Yöntem makalesi

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

DOI:

10.3791/52584

⸱

12 Şubat 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atomik kuvvet mikroskobunu biyopanlama teknolojisi ile birlikte kullanarak, düşük konsantrasyonlarda bile herhangi bir biyolojik materyalde bulunan hastalığa özgü protein varyantlarına karşı antikorlar elde etmek için negatif ve pozitif bir biyopanlama sistemi oluşturduk. Amyotrofik Lateral Sklerozda rol oynayan TDP-43 protein varyantlarına karşı antikor elde etmede başarılı olduk.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein varyantları TDP-43 Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 'de, alfa-sinüklein de dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynadığı için, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı, beta-amiloid tau, bu morfoloji özel reaktifler seçici hedefleyebilir geliştirilmesi kritik bir öneme sahiptir Bu hastalığa özgü bir protein hastalık patolojisinde ve potansiyel diagnostik ve terapötik uygulamalar için bu varyantların rolünü incelemek için varyantları arasından seçilir. Burada özellikle hastalığa özgü protein varyantlarını tanıyan reaktifler izolasyonuna olanak veren, yeni atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) göre Bio belirleme yöntemleri geliştirmişlerdir. Süreç, negatif ve pozitif kaydırma aşamalarında alan iki önemli aşamaları vardır. Negatif kaydırma aşamasında, off-hedef antijenlere karşı reaktif olan fajlar özenle seçilmiş hedef dışı antijenleri bir dizi kullanarak Eksiltici kaydırma birden tur üzerinden elimine edilir. Negatif bir anahtar özelliğikaydırma faz sürecini izlemek ve tüm istenmeyen faj partikülleri kaldırılır onaylamak için AFM görüntüleme kullanmaktadır. Pozitif kaydırma fazı için, ilgi konusu hedef antijen, bir mika yüzeyi üzerinde sabit olan ve bağlanmış fajlar yıkanır ve seçici hedef antijene bağlanma fajlarından tespit etmek taranır. Eğer hedef protein varyantı uygun negatif kaydırma kontrol kullanılmıştır temin saflaştırılabilir gerek yoktur. Hatta pozitif kaydırma aşamada kullanılabilecektir karmaşık biyolojik malzemede çok düşük konsantrasyonlarda, sadece mevcut, protein varyantları hedef alır. Bu teknolojinin uygulanması sayesinde, seçici insan ALS beyin dokusunda bulunan TDP-43 protein varyantları antikorlar almıştır. Bu protokol, seçici olarak farklı biyolojik süreç ve hastalıkların çok çeşitli olan protein varyantları bağlanan üreten reaktifler için geçerli olmalıdır bekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

protein varyantlarının varlığı, Alzheimer, Parkinson, ALS ve frontotemporal demans (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 gibi nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok hastalığın ilerlemesinde bir faktör olarak implike edilmiştir , 10,11. Proteinler, beta-amiloid ve alfa-sinüklein oligomerik biçimleri, Alzheimer ve Parkinson sırasıyla 2,3,4,5 sorumlu toksik türler olduğu düşünülmektedir. TAR DNA-bağlama proteini 43 (TDP-43) agregalar ALS FTD 12,13,14 ile bağlantılı olmuştur. Bu nedenle seçici farklı protein varyantları olarak teşhis belirteçleri ve potansiyel terapötik hizmet güçlü araçlar olabilir hedefleyebilir antikorlar gibi reaktifler. Bu çalışmada, ancak bu yazıda anlatılan teknik prot geniş bir yelpazesine karşı reaktif izolasyonu için geçerli olmalıdır, seçici ALS implike TDP-43 protein varyantlarını bağlanan reaktif geliştirilmesi üzerine odaklanmıştırein varyantları arasından seçilir.

TDP-43 sitoplazmik yığılması ALS 15,16,17,18,19 patolojik özellik olarak tanımlanmıştır. Bu sitozol ve çekirdeği 15,17 arasında hareket eğilimi Tipik olarak TDP-43, normal bir bireyden alınan tüm hücre çekirdeğinde bulunur. TDP-43 Ancak, ALS toplanan formlar hastalığın ilerlemesi 16,20 sırasında sitoplazmaya çekirdekten TDP-43 hareketini düşündüren çekirdeğinde bulunan düşük konsantrasyonları ile seçin nöronların sitoplazmasında ve glia tespit edilir. TDP-43 toplama ALS vakalarının çoğunda bulunan iken, mutasyonlarla bağlantılı olan% 1, toplam ALS vakalarının (veya% 15 ailesel ALS vakalarının -20%) -2% beri tüm durumlar için hesap değil süperoksit dismutaz 1 (SOD1) gen 15,17. Çünkü ALS vakalarının büyük çoğunluğunda TDP-43 önemli rolü, burada seçici olan TDP-43 varyantları bağlanabilen bu antikor bazlı reaktifler geliştirmeye odaklanmakBizim yeni AFM tabanlı biopanning teknikleri kullanılarak insan ALS beyin dokusunda mevcut.

Başlangıçta biz antikor bağlanma etki çeşitli bir repertuar gerekir. Biz üç farklı faj gösterim tek zincir değişken alan antikor fragmanı (scFv'ler) kütüphaneleri, (Tomlinson I ve J ve Levhalar kütüphaneler 21) birleştirdi. kaydırma işlemi negatif ve pozitif kaydırma evreye ayrılır. Kütüphanelerden fajlar ilk olarak çok sayıda hedef dışı antijenleri hariç reaktif Enterobacteria fajı sırasında negatif bir geçişle işleme tabi tutulmaktadır. Her hedef dışı antijene karşı olumsuz her panlamadan tamamlanmasından sonra, süreç dışı hedef antijenleri bağlama tüm faj kaldırıldı emin olmak için AFM görüntüleme ile izlenir. Sadece tüm reaktif fajlar kaldırılır AFM görüntüleme ile doğruladıktan sonra bir sonraki hedefe geçin yoktur. ALS karışmış TDP-43 yönlerine karşı reaktifler izole etmek için aşağıdaki negatif kaydırma antijenler kullanılmıştır: 1), BSA zayıf ya da olmayan spesifik proteinlere bağlanan faj kaldırmak için; 2) toplu alfa-sinüklein toplu proteinlerin genel yapı elemanları bağlanan faj kaldırmak için; 3), insan beyin dokusu homojen halleri herhangi bir protein ya da sağlıklı bir insan beyin dokusunun ölüm sonrası örneklerdeki mevcut diğer bileşenlere bağlanan faj kaldırmak için; 4) Sağlıklı insan beyninin ile ilgili tüm TDP-43 formları bağlanan faj kaldırmak için sağlıklı insan beyninden TDP-43 immunoprecipitated; ve 5) TDP-43-olmayan ALS patoloji ile ilişkili TDP-43 türevleri bağlayan faj kaldırmak için FTD beyin homojenatlar izole immunoprecipitated. Tüm hedef dışı antijenlere karşı reaktif her faj çıkarılmasından sonra, daha sonra insan ALS beyin dokusundan imüno Bu durumda TDP-43, ilgi konusu antijen bağlayan antikor fragmanları izole edilmiştir sırasında pozitif kaydırma aşamasına ilerledi. Bu izole edilmiş antikorlar TDP-43 toplanan veya modifiye edilmiş formları, reaktif olabilir.

"> Geleneksel faj Bio belirleme pozitif kaydırma faz 22,23 üzerinde odaklanmıştır. Genellikle ilgi konusu hedef, immobilize edilmekte, faj kütüphanesi ilave edildi ve bağlanmış fajlar. Bu amplifikasyon ve kuluçka işlemi getirici fajlar daha sonra güçlendirilir. Yıkanır ve tekrar hedefe ilave Bu işlem varyasyonları, hedef antijenleri geniş bir karşı antikor reaktifleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, genellikle pozitif bağlanma faj yüzdesini arttırmak için birçok kez tekrarlanır., genel olarak, saflaştırılmış hedef antijenin 24,25,26 büyük miktarda gerektirir, Süreç, sadece hedef antijenin eser miktarda gerektirir, oysa. 27, burada tarif edilen protokol saflaştırma ve yatay kaydırma için gerek kalmadan çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olan seçici olarak bağlanan bir hedef antijene karşı doğrudan yapılabilir reaktifler izole etmek için de kullanılabilir Karmaşık doku örneklerinde antijen mevcut. ayrıntılı negatif kaydırma protokollerinin kullanımı doğrulanmadı gibiAFM ile arıtılmış, ya da zenginleştirilmemiş pozitif oldukları zaman antijene karşı izole edilen klonların selektif da hedef bağlanmasının sağlar.

Kasturirangan ve arkadaşları (2003) hedef 5 nanogram konsantrasyonu kullanılarak oligomerik beta-amiloid reaktif antikorları izole etmek için de benzer bir negatif ve pozitif Bio belirleme işlemini gerçekleştirmiştir. Burada seçici hastalığa spesifik protein, insan doku örnekleri doğrudan varyantları bağlama reaktiflerin nesil etkinleştirmek için bu süreci genişletin. Gelecekteki çalışmalarda daha da değil sadece burada izole reaktif tanısal değerini araştırmak değil, aynı zamanda ALS tedavisi için terapötik alaka değerlendirmek niyetinde.

Genel olarak, yeni ve AFM bazlı Bio belirleme teknolojisi, protein saflaştırma veya modifikasyonunu gerektirmeyen herhangi bir biyolojik madde içindeki bir hastalığa özgü bir protein değişkeni yalıtıldı için geçerli olmalıdır bile hedef antigen concentrations son derece düşüktür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Faj Üretim

  1. Bir biyogüvenlik kabini tüm faj üretim ve biopanning süreçlerini gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarını kullanarak biopanning işlemi için (21 kütüphane Tomlinson I ve J kütüphaneler ve Sheets) farklı kütüphaneden fajlar parçacıkları üretin (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    NOT: Biz mevcut antikorların çeşitliliğini artırmak için kaydırma işleminde birden çok kütüphaneler kullanın.
  2. Kısaca, OD 600 kadar 37 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde 2xYT ihtiva eden,% 1 glikoz ve 200 ml ampisilin, 100 ug / ml üç kütüphane kültür bakterileri stokları, 0.4.
  3. Tomlinson I ve J kütüphanelerin 200 ml ve levhalar kütüphanesi VCSM13 yardımcı faj 8 x 10 11 200 ml km13 yardımcı faj 8 x 10, 11 ekleyin. Çalkalamadan 37 ° C'de 30 dakika için yardımcı fajla kütüphane örnekleri inkübe edin.
  4. Santrifüj10 dakika boyunca 3000 x g'de kültürler ve% 0.1 glukoz ile 2xYT 200 ml ampisilin, 100 ug / ml kanamisin ve 50 ug / ml hücre pelletini.
  5. Çalkalama ile 30 ° C'de kültürlerin O / N inkübe ve daha sonra ertesi gün x g'de 3300, 30 dakika boyunca dönerler.
  6. Her kütüphaneden yüzer 200 ml 2.5 M NaCI içinde polietilen glikol (PEG) 8000, 50 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. PEG çökelmesinden sonra, 3300 x g'de 30 dakika boyunca tekrar çözüm dönerler.
  7. Mikrosantrifüj tüplerine hücre peleti (topak boyutuna bağlı olarak) ve transfer için fosfat tampon salin (PBS) içinde 1-2 ml ilave edilir.
  8. 11,600 x g'de 10 dakika süre ile santrifüje kondu, ara sıra karıştırarak, 37 ° C'de 1 saat boyunca buz üzerinde faj partikülleri inkübe edin. -80 ° C'de süpernatant ve mağaza toplayın.
  9. Dondurma önce, bir mikrosantrifüj tüpüne üç kütüphane faj partikülleri, küçük bir hacim transferi ve her bir kütüphane titreayrı ayrı konsantrasyonunu belirlemek için TG1 hücreleri kullanılarak. Aşağıda, bir kütüphane için titre işlemi tarif edilmektedir.
    1. 0.4 OD 600 TG1 hücreleri büyür. 6 mikrosantrifüj tüpleri PBS 990 ul ekleyin.
    2. Ilk tüpe faj partiküllerinin 10 ul ekle. Karıştırma işleminden sonra, boru, bir 10 ul kaldırmak ve geri kalan 4 borular 2. tekrarlayın borusuna bu adımı ekleyin.
    3. 6 tüplere TG1 hücrelerinin 200 ul ilave edin ve bu tüpler altı faj sulandırmaların her birinin 10 ul ekle. Faj parçacıkları 37 ° C'de çalkalama ile 30 dakika boyunca enfekte izin verin.
    4. Levha ampisilin, 100 ug / ml (LBA) ile agar plakaları, Luria-Bertani şöyle 100 ul hücre. 37 ° C'de O / N inkübe ve daha sonra görünen kolonilerin sayısı kullanılarak pfu / ml belirler.

2. Negatif biopanning Süreci

NOT: biopanning sürecinde faj çok donma çözülme kaçının. Kimlikeally, bir günde mümkün olduğunca negatif kaydırma adımların birçoğu olarak yürütmek için en iyisidir. Her karşı olumlu ya da olumsuz kaydırma mermi tamamlandıktan sonra herhangi bir aşamada kirlenme durumunda faj bazı kurtarmak için önemlidir hedef.

  1. Sığır Serum Albumin karşı Negatif Panning 12 yuvarlar (BSA)
    1. 12 immunotubes PBS içinde, 1 mg / ml BSA çözeltisi 4 ml ilave edilir ve 4 ° C'de O / N inkübe edin.
    2. (Kenara olumsuz kaydırma işleminin gelecek doğrulama için bu faj karışımı küçük bir miktarını ayarlamak) üç kütüphanelerin her birinden 1 x 10 12 faj partikülleri birleştirin.
    3. İlk tüp BSA çözüm atın ve herhangi bir bağlanmamış BSA kaldırmak için PBS ile tüpü 2-3 kez yıkayın.
    4. Bu, ilk boruya birleştirilen faj kütüphaneleri ekleme döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir ve bağlanmamış fajları toplar.
    5. İkinci immunotube ile adımı 2.1.3 tekrarlayın ve bu i adım 2.1.4 toplanan faj eklemekmmunotube. Adımı yineleyin 2.1.4.
    6. BSA çözeltisi ve her inkübasyon sonrasında toplanan bağlanmamış faj kalan 10 tüpler adımları yineleyin 2.1.3-2.1.4.
    7. Tüm BSA faj bağlayıcı kaldırılması AFM kullanmak doğrulamak için. Adımından sonra kırılmış mika bağlı BSA 2.1.7 ayrı ayrı 10 ug / ml aşama 2.1.2 gelen faj 10 ul ve geri kalan faj, 10 ul ekle. AFM sürecinin kısa versiyonu bölüm 8 özetlenmiştir.
    8. Bu kaydırma işleminin başarısını doğrulamak için her hedefe karşı olumsuz kaydırma sayısız mermi bitirdikten sonra faj küçük miktarda tasarruf önemlidir.
  2. Alfa-sinüklein Çeşitli Formlar karşı Negatif Panning 10 yuvarlar
    NOT: Bu projede, biz böyle (vb monomer, dimer, trimer) alfa-sinüklein gibi proteinler ve bu yüzden bu fajların herhangi ortadan kaldıracak diğer toplu formları (gol ortadan kaldırmak için bağlanabilen faj kaldırmak istiyorum mümkün olduğunca çok sayıda çapraz-reaktif fajlar). Her iki monomerik ve oligomerik formları negatif kaydırma için mevcut olacak şekilde arıtılmış alfa-sinüklein, en az 7 gün boyunca bir araya izin verin.
    1. PBS içinde toplu alfa-sinüklein, 500 ug / ml ile 4 immunotubes ve toplanmış alfa-sinüklein, 100 ug / ml ile 4 immunotubes hazırlamak ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
    2. Ve toplu alfa-sinüklein, 500 ug / ml tüpler birinden solüsyonu atın PBS ile yıkayın ve BSA ile kaydırma negatif 12 turdan sonra toplanan faj kitaplığı ekleyin.
    3. Döndürücü üzerine, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin tüp ve bağlanmamış fajları toplar.
    4. Tekrar sonra 500 ug / toplanmış alfa-sinüklein ml ve aşama 2.2.4 sonra her zaman elde bağsız faj kullanılarak toplanmış alfa-sinüklein, 100 ug / ml tüpler kalan borular 2.2.3 ve 2.2.4 adımları tekrarlayın.
    5. Toplu alfa 500 ug / ml karşı olumsuz kaydırma ilk sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.8sinüklein ve alfa-sinüklein 100 ug / ml karşı olumsuz kaydırma sekizinci turdan sonra faj.
    6. Karşı olumsuz bağlayıcı ortadan kaldırmak için alfa-sinüklein toplu alfa-sinüklein 500 ug / ml iki ekstra immunotubes hazırlamak ve tekrar 2.2.2-2.2.4 adımları.
  3. Sağlıklı İnsan Beyin Dokusu homojenatın karşı Negatif Panning 10 yuvarlar
    1. 1x STEN tamponu (50 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCI, 2 mM EDTA,% 0.2 NP-40,% 0.2 BSA, 20 mM PMSF ve proteaz kokteyli inhibitörü), insan beyin dokusunun 28 ekleyin. 3000 rpm'de 1 dakika için 24,000 rpm'de santrifüj örnekleri homojenize ve supernatant toplanır.
    2. PBS içinde insan beyin dokusunun 50 ug / ml, 2 ml ve insan beyin dokusunun 10 ug / ml 8 immunotubes 2 immunotubes hazırlamak ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
    3. Insan B için 10 ug / ml ihtiva eden daha sonra, insan beyin dokusunun 50 ug / ml içeren tüpler ile ilk 2.2.3-2.2.5 adımları tekrarlayınalfa-sinüklein karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan bağlanmamış faj kullanarak yağmur dokusu.
    4. 50 ug / insan beyin dokusu ml ve insan beyin dokusuna karşı olumsuz kaydırma onuncu turdan sonra faj karşı olumsuz kaydırma ilk sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.8.
  4. Sağlıklı immünopresipite TDP-43 karşı Negatif Panning 8 yuvarlar
    1. Nedeniyle, çökeltilir proteinin alt miktarına bölüm 9'da açıklanan protokolünü kullanarak sağlıklı insan beyin dokusu sağlıklı TDP-43 proteini immünopresipitasyon mika kullanılarak negatif kaydırma bu mermi yürütmek.
    2. Sekiz mika yüzeyleri bölmektedir.
    3. İlk mika için ~ imüno protein 5 ug / ml, 100 ul ve oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin.
    4. Tween 20 ile% 0.1 PBS (PBST) mika 5 kez yıkayın.
    5. Sağlıklı beyin dokusuna karşı olumsuz kaydırma sonra faj ~ 100 ul ekleyin ve 5-10 dk inkübeRT.
    6. Adım 2.4.5 yarıda inkübasyon anda, ikinci mika kullanarak adımı 2.4.3 yürütmek.
    7. Adım 2.4.5 faj toplayın ve% 0.1 PBST mika 5 kez yıkayın.
    8. Adım 2.4.6 den mika yıkayın ve 2.4.7 faj ekleyin.
    9. Faj olumsuz immunoprecipitated protein ile sekiz mika karşı panned kadar tekrarlayın 2.4.9 için 2.4.4 adımları. İlk ve negatif kaydırma sekiz turdan sonra faj kullanarak adımı yineleyin 2.1.7.
  5. FTD immünopresipite TDP-43 Karşı Olumsuz Panning 2 yuvarlar
    1. FTD insanların beyinlerinden İmmüno TDP-43 proteini.
    2. 2 mika yüzeyleri bölmektedir.
    3. FTB 10 ug / ml TDP-43 mika bir ila 50 ul ekle. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
    4. Mika% 0.1 PBST ile 5 kez yıkayın.
    5. Sağlıklı TDP-43 karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan faj 50 ul ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Ilişkisiz fajları toplayın.
    7. Repeats ikinci mika ve 2.5.6 toplanan bağlanmamış faj ile 2.5.6 için 2.5.3 adımları.

Immünopresipite TDP-43 ALS Bireylerin gelen karşı 3. Olumlu Panning

  1. ALS hastası bireylerin beyinleri gelen immüno TDP-43 proteini. 3 mika yüzeyleri bölmektedir. ALS 10 ug / ml TDP-43 mika bir ila 50 ul ekle. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Mika% 0.1 PBST ile 5 kez yıkayın.
  2. Sağlıklı TDP-43 mika karşı olumsuz kaydırma sonra toplanan faj 50 ul ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Ilişkisiz fajları toplayın. Ayrıca üç yıkama yöntemleri kullanılarak bağlı fajları toplamak. Ayrı bu kaydırma adımda toplanan tüm fajları tutmak önemlidir.
    1. Öncelikle, her bir mika için tripsin 50 ul (PBS içinde 1 mg / ml) ekleyin ve 10 dakika daha fazla inkübe edilir. Çözüm toplayın ve kaydedin. Daha sonra, her bir mika 100 mM trietilamin (TEA), 50 ul ilave edin ve 10 dakika daha fazla inkübe edilir. Coçözelti llect, 1 M Tris-HCI tampon maddesi pH 7.4 ve tasarruf eşit miktarda ilave edin.
    2. Üçüncü olarak, doğrudan mika, 0.4 OD 600 TG1 50 ul ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. Ayrıca 0.4 OD 600 TG1 3.3.1 100 ul olmak üzere iki taşıma yöntemleri toplanan fajlarından eklemek ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  4. Tekrar ikinci bir mika ile 3.1 adımları.
  5. 3.3.2 toplanan bağsız faj al. ALS TDP-43 ile ilk mika kullanarak ve ALS TDP-43 ile ikinci mika ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Mika bu ikinci set için 3.3 bütün adımları tekrarlayın.
  7. LBA plakaları iki ALS TDP-43 mika ve plaka tripsin ile akıtılan fajlarla enfekte TG1 hücreleri birleştirin. TEA için aynı işlemi tekrarlayın ve TG1 üç plakaların toplam iki ALS TDP-43 mika gelen fajları yıkandı.
    NOT: Çünkü ALS ve FTD hem TDP-43 katılımı, klonların bazı izoleALS TDP-43 karşı pozitif kaydırma iki tur bu hedefe özgü olabilir, ama bazıları da FTD bağlanabilir. Daha ALS Belirli klonları izole etmek için, FTD TDP-43 (negatif kaydırma bu iki turu FTD TDP-43 reaktif olan herhangi bir hedef kaldırıldı gerekirdi çünkü) karşı olumsuz kaydırma 2 tur sonra toplanan bağlanmamış faj almak ve bu fajları kullanmak mika ALS TDP-43 antijene karşı pozitif kaydırma (3.3 ve 3.4 yukarıda açıklandığı gibi ALS TDP-43 mika hazırlamak) bir daha yuvarlak.
  8. Bu üçüncü ALS mika ile 3.3 tüm adımları tekrarlayın ve 37 ° C'de üç LBA plakaları O / N üzerinde enfekte TG1 hücreleri plaka. Ertesi gün potansiyel ALS klonları ile 6 LBA plakaları üzerinde koloni sayısını saymak. Pozitif kaydırma iki tur sonra üç LBA plakaları ile karşılaştırıldığında olumlu kaydırma üçüncü turu sonrasında potansiyel ALS klonları ile üç LBA plakaları üzerinde daha az koloniler olmalıdır.

4. Kültürleme ve Phage ÜrünALS karşı Potansiyel Pozitif Klonların iyon spesifik TDP-43

  1. 37 ° CO / N bir çalkalayıcı üzerinde% 1 glükoz ile 2xYT 100 ul ve ampisilin, 100 ug / ml ihtiva eden 96 oyuklu plakalar içinde 6 plakalarından her bir koloni büyütün.
  2. Ertesi gün aktarımı% 1 glükoz ile 2xYT 1 ml ampisilin, 100 ug / ml ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine ALS TDP-43 proteini ile pozitif Tabaklama işleminin üçüncü turundan sonra 3 LBA plakaları klonlar ihtiva eden gözlerden elde 10 ul .
  3. % 15 oranında bir nihai konsantrasyona kadar 96 oyuklu plakalar içinde tüm kültürlere gliserol ekleyin ve -80 ° C'de plakalar dondurma. 1 ml kültür, 37 ° C'de çalkalanarak 2-3 saat boyunca büyümeye izin verin.
  4. Km13 yardımcı faj 10 9 ekleyin ve yardımcı faj çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat boyunca enfekte izin verir. Santrifüj 10 dakika boyunca hücreler 3,000 xg'de, 100 ug / ml ampicillin Kanam 50 ug / ml süpernatan atılır ve% 0.1 glukoz ile 2xYT 1 ml ilavegentamisin.
  5. Kültür çalkalanarak 30 ° C'de hücreler O / N. Santrifüj tüpleri 30 dakika boyunca 3.300 xg'de, yeni mikrosantrifüj tüplerine süpernatant aktarmak ve her tüp PEG / NaCl ul 250 ekleyin.
  6. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. 30 dakika için 3300 x g hızında tekrar santrifüj tüpleri süpernatan atılır ve her bir tüpe 100 ul PBS ilave edin.
  7. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. 11,600 xg'de 10 dakika boyunca tüpleri Spin ve yeni tüplere süpernatant aktarın. -80 ° C'de fajları saklayın.

Potansiyel ALS Klonların 5. Sıralama

  1. Adımı tekrar 4.2 ve çalkalanarak 37 ° C'de O / N büyümeye kültürlere sağlar. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına uygun olarak klonların DNA plazmid preparatlarıyla yapınız. Ileri uygun kullanarak klonlar sırası ve primerler ters.

ALS Özel TDP-43 Kullanma Dolaylı ELISA karşı Potansiyel Pozitif Klonlar Eleme 6.

  1. Her potansiyel ALS klon için yüksek bir bağlanma ELISA plaka oyuklarına ALS, FTD ve sağlıklı insan beyin dokusunun 2.5 ug / ml 100 ul ekle. Yavaş çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Plakaları% 0.1 PBST ile 3 kez yıkayın. Oyuk PBS içinde% 2 süt tozu 200 ul ilave edin ve yavaş yavaş çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Yıkama adımı tekrarlayın ve sonra oyuklara PBS en az 1/100 seyreltilmiş her faj 100 ul ekleyin. Ve inkübasyondan sonra, yıkama aşamaları, her bir kuyucuğa 1/1000, anti-M13 HRP 100 ul ilave edin. Plakaları yıkayın ve ELISA Femto kemilüminesans substrat kiti kullanılarak görselleştirmek.

7. scFv Üretim ve Dolaylı ELISA kullanma Screening

  1. 0.4 OD 600 HB 2151 hücreleri büyümek. HB 2151 hücre 20 ul farklı faj 5 ul ekle. 30 dakika fajlar çalkalamadan 37 ° C'de enfekte izin verin. Izgaraları içine LBA plakaları bölün, böyleceBu yaklaşık olarak 20 klon her birinin üzerinde plakanmıştır edilebilir.
  2. Levhaya her bir faj ile enfekte bakteri 5-10 ul ilave edin ve 37 ° C'de O / N inkübe edin. Bir sonraki gün 1,% 0.1 glukoz ile 2xYT ml 100 ampisilin ug / ml ayrı ayrı koloniler, ekleme ve OD 600 0.6 kadar 3-4 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanır.
  3. Her bir tüpe 1 M izopropiltiogalaktosit (IPTG) 1 ul ekleyin ve çalkalama ile 30 ° C 'de O / N inkübe edin. 10 dakika boyunca 11,600 xg'de tüpler Spin ve ELISA testleri için süpernatant hasat.
  4. ELISA testi için sulandırılmamış scFv'yi eklemek dışında yerine faj 6.5, bölüm 6 aynı prosedürleri takip ve 6.6 için 1 / 1.000 9E10 HRP 100 ul ekleyin.

8. AFM Süreci

  1. Kırılmış mika hedef antijenin 10-20 ul ekleyin ve 5-10 dakika için inkübe edilir. Su ile mika 5 kez yıkayın. Mika fajlarm 10-20 ul ekleyin ve 5-10 dakika için inkübe edilir.
  2. 5 kez tekrar wi mika yıkayıninci su ve kuru hava mika izin. AFM 1 kullanarak bağlama faj gözünüzde canlandırın. RT 29 havada bir NanoScope IIIa denetleyicisi ile AFM dokunarak modunu kullanarak AFM görüntüleme işlemini yürütün. silikon AFM sondalar 300 kHz bir rezonans frekansına ve 40 N / m arasında bulunan bir yay sabitesine sahiptir. 3.05 Hz tarama hızı ve 512 örnek / hattının bir tarama çözünürlüğü kullanın.
  3. Tüm parçacık boyutları, her görüntü içinde karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için arka temel düzleşme görüntüleri işleyin. Faj genişliği (değil uzunluk) görüntüden görüntüye bağlı olarak bir diğer parçacık boyutları ve tarama alanına göre değişebilir, ama bu olsa da olmasa faj doğruluğu antijenine bağlanan uzlaşma asla.
  4. Negatif kaydırma fajlann her set için AFM doğrulama sırasında mika görünür ise hiçbir fajlar negatif kaydırma sonraki seti geçmeden önce tespit edilene kadar ilave mermi gerçekleştirmek.

Hedef Antigen 9. immünopresipitasyonu

  1. ISOLAT içinE, hedef antijen (TDP-43), (motorun korteks) homojenize beyin dokusunun, bir anti-TDP 43 poliklonal antikoru ve 1x Sten 1/100 seyreltme 100 ul bir Eppendorf 700 ul toplam hacmine tampon 250 ug eklemek tüp 28.
  2. Bir döndürücüde 4 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. 1x Sten ile yıkayın A / G agaroz boncuk 2-3 kez tampon ve doku karışıma 25 ml ekleyin. , Bir döndürücü üzerinde 1.5 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 2000-4000 rpm'de santrifüj.
  3. Süpernatantı ve 1x STEN tamponu PBS ile 5 kez de pelet yıkayın. Pelet 1x STEN tampon 40-60 ul ekleyin ve 5 dakika boyunca kaynatın. Numunelerin sonra serin, santrifüj ve süpernatant toplamak. Immunopresipitasyon sürecinin 30 başarısını doğrulamak için SDS-PAGE ve Batı lekeleme kullanın.

10. nokta leke analizi

  1. Test edilecektir Her klon için küçük dikdörtgenler içine nitroselüloz kağıdı kesin. ALS, F, Nokta 2 ulTD ve nitroselüloz kağıt Allah'a sağlıklı insan beyni doku örnekleri ve tamamen kurumasını bekleyin.
  2. PBS içinde% 5 süt tozu 1-2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır sağlar. Her faj 1/100 seyreltme 1 ml ekleyin ve 4 ° C'de O / N sallamak verelim. % 0.5 PBST ile 10 dakika her biri için, membran 3 kez yıkayın.
  3. Anti-M13 HRP 1 / 1,000 seyreltme 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır sağlar. Tekrar yıkama işlemi ve Batı kemilüminesans çözüm kullanarak görüntülendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1'de şematik biz immunotubes kullanarak kütüphaneden hedef dışı antijenleri bağlama faj kaldırıldı hangi olumsuz kaydırma işlemini göstermektedir. Bu ortak bir engelleme ajan ve gelecekteki immunoassay sorunlu olacağını, bu hedefle spesifik olmayan tepki vereceğini herhangi bir faj beri biz başlangıçta BSA ile başladı. Bundan sonra, toplanan protein (yani, biraraya toplanmış, alfa-sinüklein çapraz reaktif olması beklenir bir antikor TDP-43, Abeta, vs.) genel yapıları ile reaktif ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein varyantlarının Alzheimer, Parkinson, ALS ve FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 gibi birçok nörodejeneratif hastalığın ilerlemesinde rol oynadığı gösterilmiştir. Bu farklı protein varyant hedeflerini seçici olarak tanıyabilen antikorların izolasyonu, bu tür rahatsızlıkları incelemek, teşhis etmek ve potansiyel olarak tedavi etmek için etkili reaktifler olabilir. Bu tür varyantlara özgü antikorlar üretmek için, her adımın ilerlemesini izlemek için atomik kuvvet mikroskobu kullanan yeni bir biyopanlama süreci g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma NIH hibe ile desteklenmiştir: R21AG042066. Biz ekran yakalama videoları oluştururken katkılarından dolayı Philip Schulz teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tomlinson I ve J KütüphaneleriMRC (Cambridge, İngiltere)
Yaprak KütüphanesiMRC (Cambridge, İngiltere)
2xYTBD Sciences244020
GlikozAmresco0188-2.5KG
AmpisilinAmresco0339-25GTahriş Edici
KM13 Yardımcı FajMRC (Cambridge, İngiltere)
KanamisinOmniPur5880Tahriş
Edici Polietilen Glikol 8000OmniPur6510Tahriş
Edici Sodyum KlorürMacron7647-14-5
Sodyum Fosfat DibazikAmresco0404-1KGTahriş
Edici Potasyum KlorürEMDPX1405-1Tahriş Edici
Potasyum Fosfat MonobazikAmresco0781-500GTahriş Edici
TG1 HücreleriMRC (Cambridge, İngiltere)
Luria-Bertani AgarEMD1.10283.0500
Sığır Serumu AlbüminAmresco0332-100G
STEN tamponuCrystalgen Inc.
İmmünotüplerThermo Scientific470319
MikaLadin Çam Mika24365
Tween 20EMD
TripsinSigmaT-0303Tahriş Edici
TrietilaminSigmaT-0886Yanıcı
GliserolAmresco0854-1LTahriş Edici
DNA Plazmid Hazırlama Kitiqiagen27106Tahriş Edici
Yağsız Süt TozuKaranfil
96 Kuyulu Yüksek Bağlayıcı ELISA PlakasıCostar3590
Anti-M13 HRPGE Sağlık Yaşam Bilimleri27-9421-01
ELISA Femto Kemilüminesans YüzeyKiti Thermo Scientific37074
Anti-TDP 43 Poliklonal AntikorProteinTech10782-2-AP
A/G Agaroz BoncukSanta Cruz Biyoteknolojisc-2003
HB 2151 HücrelerMRC (Cambridge, İngiltere)
İzopropiltiyogalaktosidTeknova13325
9e10 HRPSanta Cruz Biyoteknolojisc-40
Nitroselüloz MembranBiorad162-0115Yanıcı
SantrifüjThermo ScientificSorvall RC 6 +
Nanoskop IIIa Atomik Kuvvet MikroskobuVeeco
AFM ProblarıVistaProbesT300R-10
33429775

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biopanning TechniqueNegative Panning PhasePositive Panning PhasePhage Library ScreeningAFM Imaging VerificationMica Surface BindingSelective Reagent Isolation

İlgili makaleler