Yöntem makalesi

Fare Koku Ayrımcılık ve alışkanlık için test

18.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52615

⸱

5 Mayıs 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, kemirgenlerin koku alma sistemini incelemek için bir protokolü açıklar. Koku alma alışkanlığı / alışma testi, araştırmacıların bir farenin tekrar tekrar sunulan bir kokuya alışıp alışmadığını ve farenin yeni bir koku sunulduğunda alışkanlık bozukluğu gösterip göstermediğini belirlemesine olanak tanır.

Özet

Bu video, bir farede normal şekilde çalışan bir koku alma sisteminin varlığını belirlemek için bir teknik göstermektedir. Test, farenin sosyal olmayan kokular ile sosyal kokular arasında ayrım yapıp yapamayacağını, farenin tekrar tekrar sunulan bir kokuya alışıp alışmadığını ve farenin yeni bir koku ile sunulduğunda alışkanlık gösterip göstermediğini belirlemeye yardımcı olur. Birçok sosyal davranış testi, deney hayvanının tanıdık veya yeni bir fareye verdiği tepkiyi ölçtüğü için, hayvanların sosyal kokuları algılayabildiğini ve ayırt edebildiğini tespit ederek yanlış pozitiflerden kaçınılabilir. Yeni bir ortam yaratmak için kokuyu veya çağrışımsal bir uyaran olarak koku ipuçlarını kullanan korku koşullandırması gibi öğrenme testlerinde de benzer hususlar vardır. Koku alma sistemindeki eksiklikler, korku koşullandırması sırasında bağlamlar arasında ayrım yapma ve koku alma ipucu ile bir ilişki kurma yeteneğini bozacaktır.

Koku yerleşimi/alışma testinde, fareye tekrar tekrar birkaç koku sunulur. Her koku iki dakika boyunca üç kez sunulur. Araştırmacı, kokuya yönelik koklama süresini, koku alma tepkisinin ölçümü olarak kaydeder. Tipik bir fare, tekrarlanan sunumlar (alışkanlık) üzerine kokuya yanıt olarak bir azalma gösterir. Deneyci daha sonra yeni kokuya karşı artan koklamayı ortaya çıkaran yeni bir koku sunar (alışkanlık bozukluğu). Yeni kokunun tekrar tekrar sunulmasından sonra, hayvan tekrar alışkanlık gösterir. Bu protokol suyun, iki veya daha fazla sosyal olmayan kokunun ve iki sosyal kokunun sunumunu içerir. Deneysel karışıklıkları azaltmanın yanı sıra, bu test yeni nakavt, knock-in ve koşullu nakavt fare hatlarının koku alma sistemlerinin işlevi hakkında bilgi sağlayabilir.

Giriş

Fareler diğer bireylerin tanımak için, yiyecek bulma, yeni ortamlar seyrüsefer olfaction bağlıdır ve cinsel davranış 1-3. Bu araştırmacılar deney hayvanları yiyecek, sosyal etkileşim, ya da fare bir yanıt ortaya çıkarmak amacıyla herhangi bir koku içeren davranışsal testler uygulamadan önce koku işleyen duygusuna sahip olsun ya da olmasın kurmak esastır. Anozmi veya yetersizlik davranışsal paradigmaların çok çeşitli yanlış pozitif veya negatiflerin yol açabilir, farklı kokulara ayırt etmek, yani davranış testleri diğer türleri yapılmadan önce tespit ve kokuları ayırt etmek için bir farenin kabiliyeti kurulmalıdır.

koku alışkanlık / dishabituation testi ilk olarak 1980'li yıllarda 4 tarif edilmiştir. Test Dr farelerde kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Mu Yang ve Jacqueline Crawley 5. Bu araştırmacı esta sağlayan basit ve ucuz bir testtirFare algılamak ve kokuları ayırt edebilir Blish. Koku alma test ek olarak, bu test araştırmacı fare genel davranışını gözlemlemek ve erken test rejiminde yapılmalıdır sağlar. Nitel farenin lokomosyon ilişkin gözlemleri, anksiyete belirtileri, aktivite düzeyi ve gıda kokuları karşı toplumsal kokulara tepki testi yapılabilir hangi yeni alanlara işaret ediyor olabilir.

Bu testte, çeşitli kokular daldırılır pamuklu bir satırda bir fare üç kez sunulmaktadır. Bir koku her tekrarlanan sunumu ile fare sonraki her bir sunum ile araştıran az zaman harcayarak, pamuklu çubukla alışmakta olacaktır. Yeni bir koku sunulduğunda, dishabituation oluşur ve tipik bir fare mevcut ve önceki kokuları 5 arasında ayrım olduğunu belirten çubukla araştıran daha fazla zaman geçireceksiniz. Bu test, her seferinde bir fareye uygulanan ve 45 dakika acc içerirlimation süresi test 45 dakika izledi.

Bu testi taşıması kolay olmasına rağmen, fare koku sistemi hakkında sofistike soruları araştırmak için kullanılabilir. Gömülü Gıda testi gibi koku alma diğer popüler testler, sadece anozmi varlığını veya yokluğunu tespit. Ancak, koku ayrımcılık ve alışkanlık testi araştırmacı fare kokuları algılamak için ancak farklı kokular ayırt edebilir yeteneğine sahip değil sadece belirlemenize olanak sağlar. alışkanlık ve dishabituation desen yeni mutantlar kokuları 6,7 arasında ayrım olduğunu belirlemek için kullanılır olmuştur. Şaşırtıcı bir çalışmada, Fadool ve arkadaşları normal farelere 8 daha çok benzer kokuları ayırt edebilir "süper smellers" Kv1.3 kanalının gen hedefli silme ile bu fareler vardır göstermek için kokuların kompleks karışımlarını kullanılır.

Yeni bir nakavt fare modelini incelerken o establis yararlıdırh temel duyu görevler için normal davranış varlığı. Bir test rejiminde erken Bittiğinde, koku ayrımcılık ve alışkanlık testi bir araştırmacı herhangi bir olağandışı davranışları gözlemlemek için fırsat verir. Bu gözlemler mutant özelliklerini karıştırıcı atfedilebilecek sonraki test yanlış pozitif veya negatif sonuçları önleyebilir. Araştırmacılar sosyal davranışı, temel koku işlevini doğrulamak için gereğini araştırmak devam ederken giderek daha önemli hale gelir. Mutant hatlarında koku alma duyusunu inceleyen yanı sıra, bu test gibi tüm koku uyaranlara karşı bir farmakolojik tedavi özellikle sosyal koku uyaranlara bir hayvanın tepkisi artar olmadığı gibi ya da tepki artarsa ​​belirli soruları için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıdaki deneyde kullanılan yetişkin erkek fareler, yeniden oluşturulmuştur ve koyu bir 14 saat ışık ve 10 saat (20:00-6:00 saat) gündüz döngüsü, 22 ° C'lik bir çevre sıcaklığında Baylor Üniversitesi'nde barındırıldı. farenin yemek ve su ad libitum verildi. Farelere tüm işlemler Baylor Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı ve hayvansal protokolü için Sağlık Rehberi National Institutes uygun idi. Fareler geç sabah / öğleden sonra test edilmiştir. Araştırmacı altındaki tüm prosedürler için kokuları ortadan kaldırmak ve kirlenmeyi önlemek için eldiven giymeli.

Sigara sosyal Kokular 1. Hazırlanması

  1. Taze olmayan sosyal edici kokuları test her gün hazırlayın.
    Not: Araştırmacı kokuları hazırlamak için eldiven kullanmalıdır.
    1. Su, her biri 10 ml 3 santrifüj tüplerini doldurun.
    2. 15 ml & # içine muz ekstresinin Pipet 100 ul160; konik tüp ve 1 için bir ikinci 15 ml konik bir tüp içine badem özü 100 ul: 100 seyreltide kullanıldı.
      Not: Üçüncü 15 ml tüp sadece su ihtiva edecektir.

Sosyal kokuların 2. Hazırlık

  1. Meydana gelecektir sabah testi taze sosyal kokuları hazırlayın. En az üç gün süreyle temizlenmiş ve farelerin eşit sayı içeren henüz iki kafesleri sosyal kokuları edinin. Denek olarak aynı cinsten farelerin sosyal kokuları edinin.
    Not: Bu, oda sıcaklığında saklanabilir ve güçlü ve sürekli bir koku sağlamak için 4-6 saat içinde kullanılmalıdır.
    1. Pamuklu çubuk ihtiyacımız sosyal koku oluşturulacak kaç belirleyin: test edilen her bir fare sosyal koku 2 sosyal koku 1 ve üç üç bezlerden ile sunulacak.
    2. Kirli bir kafes alt kısmında bir zikzak biçimde bir pamuklu çubukla silerek sosyal kokuları hazırlayın. Ucuna tutunarak herhangi bir aşırı yatak silkeleyin.
    3. Kapaklı veya parafilm kaplı bardak büyük cam kavanozlarda saklayın bezlerden. Tek sosyal koku 1 konteyner ve sosyal koku 2 için ikinci belirleyin.
  2. Deneysel test odası dışında koku kaynağı kafesleri koruyun.

Deney Mouse 3. Acclimation

  1. Eldiven giyin ve test edilecek fare tartmak ve üstüne bir tel kapak ve kaldırıldı su şişesi ile temiz bir kafese ayrı ayrı yerleştirin.
  2. Fare test odasına başka bir odada 45 dakika yeni kafes gelmesini bekleyin. Odaya hiçbir olağandışı koku veya gürültü olmadığından emin olun.
  3. Test yaklaşık 45 dakika sürer gibi, mevcut fare test etmeden önce hakkını gelmesini temiz bir kafes içine test edilecek bir sonraki fare koyarak aklimasyonundan kez sendeleyip.

Test Odası 4. hazırlanması

  1. Taze pamuk bezlerden, laboratuvar bant, sosyal koku bezlerden içeren şişeleri, n tüpleri yerleştirinon-sosyal kokuları, bir mikropipet, iki zamanlayıcı ve test odasında kapaklı bir çöp şişe.
  2. Test odası kokuları, yüksek sesler ve parlak ışık oldukça serbest olduğundan emin olun. Kokulu kolonya ya da losyon giymeyin.
    Not: Gözlemci test süresince sakız veya şeker çiğneme olmamalı ve güçlü bir koku gıdalara maruz kaldıkları sınırlamak için çalışmalısınız.

5. Test Prosedürü

  1. Test odasına kendi kafesine alıştırıldı fareyi getirin ve otururken görüntülemek için rahat bir yükseklikte tezgahın üzerine kafes yerleştirin.
  2. 2 dakika her zaman için bir satır, her, koku 3 kez sunun. Tablo 1'de bulunabilir sunum sırasını kullanın.
    1. Pipet kokusu odorant 50 ul pamuklu çubukla ucuna test ve koku kaynağı-keper yeniden edilecek. Pushin, kafesin tel üst kaldırın ve su şişesi ağzına çubukla kokusuz, ahşap ucunug üstüne tel altından aracılığıyla uzunluğu. O koku kirlenmesi önlenmiş olur, böylece parmaklar dahil her şey, pamuk ucuna dokunmaktan kaçının.
    2. Pamuk sonu yaklaşık 1 inç kafes içine aşağı sarkar kadar su şişesi açıklığından çubukla çizmek devam edin. Laboratuvar bant kullanarak kafesin yanına çubukla ahşap ucunu yapıştırın.
      Not: Kapak kafesine geri üzerine düşmesine izin vermemek için dikkatli olun, sınav fare rahatsız edecek bir gürültü neden olur.
    3. Hemen 2 dakika süreyle zamanlama başlar. 2 dk sunum zaman bir zamanlayıcı kullanın. 2 dk deneme sırasında koku koklama harcanan toplam zamanı kaydedin. Ayrı bir kronometre kullanarak hayvanın koklama davranışını güvenin. Hayvanın burnu onun burnu ~ 2 cm veya ipucu yakın pamuk ucuna yönelik olduğunda aktif koklama tanımlanır.
    4. Her deneme tamamlanmasından sonra, tel kapağı kaldırın ve un aşağı doğru çekerek pamuklu çubukla kaldırmakKapağın derside (bu tel dokunmasını pamuk ucu önleyerek koku kirlenmesini önler). Bir 500 ml atık şişe kullanılan bez kapatın.
    5. Hazırlayın ve sonraki çubukla takın ve zamanlama başlar. Her arası deneme aralığı arasında yaklaşık 1 dakika bekleyin. Her koku 2 dakika her zaman için, üst üste üç kez sunulmuştur kadar devam edin.
  3. Fare tüm denemeler tamamlandıktan sonra, can dışarıda test odasında bir çöp kullanılan pamuklu çubuklarla içeren atık şişesini boşaltın. Evde kafes fare dönün.

6. Analiz

  1. ANOVA Newman-Keuls ardından iki yönlü veya önemli alışkanlık belirlemek için benzer bir post hoc testi (ardışık aynı kokuyor koklama az zaman) ve dishabitutation (daha fazla zaman yeni bir koku koklama) ile koku durumuna başına her bir grup için verileri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tarif edilen protokol izlenerek, sonuçları on yetişkin (doğum sonrası gün 90-120) erkek C57BL / 6J fareler sekiz erkek FVB karma arka suşu (doğum sonrası gün 50-70) kullanılarak kaydedildi. Test birden fazla gün boyunca tek bir araştırmacı tarafından yürütülmüştür. Grafikler her nokta bir koku araştıran harcanan ortalama süreyi temsil eder.

Suya batırılmış pamuklu ilk tanıtıldı zaman, fareler bu yeni nesneyi (: İlk üç veri noktaları Şekil 1) araştıran zaman büyük bir harcama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede yer alan sonuçlar fareler için en uygun olan. farelere yeni bir koku güçlü bir tepki göstermektedir, daha sonra hızlı bir şekilde alıştırarak. Bu yöntemde önemli safhalardan biri kokuların hazırlanmasıdır. Araştırmacı kirlenmesini önlemek için birbirinden kokuları izole etmek büyük özen gerekiyor. Başka bir önemli yönü pamuklu çubukla sunumudur. Fare ucu araştırabilir ama ucunda gözyaşı değil bu yüzden araştırmacı pamuk ucu en iyi yer giderilir gerekiyor. Testin önemli bir bileşeni, koku seçimidir. Biz üç so...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Baylor Üniversitesi Araştırma Konseyi hibesi ve Epilepsi Vakfı'ndan bir araştırma bursu ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fare kafesiAllentownStandart fare kafesi
Tel kapakAllentownBCU Fare WBL 2500
Yatak takımıHarlan7090 Sani-Chips
Pamuklu çubuklarVWR89031-2706" ahşap sap
Muz özüMcCormick
Badem özüMcCormick
Laboratuvar bandıVWR89098-062
KronometreVWR62374-000
Nitril eldivenVWR82026
Zamanlama cihazıVWR61161-350
15 ml konik tüplerVWR89003-294
2 L beherler Pyrex1003
Parafilm ParafilmPM-9924" x 250'
1 L kapaklı şişeVWR89000-240

Kaynaklar

  1. Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
  2. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
  3. Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
  4. Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
  5. Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
  6. Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
  7. Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
  8. Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
  9. Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
  10. Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
  11. Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
  12. Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
  13. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
  14. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
  15. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Koku Al kanlOlfakt r SistemSosyal KokularSosyal Olmayan KokularFare DavranKoklama DavranAl kanl k TestiAl kanl n BozulmasOlfakt r Yan t Verme

İlgili makaleler