Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Özet

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca ^{2 +} dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca ^{2 +} sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Özet

Retina koni fotoreseptör (koni) günışığı vizyon hizmet ve renk ayrımcılığı temelini oluşturur. Bunlar genellikle çok sayıda retinal hastalıklarda körlüğe yol açan, dejenerasyon tabidir. Kalsiyum (Ca2 ^+), fotoreseptör sinyal ve metabolizmada önemli bir ikinci mesajcı dolaylı çeşitli hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu ile bağlantılı olduğu ileri sürülmüştür. Sistematik koni fizyolojisinin bu yönlerini incelemek ve patofizyolojisi elektriksel retina çubuk fotoreseptör hakimdir fare, özellikle bu küçük hücrelerden kayıt zorluklar tarafından engellenmiştir. Bu sorunu aşmak için, biz kozalakları münhasıran genetik olarak kodlanmış Ca ^{2 +} biyosensör TN-XL ifade ve fotoreseptör dejenerasyonu için fare modelleri ile melez edilebilir transgenik fare hattı kullanarak bir iki foton Ca ^{2 +} görüntüleme protokolü kurdu. Burada açıklanan protokol dikey kesitler hazırlamak üzere şunları içerir: (R,20, fareler ve koni Ca ^{2 +} seviyesinde hafif uyarıcı uyarılmış değişikliklerin optik görüntüleme gelen retina dilim "). protokol aynı zamanda mutlak Ca ^{2 +} konsantrasyonları "in dilim Ölçümü" sağlar; kayıtları kalibrasyon takip edilebilir. Bu protokol, fonksiyonel koni özellikleri içine çalışmalar sağlar ve koni anlayışı Ca ^{2 +} sinyalizasyon yanı sıra fotoreseptör ölümü ve retina dejenerasyonu Ca ²⁺ potansiyel tutulumuna katkıda bulunması beklenmektedir.

Giriş

Görüş retina fotoreseptör fototransdüksiyon kaskadının ışık kaynaklı aktive olması ile başlar. Koni fotoreseptör renk ve yüksek çözünürlüklü gündüz vizyon aracılık oysa Rod fotoreseptör, düşük ışık seviyelerinde vizyon sağlar. Birçok fotoreseptör özgü genler bu hücrelerin dejenerasyonuna yol mutasyonlara karşı hassastır. Fotoreseptör kaybı ile ilişkili moleküler belirteçlerin bir dizi ¹ tanımlanmıştır, ama şimdiye kadar ayrıntılı moleküler mekanizmaları ve olaylar dizisi belirsizliğini koruyor. Altered Ca2 ⁺ homeostazı fotoreseptör hücre ölümü, bir tetik, dejenerasyon süreci ^2,3 sırasında Ca aktivitesi ^{2 +} -bağımlı kalpain tip proteazların yukarı regülasyonu ile desteklenen bir hipotez olarak öne sürülmüştür. Ancak, bugüne kadar, bu hipotez Ca ^{2 +} fizyolojik ölçümleri ile desteklenmemektedir. Re Ca ²⁺ kanal blokerleri etkisi üzerinde çeşitli çalışmalarda tutarsızlıklarintestinal hastalıklar daha doğrudan memeli koni fotoreseptör Ca ²⁺ değerlendirmek için yöntemler çağrısında hücre ölümü ^4-6 Ca ²⁺ katılımı meydan okudu.

Daha önce, en elektrik kayıt ve Ca ²⁺ görüntüleme çalışmaları nedeniyle koni ^7-9 daha kolay erişim kurbağa ve sürüngen modellerinde yapılmıştır. Ancak, memeli fotoreseptör fizyolojisi olmayan memelilerde ^10, özellikle de bu farklı olabilir, insan kalıtsal retinal dejenerasyon bağlamında memeli fotoreseptör fizyolojisi hakkında daha iyi bir anlayış yenilikçi tedavilerin geliştirilmesi için bir anahtardır. İnsan retina hastalıkları taklit eden pek çok fare modelleri mevcuttur, ancak küçük fare konileri ¹¹ Ca ²⁺ dinamikleri hakkında bilinmektedir. Elektrik teknikler, özellikle olmayan farelerde,, koni yüksek verimli kayıtlar için uygun değildir burada çubuklar (~% 97) önemli ölçüde koni (~% 3) sayıca ¹² yedekleyin. Ayrıca, bu tür tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gibi hassas elektrofizyolojik teknikler, hücre içi ortamını rahatsız ve mutlak hücre içi Ca ^{+ 2} konsantrasyonları Ca ²⁺ akımlar veri değil sağlar. Koni Ca ^{2 +} dinamikleri hakkında sorular ele alırken Dolayısıyla, alt temporal çözünürlük rağmen, görüntüleme tercih edilen bir yöntemdir. görüntüleme ile önemli bir konu seçici bir floresan Ca ^{2 +} göstergesi boya ile kozalakları etiketlemek için nasıl. Uygun bölmelere ve hücre özgüllüğü dokuya "toplu yükleme" sentetik Ca ^{2 +} göstergesi boyalarla elde etmek zordur. Sonuç olarak, etiketli kozalakları olarak ^13,14 çubukları ve Müller glial hücreler güvenilir ayırt edilemez. Ayrıca, sentetik boyalar tutarlı şartlar altında uzun süreli kayıtları önlenmesi, hücre dışına sızıntı eğilimindedir. O de gerektirir Dahası, onların AM-ester formunda sentetik Ca ^{2 +} göstergeleri yükleme, sorunluTERGENTR (örneğin, DMSO) ve formaldehit ¹⁵ oluşturur. Mutlak Ca ^{2 +} ölçümler için, rasyometrik göstergeler zorunludur. Ancak, en iyi mevcut sentetik rasyometrik göstergesi Fura-2 şiddetine bağlı olarak, kendi içinde koniler uyarır ve bu şekilde çalışmaları engelleyebilir, 760 nm ile 700 aralığında uyarma ışık (iki foton uyarılması için) gerektirir koni Ca fizyolojik aydınlatma koşullarında ²⁺ dinamiği.

Sentetik boyalar farklı olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2 ⁺ göstergeleri bir hücre tipine seçici biçimde ifade edilebilir. Onlar hücre dışına sızıntı yok ve ağartma kaçınılması, bu nedenle, uzun süreli ve güvenilir rasyometrik ölçümler mümkündür. İki foton mikroskopi ile kombine edildiğinde Hücre tipi seçici Ca ^{2 +} biyosensörler ifadesi, büyük ölçüde fizyolojik şartlar altında ^13,16,17 Ca ^{2 +} değerlendirmek ve hücre içi çalışmak için güçlü bir araç temsil sup. Burada, biz ışık uyaran-uyarılmış koni Ca incelemek için bir protokol açıklar transgenik Ca ^{2 +} biyosensör fare hattında ²⁺ dinamiği: FRET tabanlı Ca ^{2 +} biyosensör TN-XL ¹⁸ ifade (HR2.1 TN-XL), seçici koniler, insan kırmızı opsin promotör HR2.1 ¹⁹ altında. Koni terminallerini erişmek için, ex-vivo dilim hazırlık ²⁰ kullanılmıştır. protokol zaten başarıyla sağlıklı farelerde ^10,21,22 koni fonksiyonu üç çalışmalarında kullanılmıştır. Ayrıca, protokol koni Ca okuyan sağlar ²⁺ örneğin spesifik genetik koşullarda sinyalizasyon, HR2.1 ile kalıtsal retina dejenerasyonu için fare modelleri melezleme yoluyla: TN-XL fareler.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Alman Federal Hükümet tarafından belirlenen ve Tübingen Üniversitesi kurumsal hayvan refahı komitesi tarafından onaylanmış hayvan koruma kuralları ve yasalara bağlı kalarak yürütülmüştür.

1. Hayvan Modelleri

1. HR2.1: TN-XL Ca ²⁺ biyosensör fare
   1. Transgenik HR2.1 kullanın: TN-XL fare hat koni fotoreseptörlerin ¹⁰ seçici Ca ^{2 +} biyosensör TN-XL ifade. Standart 12 saat gündüz / gece ritmi ile kaldırdı iki cinsiyetten 6 haftalık fareler - 3 kullanın.

2. Retina Diseksiyon

1. Fizyolojik çözelti,
   1. 125 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM _MgCI2, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 26 mM NaHCO _3, 0.5 mM L-glutamin, ve 20 mM (+) glikoz içeren hücre-dışı çözelti taze 2 L, hazırlayın. Tüm malzemeyi eritmek kadar karıştırın.
   2. "Kabarcık" hücre dışı çözelti,10 dakika - 5 için carboxygen (% 95 _O2,% 5 _CO2) ile. 2 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için _CaCl2 ekleyin.
   3. Dışı çözüm köpüren sonra, onun pH ölçümü. pH, aksi takdirde bu hatalar çözeltinin hazırlanması sırasında yapılmış olması muhtemeldir, 7.4 olmalıdır. Sabit pH sağlamak için deney boyunca köpüren hızı ve çözüm sıcaklığı sabit tutun.
   4. 2 matara, retina diseksiyon için bir ve kayıt kurulumu (perfüzyon) için birine stok ayırın.
2. Göz enükleasyon ve retinanın izolasyonu (5-10 dk)
   1. Enükleasyon için çalışma alanı içinde loş kırmızı aydınlatma koruyun. Diseksiyon sırasında koni beyazlatma önlemek için 650 nm (veya daha uzun) bir zirve dalga boyu LED kullanın.
   2. Koniler tamamen kayıtları sırasında duyarlı olmasını sağlamak için iyi havalandırılan, lightproof kutu içine kendi kafesi koyarak 2 saat için fare koyu adapte.
   3. Bir Laborato altında fare uyuşturanbir buharlaştırıcı ve standart bir fare kafesi taşıyan bir gaz-sızdırmaz bir kap kullanılarak izofluran (% 5) ile Ry kapağı. Buharlaştırıcı'yı işlerken dikkatle imalatçının talimatları izleyin. Alerjenlere maruziyeti azaltmak için eldiven ve yüz maskesi kullanın.
   4. Diseksiyon için 40X büyütme - 10 ile binoküler mikroskop kullanın.
   5. Dekapitasyon yoluyla anestezi fare kurban.
   6. Yönlendirme için, su geçirmez bir kalemle her göz (= dorsal) üst işaretleyin. Sol veya sağ gözünü kullanarak konusunda takip edin.
   7. Göz küresi arkasında optik sinir keserek dikkatlice kavisli makas kullanılarak göz çıkarın. Diseksiyon için taze carboxygenated hücre dışı çözelti ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Gözü aktarmak için, optik sinir güdük tutunuz.
   8. Keskin bir enjeksiyon iğnesi ile kornea ve (ora serrata de yani) sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktada göz delmek.
   9. E tuthafifçe forseps çifti ile sklera de siz tek makas önceki adımda yapılan deliğe bıçak yerleştirin. Arka kısmında (göz kapağı) için göz (kornea, lens, vitreus) ön kısmını ayırmak için ora serrata boyunca kesin. Retina üzerinde dorsal konumunu belirtmek için kalem işareti pozisyonunda (optik disk doğru) radyal Göz yuvası kesin.
      Not: Bu şekilde hazırlanan eyecups daha sonra kullanmak için sürekli carboxygenated çözelti içinde muhafaza edilebilir.
   10. Dorsal uzakta kendini noktaları kesilmiş şekilde Petri kabındaki Göz yuvası çevirin. Retina ve sklera arasında forseps ipuçları sokulmasıyla sol ve forseps, her bir çift Göz yuvası sağ tarafındaki sklera al.
   11. Yavaşça Göz yuvası skleral kısmını ters çevirerek retina ayırın. Son olarak, sklera retina boşaltmak için makas diseksiyon mikro kullanarak optik sinir kesti.
       Not: Bu kritik bir adımdır. Retina (örneğin, tarafından zarar görmemesidokunaklı ve) forseps ile sıkarak.
   12. Forseps ikinci bir çifti kullanılarak retina yüzeyinden birikintileri ve vitreus cismin çıkarılması hafifçe forseps bir çift ile retinanın kenarlarında birini basılı tutun. Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç ek kısa, radyal kesimler (yaklaşık olarak her 90 °) yapmak için makas diseksiyon mikro kullanın. Bu kesimler, bir dikkatle fotoreseptör tarafı Petri kabı (Şekil 1A) aşağı bakacak şekilde retina düzleştirmek için izin verir.
3. Dilim hazırlık (10-15 dakika)
   1. Dilimleri montaj ve kayıt odasına aktarılması için retina dilimleme ve cam kapak fişleri için önceden nitroselüloz filtre membranlar hazırlayın. Makas kullanılarak yaklaşık 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde nitroselüloz filtre membranı kesin. Bir glasscutter kullanılarak yaklaşık olarak 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde lamelleri kesilir.
   2. Yavaş yavaş yakın hücre dışı çözelti bir cam slayt batırmakdokusu. Yavaşça, forseps bir çift kullanarak çok kenarında onu kapma ganglion hücre tarafı yukarı cam slayt üzerine retina çekin. Bu süreç, mekanik hasar ve doku katlanmasını azaltır.
   3. İlgili araştırma sorusu ile ilgilidir retinanın bölge seçin (ayrıca Tartışma bakınız). Adım 2.2.9 yapılan uzun kesilmiş dorsal retina yarısını (Şekil 1A) işaretler, unutmayın. Kavisli neşter bıçak kullanarak seçilen retina bölgesi dışında bir dikdörtgen, yaklaşık 1 x 2 mm büyüklüğünde parça kesin. Doku çevresindeki aşırı çözüm siliniz.
   4. Ganglion hücre tarafı zarına yapışan şekilde retina parçasının üzerine filtre zarı yerleştirin. Hemen sonra, sıkı bir şekilde zara doku takmak için zar üzerine, hücre dışı ortamın bir damla ekleyin.
   5. Taze dışı solüsyon içeren dilimleme odasına zar monte retina doku aktarın.
   6. 200 mikron dikey dilimler halinde kesin retinaBir doku kesici ²³ takılan bir taze traş makinesi bıçak kullanılarak kalınlığı (Şekil 1B). Her retina parça için bıçağı değiştirin.
      Not: jilet ile belirtildiği gibi, tüm membran, aynı anda bölünmeler şekilde mükemmel dilimleme odasının alt yüzeyi ile uyumlu hale getirilmesi gereken bir keserken sesi "linkine tıklayarak" - aksi takdirde bıçak bükülebilir ve dilim zarar.
   7. Zara yüksek vakum gres uygulayarak cam kapak-slip tek bir zar monte dilim Tutkal sadece (Şekil 1C) sona erer. Gres ücretsiz retina altındaki cam yüzeyini tutun.
   8. Tutma odası içinde hücre dışı bir çözelti damla kapsadığı lamel monte dilimleri tutun - örneğin, kapalı ışık geçirmeyen kap, alüminyum folyo ile kaplanmış kapaklı bir Petri kabı - oda sıcaklığında bir carboxygen atmosferi altında. Holding atmosfer tutmak için küçük bir su deposu köpüren tarafından carboxygen tanıtılmasıbölme nemlendirilmelidir; Bu kurumasını dilimleri önler.
   9. Kayıt odasına onları (tek tek) geçmeden önce 15 dakika - dilimler 10 tutma odasında dinlenmek için izin verin. Dilimler, oda sıcaklığında bölme tutarak 4-5 saat kadar muhafaza edilebilir (~ 21 ° C).

3. İki foton Ca ²⁺ Görüntüleme

1. İki foton mikroskopi
   1. Bir Hareketli Hedef Mikroskop (MOM) tipi iki foton mikroskop kullanın. Ayrıntılar ayrıca bkz hem MOM tasarım ve görüntüleme işlemleri, daha önce ²⁴ tarif edildi ^10,21,25 (kaynaklar ve şirketler için, bakınız Tablo ^1).
      Not: kullanılan aşağıdaki minimum gereksinimleri karşılayan herhangi bir dik iki foton mikroskopu: Bu ~ 860 nm'ye ayarlanabilir bir (a) darbeli bir lazer, (b), iki eş zamanlı olarak elde edilen floresans kanallarının en az, (Cı ile donatılmış olması gerekir )) eCFP ve sitrin floresan, (d için filtrelerhafif bir uyarıcısı (mümkünse tasarımlar için, ^24,26 bakınız), ve yeterli bir kare hızında zaman lapsed görüntü dizileri kayıt sağlar (e) yazılım ca ilgi ²⁺ sinyallerini çözmek için.
   2. İmalatçının işaret ettiği gibi, iki-fotonlu görüntüleme sistemi başlatın. Strictly tesisin lazer güvenlik kurallarına uyun. ~ 860 nm için lazer ve nağme o başlayın.
   3. Kayıt odasına tutarak odasından bir dilim aktarın ve hemen carboxygenated ekstrasellüler çözümü ile perfüze başlar. 2 ml / dk'lık bir perfüzyon akış oranı ve kayıt bölümü içinde, 37 ° C'lik bir sıcaklıkta muhafaza.
   4. 20X 0.95 NA suya daldırma hedefi kullanın. Varsa, retina dilim (Şekil 2) bulmak için kayıt odasına altında bir LED kızıl-ötesi ile birlikte bir CCD kamera kullanmak. Aksi takdirde iki foton görüntüleme (3.1.5 bakınız) kullanarak dilim bulun.
   5. Biyosensör ifadesini görüntülemek için iki foton görüntüleme geçin. AçeCFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki algılama kanalları.
   6. Tarama ve (Şekil 3A) kayıt için koni terminalleri bir satır seçmek için iki foton mikroskop kontrol görüntü elde etme yazılımı kullanın. 128 x 16 piksel görüntüleri (31.25 Hz) veya benzer yapılandırmaya Set görüntü elde etme. Dış segmentlerinde photopigments beyazlatma önlemek için koni terminallerine taranan alan kısıtlayın.
      Not: (Ca ²⁺ unbinding için bağlayıcı Ca τ = ~ 0.6 sn ^2+, τ = ~ 0.2 saniye; ¹⁶ bakınız) TN-XL kalsiyum sensörü için ~ 8 Hz minimum kare hızı önerilir.
2. Hafif stimülasyon ve kayıt
   1. Başka yerde ^10,21,26 açıklandığı gibi aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için alt kademe tam saha ışık uyarıcı kullanın.
      Not: Tam saha ışık uyarıcısı için basit bir çözüm, iki bant-geçiren filtreden geçen LED'ler (: 360 BP 12, "yeşil": 578 BP 10 örneğin, "mavi") kullanmaktırBu fare koni dalga boyu hassasiyetlerini maç ama aynı zamanda floresan tespiti için kullanılan filtreler ile örtüşmeyen (cf. 3.2.4). LED'lerden gelen ışık kayıt odasına (Şekil 2) altına doğru Kondenser tarafından odaklanmıştır. Bu stimülatörü tasarımı, kendi kalibrasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, ışık yoğunlukları kullanılan ve uyarılmış koni fotoğraf izomerleştirme oranları, ^10,21,26 bakın.
   2. Işık uyaranlara (3.2.3 bakınız) sunulması ya da farmakolojik ajanlar uygulamadan önce - (ayrıca Potansiyel Tuzaklar bakın, 30 saniye 20) lazer açın ve koni tarama lazer ve uyarıcı arka plan ışığı uyum sağlar.
   3. (Şekil 3B, C de gösterildiği gibi hafif örneğin, yanıp söner) keyfi uyaranların sunumu başlatın. Aşama 3.2.1 tarif stimülatörü durumunda, özel bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikro-işlemci kartına (kullanılarak, zaman içinde iki LED yoğunluğunu modüle harekete geçirici bir güçdetayları) ^10,21,26 bkz.
   4. İki floresan kanalları kaydetmeye başlayın (. Örneğin, "mavi" FRET verici eCFP için 483 nm ve "sarı" FRET-alıcısı için 535 nm, gözlük bakınız Tablo 1 için) aynı anda ilgili görüntü elde etme yazılımı kullanarak (ayrıca bkz 3.1 .6). Örneğin, hafif bir yanıp söner (Şekil 3B, C), kayıt en az 8 durumunda - 10 uyarım sunumları (çalışma).
3. "In-dilim" Ca ²⁺ kalibrasyonu
   1. Telaffuz Ca (3,4 de tarif edildiği gibi), (3.1.6 ve 3.2.4 tarif edildiği gibi) ve koni bir dizi taban Ca ^{2 +} seviyesini elde konik terminalleri ^{2 +} işaretleri.
   2. 5 uM (DMSO içinde çözülmüş) ionomisin ve 10 mM EGTA ile "Ca ^{2 +} serbest" hücre dışı ortama geçiş (veya alternatif olarak, BAPTA) ilave edildi. Tutanak koni terminalleri yine her 5 dk minimal floresan oranını (R _dk) belirlemek, yani hücre içi Ca (yakın) yokluğunda oranı ^2+. 30 dakika - Bu her yerde 15 arasında sürebilir.
      Not: Bir perfüzyon sistemi, farklı hazneler arasında geçiş sağlar olması gereklidir.
   3. (DMSO içinde çözülmüş) ile 5 uM ionomisin ve 2.5 mM Ca2 ⁺ ile birlikte hücre dışı ortama geçin. 5 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, kayıt koniler yine her 5 dakika, yani maksimum flüoresans oranı _(Rmax), ^{2 +} hücre içi Ca doyurucu konsantrasyonlarının mevcudiyetinde oranını ölçmek için kullanılır. Kararlı olmak Ca ^{2 +} oranı 15 dk - ionomycin uygulamayı takiben, bu 3 arasında sürebilir.
      Not: ²⁺ yüksek Ca dilimleri merceğin ve sonunda hücrelere zarar verecek uzun süre iyonomisin. Normal morfolojisini muhafaza analizinde tek hücreler yer alır. Konsantrasyonları (örneğin, EGTA, iyonomisin) adapte edilmesi gerekebilir. Ca ^{2 +} kalibrasyon hakkında daha fazla bilgi içinprotokol, ^13,17 bkz.
4. Veri analizi
   Not: İlgili mikroskop yazılımı ile uyumlu ve özel analiz komut çalıştırabilen bir görüntü işleme ve veri analiz yazılımı paketi kullanın.
   1. Bir görüntüleme veri dosyası yükleyin ve her koni terminali (Şekil 3A) çevresinde ilgi (ROI) bölgeleri çizin. ROI içindeki her bir çerçevede, ortalama floresans şiddeti ve FRET alıcı (sitrin) ve verici (eCFP) floresans (R = F _A / _F; Şekil 3B, C) ​​arasındaki oranı (R) hesaplamadan önce, arka plan floresanı çıkarılır. Bu oran genellikle göreceli hücre içi Ca2 ⁺ konsantrasyonu için bir vekil olarak kullanılır, ancak kalibrasyon (3.3) sonra, aynı zamanda mutlak konsantrasyonları (3.4.3 bakınız) tahmin edilebilir.
      Not: pediküller dış pleksiform tabakasında konumlarına tarafından kabul edilebilir ve bunların morfolojisi (biraz daha küçük koni daha "lekeler" düzleştirilmişsomata) koni akson sonunda yer.
   2. Ortalama uyaran denemeleri (Şekil 4A). Cevap boyutu için önlemler olarak eğrisi (R _A) altında ışık uyarımı, tepe genliği (R _amp) ve bölgeye önce böyle Ca ^{2 +} bazal seviyesi (R _üssü) olarak ortalama izleri (Şekil 4B), yanıtı parametreleri ayıklayın. Ayrıca, bu tür tepki yükselişi (t _artış) ve çürüme süresi (t _çürüme) olarak ortalama izleri, yanıtı kinetiği ayıklamak (% 20 ve R _amp% 80 arasında = ilgili zaman aralıkları Şekil 4B resme bakınız). Bu parametreleri belirlemek için nasıl hakkında daha fazla bilgi için, ^10. görüyorum.
   3. Adımlar 3.3.1-3.3.3 itibaren ölçümlere dayalı mutlak koni Ca2 ⁺ konsantrasyonu tahmini hesaplayın. Minimum ve maksimum Ca2 ⁺ konsantrasyonu, R ve R _{min max} Ca, sırasıyla donör floresan için oranları kullanın ²⁺ TT-bağlı (F _{D, Ca-bound)} ve -unbound kadar (F _{D, Ca-ücretsiz)} devlet yanı sıra, in vivo ayrışma sabiti aşağıdaki TN-XL için _(Kd = 0.77, ¹⁶ bakınız) denklem ^(27'ye analog):

Sonuçlar

Dikey dilimleri HR2.1 hazırlanan (Şekil 1) birleştirerek: İki foton görüntüleme (Şekil 2) ile TN-XL fare retinanın, biz koni fotoreseptör akson terminallerinde ışık uyaran-uyarılmış Ca ^{2 +} sinyalleri rasyometrik ölçümler yapmak başardık . Bu yaklaşım erişme ve sentetik Ca ^{2 +} göstergeleri ile önceden varolan optik görüntüleme yöntemleri üzerinde fare konileri görselleştirme önemli bir gelişmeyi temsil eder. Örneğin, genetik olarak kodlanmış rasyometrik Ca koni özgü anlatım ²⁺ biyosensör TN-XL ölçüde koni akson terminallerinin kimlik (Şekil 3A ROI bakınız) kolaylaştırdı. Bu nedenle, bizim protokol hem koni ve çubuk akson terminalleri katkılarıyla örnek "karma" sinyalleri olarak, belirsiz kökenli kayıt sinyallerinin riskini ortadan kaldırır.

Bizim yaklaşımımız Indivi düzeyinde tek deneme yanıtları çözme veriyorÇift koni akson terminali. Koni terminalden Ca ² ışık uyarılmış ekstrüzyon artış ve verici ve alıcı floresan sırasıyla (Şekil 3B), bir azalma ile işaretlenir. Flüoresans oranı (R) azalma koni ve voltaj kapılı Ca ^{+ 2} kanal daha sonra kapağın ışık kaynaklı hiperpolarizasyon kaynaklanan konik ucu (Şekil 3C), Ca ekstrüzyonu ^{2 +} karşılık gelir. Birkaç koni akson terminalleri (Şekil 3A) aynı anda izlenebilir Çünkü, veri toplama çok verimli ve koni Ca ²⁺ yanıtları yüzlerce tek bir deneyde toplanabilir. (Şekil 4) kantitatif bu yanıtları değerlendirerek, koni Ca ^{2 +} sinyalleri karşılaştırılabilir ve koşullar (Tartışma) aralığında değerlendirilmiştir.

Bu FRET-alıcısı (sitrin) ve -donor (eCFP) floresan arasındaki oranı kullanmak genellikle yeterli olurHücre içi Ca ^{2 +} seviyesinin göreceli bir önlem olarak; (F _A / F _D detaylar için, 3.4 bakınız). Oysa, gerektiğinde, bu oran mutlak hücre içi Ca ^{2 +} konsantrasyonları ([Ca ^{2 +])} (Şekil 5) elde etmek için kalibre edilebilir. Bu protokolde kullanılan arka plan aydınlatması At (detaylar için, bkz ^10'a ve Şekil 3 efsane), kalibrasyon [Ca ^{2 +]} in "vahşi tip" HR2.1 dinlenme mutlak bir tahmin vermiştir: TN-XL fare koni terminalleri 243 ± 159 literatür ¹¹ fareleri için aralığında nM (ortalama ± SD).

Dikey retina dilim 1. Hazırlık Şekil. Retinanın (A) İzole ve retina dilimleme için hazırlanan basık. (B) Dikdörtgen parça (lerdilimleme sonra filtre kağıdı membran (koyu gri) üzerine monte edilmiş) A kırmızı kutu ee. (C) gres kullanarak bir cam lamel sabit zar monte retina dilim Üst görünümü. (D) retina dilim bir kısmının şematik çizimi (C kırmızı kutuya bakın). Koni fotoreseptör yeşil gösterilir. V, ventral; D dorsal; N, nazal; T, zamansal; OS dış segment; ONL, dış nuklear tabaka; OPL, dış pleksiform tabakasını içermektedir; INL, iç nuklear tabaka; IPL, iç pleksiform tabakası; GCL, ganglion hücre tabakası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Retina dilim Şekil 2. İki foton görüntüleme: Kayıt yapılandırma İllüstrasyon Üst:. Su daldırma objektif lens odaklama olacakTarama retina içine lazer (kırmızı aşağı ok) ve yayılan floresan (yukarı oklar) toplama am. objektif bir CCD kamerası kullanılarak bir dilim görüntülerken, belirli bir kondansatör altına monte edilmiş bir LED aydınlatma kızılötesi ışık iletilir toplar geçin.:., hücre dışı çözelti ile kayıt odasına monte edilir ve perfüze Retina dilim Alt: Kondenser mercek stimülasyon LED'lerden gelen ışık odaklama (ve CCD kamera görüntüleme kızılötesi LED) retina dokusu içine kayıt odasının şeffaf altından geçerek. IR LED, kızılötesi ışık yayan diyot; CCD, şarj-kuplajlı aygıt; BP, bant geçiren. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Işık EvokeFare koni Fotoreseptörlerin akson terminallerinde d Ca ²⁺ cevapları. (A) Sol: Kayıtlar retina dilimleri koni fotoreseptörlerin (yeşil) sinaptik terminalleri (kırmızı kutu) üzerinde duruldu Sağ:. Örnek Kaydedilen bölge için 7 ayrı terminaller. Floresan iki kanal kullanılarak kaydedildi:. (; 535 BP 50 üst) ve FRET-verici eCFP için bir tane (alttan; 480 BP 32) FRET-alıcı sitrin için bir (B) sitrin Işık uyarılmış değişiklikler (F _A) ve eCFP (F _D) floresan tek ROI kaydedildi. (C) Ca ²⁺ yanıtları 5 sn aralıklarla 1 sn parlak ışık yanıp söner bir dizi için bir koni terminalinin (oran F _A / F _D gibi). ROI, ilgi bölgesi; BP, bant geçiren filtre; F, floresan yoğunluğu; keyfi birimler, au; FRET, Förster rezonans enerji transferi; eCFP, mavi floresan proteinin geliştirilmiş. Uyaran yoğunluğu (p. 13,0 ve bir arka plan düzeye ekleyerek sırasıyla M- ve S-opsins için 12.8, (içinde ~ 10 = LED'ler kapalı, uyarma lazer tarama): 10 ³ · P · s ^-1) koni başına içinde otoğraf-izomerizasyon oranı tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Işık uyarılmış koni Ca ²⁺ yanıtların Şekil 4. örnek olarak kantitatif analiz (A) tek bir koni terminalden (Ír gibi) Işık uyarılmış Ca ^{2 +} yanıtları (tek denemeler: gri izleri, n = 16; ortalama:. Siyah iz ) (B) Parametreler ortalama Ca ^{2 +} yanıtı için belirlenen:. önce ışık uyarısına bazal temsil eden) Ca ^{2 +} seviyesi (R _tabanını İstirahat, yanıt boyutu ar olarakEA-altında-eğrisi% 80 (R, _A) ve tepe genliği (R _amp), yanıt başlangıç ​​kinetikleri (t _yükselmesi R _amp% 20 ila% 80 arasında bir zaman aralığı) ve çıkıntı (t _çürüme, zaman aralığı R _amp% 20) kadar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. mutlak Ca ^{2 +} konsantrasyonu tahmin. Dinlenme Ca ^{2 +} konsantrasyonu ([Ca ^{2 +]} oran F _A / F _D gibi) TN-XL fare 8 koni akson terminallerinde kaydedilen (çevrelerin, SD ± ortalama) Farklı hücre dışı solüsyonlar için: iki kez standart bir hücre dışı ortamda (Ctrl 1 ve 2), daha sonra en az ("sıfır"), [Ca2 ^+] (10 mM EGTA) ANYüksek [Ca ^{2 +]} (2.5 mM) ile d dışı ve hücre içi Ca ^{2 +} dengelenmeye iyonomisin 5 mcM varlığında son iki koşul. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Elektrofizyolojik tek hücreli kayıtları veya sentetik floresan göstergeler Ca ^{2 +} görüntüleme kullanarak Önceden var olan protokoller teknik nedenlerle (bkz) bir dizi için fare koni fotoreseptör Ca ²⁺ dinamiklerini kaydetmek için mücadele ediyoruz. Burada açıklanan protokol Ca ^{2 +} sinyalleri ve verimli ve nispeten basit bir şekilde bireysel, belirlenen fare koni terminalleri bile mutlak Ca ^{2 +} düzeyleri ölçülebilir.

Bu protokol zaten başarıyla sağlıklı fare retinadaki koni fonksiyonunun farklı yönlerini ele üç çalışmalarında kullanılmıştır. İlk çalışmada ¹⁰ yılında HR2.1: TN-XL fare Ca ^{2 +} biyosensör koni özgü ifadesi engel olmadığını gösteren immünohistokimya, ERG kayıtları, iki foton Ca ^{2 +} görüntüleme ve farmakoloji kullanılarak karakterize edildi koni anatomisi ve işlevi. İkinci çalışmada ^21, kromatikve fare koni akromatik tepki özellikleri "yeşil" opsin hakim olduğu dorsal ve "mavi" opsin hakim olduğu ventral fare retina arasındaki koni fonksiyonu çarpıcı farklılıklar gösteren, retina üzerinde haritalanmıştır. Koni özelliklerinde Bu bölgesel farklılıklar fare kozalakları farklı spektral tipi dolayısıyla akromatik zıtlıkların (yakın) en uygun örnekleme sağlamak ve düşündüren, doğal ortamda diferansiyel kontrast dağılımı (yani, toprağa karşı gökyüzü) uyumlu bir sunabilir evrimsel bir avantaj. Koni akson terminalleri yatay hücrelerden aldığınız üçüncü çalışmada ²² karşılıklı geribildirim araştırıldı. Tüm önerilen yatay hücre geribildirim mekanizmaları koni akson terminallerinde ²⁸ voltaj kapılı Ca ²⁺ kanalları üzerinde hareket gibi, koni terminali Ca ^{2 +} yatay hücre-koni etkileşimleri için bir proxy olarak hizmet verebilir. Kemmler tarafından çalışma ²² destekler coworkersgörünüm yatay hücreler fotoreseptör glutamat salınımını kontrol etmek için çeşitli mekanizmalar içeren karmaşık bir geribildirim sistemi kullanmak olduğunu.

Bu çalışmalar, tarif edilen protokol çok yönlülüğünü göstermekte ve bu koni fonksiyonu ve sinaptik devreleri ilgili sorular geniş bir şekilde adapte edilebilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, protokol koni fizyolojisinin daha iyi anlama yolunda, farklı koni bölümlerinde yerel Ca ^{2 +} sinyalizasyon okuyan mümkün kılar. Böyle bir bilginin sonunda koniler etkileyen dejeneratif hastalıklar için özellikle potansiyel terapötik yaklaşımların rasyonel gelişimi için izin, dejenere koniler patofizyolojik süreçleri anlamak önemlidir.

HR2.1 olarak: TN-XL, fare hattı, Ca ^{2 +} biyosensör dış segmenti hariç olmak üzere, koni boyunca ifade edilir. Bu Ca ^{2 +} dinamik doğrudan ve rasyometrik değerlendirilmesi için bir fırsat sağlarFarklı konik bölümlerinde s. Ca değişim yana dış segmente ^{2 +} akımları membran potansiyeli ve voltaj kapılı Ca ^{+ 2} kanal elde edilen aktivasyonu yoluyla terminalleri yansıtılır, dış segmente işlemler dolaylı gözlenebilir.

Potansiyel tuzaklar:

retina diseksiyonu kritik bir adımdır: Fare, retina genellikle fotoreseptör dış segmentleri ve pigment epiteli arasındaki Göz yuvası ayrılır. Bu nedenle, izole retinanın ışığa duyarlı fotoreseptör dış segmentleri maruz kalır ve mekanik hasarlara karşı son derece duyarlı. Büyük bakım araçları ile fotoreseptör tarafı dokunarak veya yapışkan yüzeyinde yan (örneğin, bir filtre membran) doku taşıyarak zarar vermemeye dikkat edilmelidir.

Kaliteli retina dilim onların temiz kesim yüzeyi tarafından mikroskop altında kabul edilebilir veaçıkça tanımlanmış dış kesimleri ile iyi organize fotoreseptör tabakası ile. Dilim kalitesinin Fonksiyonel değerlendirme hızla (- 20 kozalakları 10 ile bir görüş alanı, örneğin), parlak ışık uyaranları yanıp sönen ve duyarlı koni yüzdesi belirlenerek yapılabilir. Burada, tepki kalitesi sinyal-gürültü oranı (S / N) (ışık tepkisi genliği vs ışık uyaran önce bazal gürültü genliği) hesaplanarak değerlendirilmelidir; S / 2 N - 3 minimum eşik olarak kabul edilmelidir. Tipik olarak, biz% 50'den az duyarlı konik dilimleri atın. Ayrıca aşırı spontan spike davranışı ^(10'a bakınız Şekil 4) atılmalıdır görüntüler kozalakları ile dilimler.

Söz konusu anatomik ve fonksiyonel kriterlere uygun kayıt odasında Dilimler 1 için tutarlı tepkiler göstermek - 2 saat (yanıt tutarlılık ile ilgili ayrıntılar için, ¹⁰ bakınız). Dilimler saat hayatta Çünkütutma odasına bizimki, başarılı bir deney 6 saat kadar sürebilir. Bu dilimleme kaçınılmaz retina ağlarda yanal bağlantıları koparır olarak koni ve yatay hücreler arasında uzun değişen mekânsal etkileşimleri inceleyerek açısından bazı sınırlamalar vardır dikkat çekicidir. Ancak, 300'e um retina dilim kalınlığını artırarak bu sorunu ²² iyileştirmektedir.

Dikey retina dilimlerinin kullanımı, büyük ölçüde ^(10,21 bkz detaylı bir tartışma için) opsin ağartma önler ve böylece, uyarım lazer ile ışık duyarlı konik dış bölümlerin tarama önler ve. Bununla birlikte, kaydedilen Ca ^{2 +} sinyalleri sadece hafif uyaranlara bağlı değil, aynı zamanda tarama uyarma lazer tarafından oluşturulan bir arka plan aydınlatması bileşeni tarafından etkilenen olsun. Aslında, bu tür iki-fotonlu görüntüleme deneylerde etkili bir arka plan aydınlatması dağınık lazer ışığı, kaydedilen CE tarafından yayılan flüoresans ışınlarının bir kombinasyonu olup,lls ve herhangi bir LED arka plan uyaran bileşeni. Kayıttan önce (çalışır durumda, ışık uyarısının arka bileşenle) lazer taraması 30 s - Bu nedenle, koniler, en az 20 adapte izin verilmelidir.

Avantajları ve uygulamalar:

Koniler sinyal yolları ^{2 +} Ca doğrulayabilir konik Ca ^{2 +} görüntüleme ile kombinasyon halinde farmakolojik çalışmaları ve şunlar olabilir: Bu koni Ca ^{2 +} -imaging protokolü için bazı uygulamalar ^10,21,22, yukarıda tarif edilmiş olsa da, diğer uygulamaları tasavvur edilebilir etkinlik ve Ca farklı oyuncular hedefleme ilaçların gücünü test etmek için kullanılır ^{2+ 10'a} -signaling. Ancak, anahtar uygulama koni işlevini etkileyen hastalıklar incelemek için olabilir. Insan hastalıkları taklit eden pek çok retina dejenerasyonu fare modelleri mevcuttur. Örneğin, koni fotoreseptör kaybı 1 (cpfl 1) fare primer koni dejenerasyon modeli acı olduğunuBir Pde6c mutasyon ²⁹ arasında. Tersine, çubuk dejenerasyon 1 (rd 1) Fare Pde6b mutasyon muzdarip. Bu birincil çubuk fotoreseptör dejenerasyonu, ^{30 1'de} rd 1 çubuk kaybı tamamlandığında, ikincil koni dejenerasyon setleri neden olurken. HR2.1 bu hayvanların melezleme: TN-XL hat okuyan ve hem birincil hem de ikincil koni dejenerasyon Ca ²⁺ dinamiklerini karşılaştırarak izin ve koni hücre ölümü sırasında Ca ²⁺ rolüne dair değerli içgörüler sağlamaya muhtemeldir olacaktır. Ayrıca, farmakolojik koni dejenerasyon kaynaklı - örneğin seçici PDE6 inhibitörleri kullanan - koni dejenerasyon ^10,29,31 aşağı mekanizmaları tanımlamak için hizmet edebilir.

Özetle, protokol burada fare koni fotoreseptör hücre içi bölümlerinde Ca ^{2 +} ölçmek izin verir ve geniş bir yelpazede altında koni fizyolojisini ortaya çıkarmak için büyük fırsatlar sunuyor tariffizyolojik ve patofizyolojik durumların. Buna ek olarak, bu protokol koni Ca ^{2 +} -signaling müdahale ve böylece konik hastalıklar için yeni tedaviler kurmak için tasarlanmış farmakolojik maddelerin taranması için kullanılabilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yüksek vakumlu gres	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Kapak fişleri	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Cam slaytlar	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Doku doğrayıcı için bıçaklar	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Doku doğrayıcı	Özel yapım		F. Werblin23 tarafından tasarlanan bir tasarıma dayalıdır, T. Schubert tarafından
uyarlanmıştır Nitroselüloz filtre membranı ızgaralı	Merck Millipore AABG01300		Filtre tipi: 0,8 ve mikro; m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP	CP pharma	AP/DRUGS/220/96<	a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de
UV/yeşil LED tabanlı tam alan stimülatörü	Özel yapım		Ayrıntılar için bkz10
Açık kaynaklı mikroişlemci kartı	Arduino		http://www.arduino.cc
Görüntüleme yazılımı CfNT	Özel olarak yazılmış		, Michael Mü tarafından geliştirilen; ller, Tıbbi Araştırma için MPI, Heidelberg, Almanya
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Sistemi fokal perfüzyon sistemi	ALA Bilimsel Alet		; m çaplı uç manifoldu; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Safir lazer)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Hareketli objektif mikroskobu (MOM), W. Denk, MPImF, Heidelberg, Almanya tarafından tasarlanmıştır	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w objektif	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 serisi	Surgivet<		a href="http://www.surgivet.com/ ">http://www.surgivet.com
İyonomisin, Kalsiyum tuzu	Yaşam teknolojileri	I24222	http://www.lifetechnologies.com
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	https://www.sigmaaldrich.com
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	101191250	http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95	leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/