Yöntem makalesi

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

DOI:

10.3791/52567

⸱

31 Mart 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, mozaik transgenez stratejisinin, in vivo olarak tümör başlangıcı ve ilerlemesinde çoklu onkogenlerin göreceli katkılarını hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirmek için zebra balıklarında nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsamlı genomik analiz, çeşitli kanser türlerinde şaşırtıcı derecede çok sayıda genetik değişiklik ortaya çıkarmıştır. Bu tümörler arasındaki onkojenik "itici güçleri" sağlam ve verimli bir şekilde tanımlamak ve tümör patogenezi sırasında eşzamanlı genetik değişikliklerle karmaşık ilişkilerini tanımlamak göz korkutucu bir görev olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, zebra balığı, büyük ölçüde bakım kolaylığı, yüksek doğurganlık, in vivo görüntüleme için bariz avantajlar, onkogenlerin ve moleküler yolaklarının yüksek korunması, tümör oluşumuna duyarlılık ve en önemlisi, balıklarda kullanıma uygun transgenik tekniklerin mevcudiyeti nedeniyle, insan hastalıklarını incelemek için önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Transgenik zebra balığı kanser modelleri, çeşitli tümör tiplerinde onkojenik yolları incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, stabil bir transgenik balık modeli geliştirmek hem sıkıcı hem de zaman alıcıdır ve bu yaklaşımı kullanarak hastalık patogenezinde birden fazla genin işbirliğini incelemek daha da zor ve daha zaman alıcıdır, bu da ilgilenilen bireysel genlerin aşırı ekspresyonu ile çoklu transgenik hatların oluşturulmasını ve ardından bu stabil transgenik hatların karmaşık bir şekilde üremesini gerektirir. Bu nedenle, zebra balıklarında mozaik geçici transgenik bir yaklaşımın kullanılması, in vivo fonksiyonel genomik analiz için benzersiz avantajlar sunar. Kısaca, aday transgenler, tek hücreli aşamalı vahşi tip veya transgenik zebra balığı embriyolarına birlikte enjekte edilebilir ve aynı öncelikle enjekte edilen hayvanda karışık genotiplere yol açan mozaik bir modelde her bir somatik hücreye entegre olmalarına izin verilebilir. Bu, aday genlerin tümör oluşumunu sağlamak için birbirleriyle işbirliği yapıp yapamayacaklarını ve nasıl işbirliği yapabileceklerini daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde araştırmaya izin verir. MYCN'yi aşırı eksprese eden transgenik balıklarda aktive ALK'nın geçici aşırı ekspresyonu ile, burada bu iki onkogenin pediatrik bir kanser olan nöroblastomun patogenezinde işbirliğini gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanserler zamanla patolojik mutasyonlar, silmeler ve kromozom kazançları birikimi ile işaretlenmiş ilerici hastalıklardır. Bu genetik anormallikler, hipoksi gibi yanıtları stres hücre iskeletinin hücre döngüsü, hücre ölümü, enerji metabolizmasında ve montaj kadar çok sayıda hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu nedenle, tümörigenezin biyolojik süreçlerin bir yelpazede çok sayıda genetik bozuklukların kolektif eylemleri yansıtır. Tüm genom dizileme, exome sıralanması, hedeflenen sıralama, derin sıralama ve genom dernek çalışmaları da dahil olmak üzere son bütünleştirici genomik araştırma çabaları, tümörlerin 1-4 esasen her türlü yeni genetik değişikliklerin giderek artan sayıda belirledik. Birçok durumda, genetik lezyonlar hastalığın patogenezinde işbirliğini düşündüren, bir rastgele olmayan bir şekilde 5-8 birlikte görülür. F Elde edilen anormal ifade edilen genlerin büyük bir dizi onkojenik rolleri KesmeBu genomik lezyonları rom, yeni tedavi stratejileri hazırlamak ve bu ajanların tümör hücrelerinin tepkilerini anlamak için gerekli, ancak bu yüksek verimli fonksiyonel genomik analiz yürütülmesinde çok sağlam hayvan modeli sistemleri gerektiren, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır vivo.

Memeliler, özellikle kemirgenler, kanser biyolojisinde tercih modeller olmasına rağmen, Zebra balığı büyük ilgi çekmek için başlamıştır. Teleost zebra balığı (Dario rerio) 1960 yılından bu yana gelişim incelemesi için bir model organizma olarak kullanılmaktadır ve birinci 1982 9-11 tümör patojenez çalışma uygulanmıştır. Bakım, küçük vücut büyüklüğü ve yüksek doğurganlık kolaylığı Zebra balığı anormal ve patolojik fenotipleri 10 görüşmek mutasyonları tespit etmek büyük ölçekli ileri genetik ekranlar için sağlam bir model olun. Zebra balığı embriyolarının optik şeffaflık gibi, bu kanser modelinin daha geniş kullanımını destekleyen bir başka önemli özelliğiBu, gerçek zamanlı 9, kemirgen 12 nispeten zor bir uygulama, tümör gelişmesini bulmak için yapılacak in vivo görüntüleme sağlar. Zebra balığı referans genom (Zv9) son karşılaştırmalı genomik analiz,% 71% 82 Man (OMIM) veritabanında 13 Online Mendel Kalıtım hastalıkla ilişkili genleri ile ilişkili olan insan ortologlara, sahip, 26.206 protein kodlama genleri ortaya 14. Sonuç olarak, Zebra balığı nöroblastom 8 dahil olmak üzere insan kanserlerinin farklı tipleri, modellemek için kullanılır olmuştur, T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewing sarkomu 19, rabdomiyosarkoma 20,21, pankreas karsinomu 22, hepatoselüler karsinom 23 ve miyeloid 24,25 malignitesinin ve Ksenonakilden bir kanser modeli 11,26 çalışmalar olarak seçilmiştir.

Stabil bir transgenikZebra balığı yaklaşım yaygın kazanç fonksiyon-normal gelişimi veya hastalık patogenezinde 27,28 genlerin etkisini incelemek için kullanılır. Bu tip bir model (Şekil 1A) geliştirmek için, bir tek hücreli vahşi tip embriyolara bir doku spesifik promotör tarafından sürülen ilgili geni içeren bir DNA yapısı enjekte eder. Enjekte embriyolar cinsel olgunluğa ulaştığında Üç dört ay enjeksiyondan sonra, onlar kurucu balık olarak lisansları onların germline içinde inşa DNA entegrasyonu gösteren olanlar için ekrana vahşi tip balık çaprazlanırlar. Bu tür kopya sayısına ve transgen entegrasyonu alanı olarak bir çok faktör, kararlı transgenik hatlarda transjenin ekspresyonunu etkilemektedir. Bu nedenle, transgenik bir tümör modeli geliştirmek için, tek bir onkojenini aşırı ifade çok kararlı transgenik çizgiler, ilk oluşturulan ve tümör indüksiyonu yol açacak bir seviyede transgen ifade hattı için taranması gerekecektir. Fakat, eğer bir aday o aşırı ekspresyonuncogene germ hücreleri için toksik olan, doğrudan transgen 29 aşırı eksprese eden stabil bir transgenik çizgiden üretmek zordur. Dolayısıyla, bu yaklaşım uygun bir kanser modeli oluşturmak için başarısızlık riski yüksek olan, zaman alıcı olabilir.

Burada, in vivo fonksiyonel genomik çalışma için geleneksel sabit transgenesis benzersiz avantajlar sağlamaktadır mozaik geçici transgenezi (Şekil 1B) dayalı bir alternatif strateji göstermektedir. Bu yaklaşımda, bir veya daha fazla transgen yapıları transgenik ya da vahşi türdeki embriyo tek hücreli aşamada enjekte edilir. transgenleri ihtiva eden enjekte DNA yapıları, tek tek balık 30, çok hücreli bir popülasyon içindeki karıştırılmış genotipler ile sonuçlanan, daha sonra mosaically rastgele primer enjekte balık entegredir. Ayrıca, birden fazla DNA ko-enjeksiyon tek hücreli embriyolar yapıları birlikte entegrasyon rasgele sitelerde aynı hücreye, Tra için izin açarTransjenlerin hücreleri ce ve mozaik hayvanlarda 31 hastalık patogenezi sırasında farklı genlerin etkileşimi keşfetmek. Prensip kanıtı olarak, geçici olarak doğal tipte balık ve MYCN ifade eden transjenik balık dopamin beta hidroksilaz (d βh) promoteri kontrolü altında, periferal simpatetik sinir sistemi (PSNS) 'de MCherry raportör geni ile mutationally aktive ALK (F1174L) aşın. bir reseptör tirosin kinazını kodlamaktadır ALK, yüksek riskli nöroblastom 5-7,32,33 de en sık mutasyona genidir. ALK en yaygın ve potansiyel somatik aktive mutasyonlar olarak (F1174L), temsil edilen aşırı bir MYCN- yüksek riskli hastalar nöroblastom büyütülmüş ve stabil bir transgenik fareler ve transjenik zebra balığı model 8,34,35 hem de nöroblastom tümörogenez hızlandırmak için MYCN aşırı ekspresyonu ile sinerjize etmektedir. Mozaik tarafındanMYCN transgenik balık mCherry ile ALK (F1174L) geçici olarak aşın, mozaik transgenezi stratejisi için hızlı ve etkili bir şekilde kullanılabileceğini düşündüren, ALK (F1174L) ve MYCN hem aşırı ifade eden stabil transgenik balık gözlemlenen tümör başlangıç ​​ivme değinmeyecek in vivo tümör başlatılması birden onkojenlerin göreceli katkıları değerlendirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: tüm zebra balığı çalışmalar ve hayvan bakımı Mayo Kliniği Enstitüsü, IACUC onaylı protokol # A41213 ile uygun olarak yapılmıştır.

Transgenesis 1. DNA konstruktları

  1. Bir DNA şablonu olarak (BACPAC kaynakları merkezine (BPRC) 'den) CH211-270H11 BAC klonu kullanılarak bir 5.2 kb dopamin beta hidroksilaz (d βh) promotör bölgesini 8 yükseltin. 2 dakika için 94 ° C, (94 ° C, 15 saniye, 50 ° C, 10 döngü 30 saniye 68 °: Uzun DNA şablonları ve uzun doğru PCR amplifikasyonu için bir PCR sistemi uygun ve PCR için aşağıdaki döngü programları kullanarak (94 ° C, 15 saniye, 53 ° C, 30 saniye, 68 ° C'de, 8 dakika), 68 ° C, 4 dakika (ileri doğru primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ', 30 devir ile takip olunan Cı, 8 dakika), ve ters primer 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. D βh -pDONRP4-P1R giriş clo oluşturne 8 gibi çoklu ağ geçidi gibi ticari rekombinant klonlama sistemi kullanılarak. Saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R donör vektörü 1 ul karıştırın (diğer ağ geçidi vektörleri Dr. Chi-Bin Chien, Univ cömert hediyeler birlikte. Utah) TE tamponu (pH 8.0), BP Clonase enzim karışımı 2 ul 4 ul, 25 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra bir sut TOP10 yeterli E. transform E. coli, üreticinin protokolüne göre yöntem.
  3. Oluştur d βh: EGFP-MYCN transgenik adım 1.2'de belirtilen 8 kullanarak rekombinant klonlama sistemi inşa. Her giriş klonunun 1 ul bir 5.2 kb dβh promoteri (dβh -pDONR P4-P1R yapısı), EGFP bir durdurma kodonu (pME-EGFP yapısı) eksik de dahil olmak üzere (150 ng / ml) ve insan MYCN cDNA karıştırın (cömert bir hediye Dr. Hogarty adlı Pennsylvania Çocuk Hastanesi'nde, MYCN-pDONRP2R-P3 yapı), 1 ul bir I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) 'dan cömert bir hediye, TE tamponu 4 ul ihtiva eden tadil edilmiş hedef vektörünün (150 ng / | il), ( LR Clonase enzim karışımı 2 ul pH 8.0) içinde, 25 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra transforme kimyasal olarak yetkili E. E. coli gibi bir atış ilk 10 ve üreticinin protokolünü takip ediniz.
  4. MITF edin: MITF transgenik PNP-MITF vektör sindirilmesi ile 8 inşa Notl ve SalI kısıtlama enzimleri ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında ve serbest 2.65-kb alt-klonlanmasıyla (Dr. D. Raible, Univ cömert bir hediye Washington). MITF promotörünü ve çevreleyici bir I-SceI tanıma sitesi ihtiva eden bir tadil edilmiş pBluescript vektörü Notl ve Mlul mevkilerine zebra balığı MITF genin kodlama dizisini ihtiva eden bir DNA fragmanı (Dr. Hui Fe cömert bir hediyeng, Boston Üniversitesi) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır.
    NOT: stabil MYCN -expressing hatları üreten verimliliğini artırmak için d βh: EGFP-MYCN ve MITF:. MITF DNA yapıları tek hücreli aşamada sedef embriyolara birlikte enjekte edilir Sedef nöral eksik mutant balık türü belirler tepe-türetilmiş gelişim sırasında 36 melanofor. Böylece, enjekte edilen embriyolar pigment hücrelerinin görünümü MITF entegrasyonu önerir: MITF DNA genomuna oluşturur. Bu iki ya da üç birlikte enjekte DNA yapıları, balık genomuna 31 içine ko-entegre edilebilir gösterilmiştir. EGFP-MYCN transgen ve MYCN stabil bir transgenik çizgiden daha kolay tanımlama için: Bu nedenle, MITF sentezlenmesinin neden pigmentasyon dβh entegrasyonu için markör olarak görev yapabilir.
  5. EGFP-MYCN ve MITF: d βh Mix MITF DNAI-SceI enzim 1 ul tampon maddesi ve 0.75 ul bir 15 ul reaksiyon toplam hacim içinde: 1 oranında 3 de yapıları. Reaksiyonda DNA toplam tutarı 750 ng geçmemesi emin olun.
  6. 4 saat veya O / N için oda sıcaklığında I-SceI sindirimi yürütmek. İkinci günde,-SceI- DNA'lar mikroenjeksiyon için hazır olan veya ileride enjeksiyon için -20 ° C 'de muhafaza edilebilir dijeste edilmiştir. Bunu, enzim etkinliğini korumak için küçük kısımlar halinde, -80 ° C'de bir I-SceI enzim saklayın.
  7. Dr. C. GRABHER (a cömert bir hediye bir pENTRY1A vektörünün EcoRI ve Notl mevkilerine pcDNA3 vektörü insan ALKF1174L ve vahşi tip ALK gen (Dana Farber Kanser Enstitüsü'nde Dr. George cömert bir hediye) 7-klonlanmıştır, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır.
  8. D βh oluşturun: ALKF1174L </ Em> veya dβh: Protokolü 1.2 belirtildiği gibi rekombinant sistemini kullanarak ALKWT transgenik yapıları. Kısaca, üç giriş klonlar birleştirmek dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (veya ALKWT -pENTRY1A) ve P3E- poliA, I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe cömert bir hediye içeren değiştirilmiş hedef vektörüne Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre, LR Clonase enzim karışımı kullanılmıştır.
  9. Karıştırın d βh: ALKF1174L (veya dβh: ALKWT) ve dβh: MCherry DNA 3'te oluşturur: 1 oranında PROTOKOL 1,5-1,6 tarif edildiği gibi I-SceI enzim ile linearize.

2. Mikroenjeksiyon

  1. Tüm enjeksiyonlar 37 için, 1.0 mm çaplı cam mikropipetler kullanın. Enjeksiyondan önce bir jilet ile cam mikropipetlerin ucunu kırın. Inject enjeksiyon hacmi kalibremineral yağı, bir damla halinde H2O ing. Elde edilen damlacıkların çapı ölçülür ve enjeksiyon hacmi bir hücre aşamasında embriyoların toplam hücre hacminin% 10'undan daha az olmasını sağlamak için mikroenjektör (basınç ya da basınç palsının süresini) ayarlayın.
  2. DNA ihtiva eden enjeksiyon çözeltisi, 5 ul taze bir I-SceI enzim (5 ünite / ul) ilave 0.5 ul ekle enjeksiyon transgenesis 38 etkinliğini arttırmak için hemen önce oluşturur. Tek hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına Doğrusal hale getirilen DNA yapıları 50-80 pg enjekte edilir. Enjeksiyon başarısını sağlamak için, görselleştirme için% 0.25 fenol kırmızısı ile örnek karıştırın. Hücreler enjeksiyondan sonra kırmızı açarsanız, bu mikroenjeksiyon başarılı olduğunu gösterir. Transgenik balık üretmek için yüksek bir başarı oranı sağlamak için, biz genellikle 500 kadar embriyolar enjekte.
  3. EGFP-MYC: stabil MYCN sentezleyen transgenik balık oluşturmak için, çizgiselleştirilmiş d βh birlikte enjekteK ve MITF: MITF DNA yapıları, (3: 1 oranında), bir hücre aşamasında pigmentasyon mutan sedef zebrabalıkları embriyolara. MITF ifadesi balık genomunda transgenik yapıların entegrasyonu için bir muhabir olarak hizmet vermektedir.
  4. Dβh ile; ALK F1174L (ALKWT veya dβh:): yabani tipte veya MYCN transgenik embriyolar ALK mozaik aşırı ekspresyonu için, doğrusallaştırılmış d βh birlikte enjekte bir hücreye: MCherry DNA (1 oranında 3 de) oluşturur vahşi tip AB balık ile transgenik balık: F1 heterozigot Tg (EGFP-MYCN dβh) olarak ıslah kaynaklanan embriyolar. Bu nedenle, yavru yarısı MCYN için transgenik olan ve yarı vahşi tip bulunmaktadır.

Kararlı ya da Mozaik Transgenik balık için 3. Ekran

  1. Tricaine (% 0,02) bir öncelikli olarak enjekte sedef embriyolar anestezi stabil MYCN -expressing hatlarının tespiti verimini arttırmakT gün pigmentasyon postfertilization ve ekranın 3-5. Germ hücreleri EGFP-MYCN transgenini: d βh taşıyan kurucu balık için daha fazla tarama için cinsel olgunluk onları taze yumurta su ile yeni bir petri pigmentasyon ile embriyolar transfer ve yükseltmek.
  2. EGFP-MYCN, daha genotiplemede için 1-2 gün sonrası döllenme de EGFP-pozitif embriyolar için yabani tip AB balık ve ekran outcross pigmentli F0 yetişkin balık germ iletimi ile kurucusu tanımlamak için. PCR tüp içine tek bir EGFP-pozitif F1 embriyo yerleştirin ve tüm sıvı çıkarın. 4x liziz tamponu 12.5 ul, 35 ul H2O ve 2.5 | il proteinaz K tek embriyo (10 mg / ml) içeren gDNA ekstraksiyon tamponu 50 ul ekle. 4x liziz tamponu içinde 50 ml yapmak için K proteinaz inaktif için 98ºC inkübasyondan 10 dakika, ardından 55 ° C'de 2-3 saat boyunca reaksiyonu, inkübe 1 M Tris, 500 ul (pH 8.4), 2.5 mL 1 M KCI tH 2 O o 47 ml NOT: F0 MYCN istikrarlı transgenik balık vahşi tip AB balık ile yetiştirilen sonra, yavruların hepsi pigmentli bulunmaktadır. Böylece, pigmentasyon MYCN- olumlu balık belirlenmesi için işaretleyici olarak hizmet edemez. MYCN transgenik balık iken, EGFP-MYCN füzyon proteini gibi ve soğanilikteki gibi üstün servikal ganglionlar ve sempatik zincirin sıralı segmental ganglion ve non-PSNS dopaminerjik nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak üzere, PSNS ifade edilir kranial ganglion 8. Bu nedenle, EGFP ekspresyonu MYCN kararlı transgenik embriyo tanımlanması için bir markör olarak görev yapabilir.
  3. Şablon olarak pigmentli F1 embriyo ekstre gDNA 2 ul kullanarak MYCN primerleri -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 've aşağıdaki program zekâh GC açısından zengin bir PCR Sistemi: 3 dakika için 95 ° C'lik 1 döngü, 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye için 58 ° C ve 3 dakika için 72 ° C. Genellikle, pigmentli embriyolar entegre MYCN transgenin varlığı MITF ve MYCN aşırı ifade fazla 6 kurucu balık bu yöntem ile belirlenmiştir emin olmak için tek eşleşme gelen 14-16 pigmentli embriyolar genotiplemesi.
  4. EGFP-pozitif F1 embriyoların kalanını kadar kaldırın. Fin klip ayrıca balık içine MYCN transgen entegrasyonu onaylamak için yukarıdaki protokolü kullanılarak yaş 2-3 ay onları Genotip ve. F1 MYCN vahşi tip AB balık ile stabil transgenik balık Breed. ALK F1174L (veya dβh: ALKWT) dβh ile: doğrusallaştırılmış d βh Co-enjekte PROTOKOL 2.4 açıklandığı gibi MCherry DNA tek hücreli embriyolara oluşturur.
  5. Sıralama deneyde embriyolar -expressing MYCN üç boyutlu bir flor kullanarak protokol 2.4 de tarifEscence mikroskop ve gün PSNS EGFP-MYCN ifadesi için postfertilization 1-3 öncelikle enjekte embriyolar ekran. Daha sonra, gün postfertilization 2-5 sırasında tricaine (% 0.02) ile embriyolar anestezi ve üç boyutlu bir floresan mikroskobu kullanılarak PSNS içinde mCherry sentezlenmesi göre yine bu MYCN- pozitif ya da negatif embriyolar sıralamak. mCherry sentezlenmesi mozaik birinci enjekte edilmiş hayvanların dokularında ALK birlikte ekspresyonuna için bir markör olarak görev yapar.
    Not: ALK F1174L ve dβh: mCherry, dβh: ALKWT ve dβh: mCherry veya dβh vahşi tip balık MYCN kararlı transgenik balık üretimi kaynaklanan ~ 600 yavru d βh de dahil olmak üzere, doğrusallaştırılmış DNA yapısı ile, grup başına enjekte edilmiştir : MCherry tek başına, sırasıyla. MCherry mozaik ifadesi öncelikle enjekte balık 70-90% olarak görülebilir. Bir buçuk, bir-Enjekte balık üçüncü tümör izlemek için larva aşamasında kurtuldu.
  6. MCherry + MYCN + ve mCherry + MYCN tüm toplamak - zebra balığı kitap 39, standart protokollere göre, embriyo ve 5 hafta postfertilization başlayarak tümör başlangıç ​​izler.

Mozaik Transgenik balık 4. Tümör İzle

  1. Tümör başlangıcı kanıtı için 5 hafta postfertilization başlayan her 2 hafta mCherry- pozitif öncelikle enjekte balık izleyin.
  2. MCherry varlığı için tricaine (% 0.02) ve ekranın balık anestezisi - ve EGFP dijital görme DS-U1 kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 stereoskopik flöresanlı mikroskop altında PSNS tümörlerin -expressing.
  3. Tümörler ALK transgen ifade olup olmadığını doğrulamak için, mCherry- ve ALK genotiplemesi PCR için EGFP-pozitif kitleleri izole.
  4. PCR kullanarak, genomik DNA'yı büyütmemiştirALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 've ALK P18: 5'-TGT CAG CTT GCT GAT GTT GC-3' ve aşağıdaki PCR reaksiyonu: 1 döngü, aşağıdaki primerler ile geliştirilen tümörleri ekstre 5 dakika boyunca 94 ° C, 30 döngü (30 saniye için 30 saniye için 94 ° C, 55 ° C ve 60 sn için 72 ° C). Daha sonra, sıra ALK P7 primeri ile PCR ürünü, bundan başka MCherry pozitif tümörlerde mutant veya yabani-tür ALK varlığını teyit etmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutationally aktif ALK F1174L veya vahşi tip ALK aşın nöroblastom indüklenmesinde MYCN ile işbirliği olup olmadığının araştırılması için, MYCN ifade eden transjenik balık PSNS d βh promoterinin kontrolü altında aktive edilmiş insan ALK ya da vahşi-tipli insan ALK ya aşın. ALKF1174L veya dβh - - aşağıdaki yapıları, dβh herhangi biri ALKWT, dβh ile birlikte enjekte edildi - mCherry tek hücreli, vahşi tip veya MY...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu temsili çalışmada, bu genler, belirgin bir şekilde bileşik kararlı transgenik balık coexpressing bizim önceki bulgusuyla tutarlıdır nöroblastom başlamasını hızlandırmak için işbirliği göstermek için transgenik balık -expressing MYCN içinde MCherry raportör geni ile geçici birlikte enjeksiyonu ve aktif ALK yakımının birlikte kullanılır Her iki ALK ve MYCN 8 aktif. Bu yöntem ile mozaik transgenik bir yaklaşım geleneksel bir yöntemle kıyasla birkaç ayrı avantaj sah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Jeong-Soo Lee'ye Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenik balığını çalışmamızda bizimle paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden 1K99CA178189-01 hibesi, Pablove Vakfı ve Yaşam için Arkadaşlar'dan bir burs ve Alex'in Limonata Standı Vakfı ve CureSearch for Children's Cancer Foundation'dan genç araştırmacı ödülleri ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Uzun Şablon PCR Sistemini Genişlet Roche Uygulamalı Bilimler,11681834001
pCR-TOPO vektörü Invitrogen, CA451641
T4 DNA ligazNew England Biolabs, MAM0202M
Ağ Geçidi LR Klonaz II enzim
Karışımı		Invitrogen, CA11791-100
Ağ Geçidi® BP Klonaz® II enzim karışımıInvitrogen, CA11789-020
GC ZENGİN PCR Sistemi Roche Uygulamalı Bilimler, IN12 140 306 001
Meganükleaz I-SceI New England Biolabs, MAR0694S
Nikon SMZ-1500 stereoskopik floresan mikroskobu Nikon, NY
Nikon dijital görüş DS-U1 fotoğraf makinesiNikon, NY

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179(2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191(2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230(2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25(2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mozaik TransgenezOnkojenik YolaklarTransgenik Zebrafish ModelleriGen A r EkspresyonuN roblastoma Modelin Vivo G r nt leme

İlgili makaleler