ile hücrelerin bölünmesi Etiketleme hala yetişkin hipokampal nöron eğitimi için altın standartt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mükemmel teknik yardım için S. Tausch'a teşekkür eder. Çalışma BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) ve DFG (FOR1738) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Timidin analog uygulaması
5-Bromo-2′-deoksiuridin, BrdUSigma-AldrichB9285toksik (mutajenik, teratojenik)
5-Kloro-2&prim;-deoksiuridin, CldUSigma-AldrichC6891toksik (mutajenik, teratojenik)
5-Kloro-2&prim;-deoksiuridin, CldUMP Biyomedikal2105478toksik (mutajenik, teratojenik)
5-İyodo-2&prim;-deoksiuridin, IdUMP Biyomedikal2100357toksik (mutajenik, teratojenik)
Doku hazırlama
İzofluran-ActavisPiramal Sağlık 700211
Paraformaldehit tozu (PFA)Riedel-De Hä EN16005Toksik, yanıcı
Perfüzyon pompası PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Masterflex Tygon laboratuvar hortumu, & Oslash; 0,8 mmThermo Fischer Scientific06409-13
Besleme iğnesi, düz, 21 G, 1,75 mm zeytin ucu, 40 mmAgnthos1036
Donma mikrotomu Mikrom HM 400Thermo Fischer Scientific
24 oyuklu Hücre kültürü çok kuyulu plakalarGreiner Bio-One662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine buharlı pişiriciTefalVS 4001
Netwell 24 mm polyester örgü membran eklerCorning34796 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell 15 mm polyester örgü membran eklerCorning347712 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell plastik 6 kuyulu taşıyıcı kit24 mm polyester örgü membran ekler içinCorning3521
Netwell plastik 12 kuyulu taşıyıcı kitCorning352015 mm polyester örgü membran ekler için
Vectastain Elite ABC kitiVektör LaboratuvarlarıPK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat)Sigma-AldrichD-5637kanserojen, ışığa duyarlı
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Tavşan IgG1 &>Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; epitop alımı gerektirir
Tavşan α-GFAP, AS-3-GFSinaptik Sistemler173 0021:500
Keçi IgG (H+L) &alfa;-GFPAcris AntikorlarıR1091P1:300
Fare IgG1 α-nestinAbcamab61421:200; epitop alımı gerektirir
Gine domuzu IgG (H + L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Sıçan IgG2a α- BrdU'nun tespiti için BrdU (asitler)AbD Serotec / Bio-RadOBT0030CX; DAB 1:500/IF 1:400
Sıçan IgG2a α-BrdU (saflaştırılmış)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   CldU'nun tespiti için; DAB 1:500/IF 1:250-400
Fare IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
fare IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580IdU'nun tespiti için; DAB 1:500/IF 1:350
İkincil antikorlar
Eşek &alfa;-kobay IgG (H+L)-BiotinDianova711-065-1521:500
Eşek &alfa;-sıçan IgG (H+L)-BiotinDianova712-065-1501:500
Eşek &alfa;-fare IgG (H+L)-BiotinDianova715-065-1511:500
Keçi α-sıçan IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Moleküler ProblarA110061:250
Eşek α-keçi IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Moleküler ProblarA110551:250
Eşek α-fare IgG (H+L)-FITC, Fab-FragmentDianova715-097-0031:100
Eşek α-fare IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
Eşek α-kobay IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
Eşek α-sıçan IgG (H+L)-Rhodamine Red-XDianova712-295-1501:250 Eşek
α-tavşan IgG (H+L)-Rhodamine Red-XDianova711-295-1521:250
Eşek α-kobay IgG (H+L)-Rhodamine Red-XDianova706-296-1481:250
Streptavidin-rhodamine Red-XDianova016-290-0841:500
Keçi α-tavşan IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, yalnızca tavşan &alpha ile çalışır;-GFAP
Hoechst 33342Moleküler ProblarH35701:1000
DAPIMoleküler ProblarD13061:1000
Blocking
Fab-parça eşek α-fare IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab-parça eşek α-tavşan IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
Normal eşek serumuMerck MilliporeS30
Normal tavşan serumuDianova011-000-010
Normal keçi serumuDianova005-000-001
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7906
Histology
Cresyl menekşeSigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843toksik olmayan ksilen ikamesi
Neo-MountMerck Millipore109016kalıcı montaj ortamı
Mikroskopi
Aksiyoskop 2Carl Zeiss Mikroskobu
LSM 710Carl Zeiss Mikroskobu
, , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S ral mm nofloresanTimidin Analo uDoku lemeKonfokal MikroskopiH cre Say mKonak T r AntikorlarN ral Progenit r H creler

İlgili makaleler