Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

Summary

Bu protokol, biyoişlevselleştirilmiş Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezini ve bunların multimodal, moleküler görüntüleme ajanları olarak kullanımlarını açıklar. Nanopartiküller, nanopartikül çekirdeği içindeki gadolinyum veya manganez iyonlarının MRI kontrastı oluşturduğu bir çekirdek kabuk tasarımına sahiptir. Biyofonksiyonel kabuk, floresan görüntüleme için floroforlar ve moleküler hedefleme için hedefleme ligandları içerir.

Abstract

Modlu, moleküler görüntüleme birden, tamamlayıcı görüntüleme teknikleri kullanılarak, hücresel hücre içi ve moleküler seviyede çözünürlüklerde biyolojik süreçlerin görselleştirme sağlar. Bu görüntüleme ajanları, diyagnostik ve terapötik etkinliği arttırmak, in vivo olarak yollar ve mekanizma, gerçek zamanlı bir değerlendirme kolaylaştırır. Multimodal, moleküler görüntüleme uygulamalarında kullanılmak için ajanlar yeni bir sınıfının - Bu madde biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi (PB Nps) 'daki protokole sunulur. nanopartiküller, floresan görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) dahil görüntüleme yöntemleri, tamamlayıcı özelliklere sahip. PB NPler gadolinyum ve manganez iyonlarının T ₁ ve T ₂ -ağırlıklı sekansları, hem PB kafesinin ara boşluklar içine dahil MRT-kontrast oluşturmak bir çekirdek-kabuk tasarıma sahiptir. PB NPS elektrostatik kullanarak floresan avidin ile kaplanmıştır kendini olarakFloresan görüntülenmesine olanak sağlar onel. Avidin kaplı nanopartiküller nanopartiküller moleküler hedef yetenekleri veren biyotinlenmiş ligandları ile tadil edilmiştir. nanopartiküllerin istikrar ve toksisite kendi MRG relaksivitelerine yanı sıra, ölçülür. Bu biofunctionalized PB NPlerin multimodal, moleküler görüntüleme yetenekleri daha sonra floresan görüntüleme ve in vitro moleküler MR için bunları kullanarak gösterilmiştir.

Introduction

Moleküler görüntüleme hücresel, subsellüler biyolojik süreçler ve moleküler seviyede ¹ non-invaziv ve hedeflenen görselleştirme. Moleküler görüntüleme endojen yollar ve mekanizmalar gerçek zamanlı olarak değerlendirilirken doğal mikro-kalmasına bir örnek verir. Tipik olarak, moleküler görüntüleme ² çalışılan görselleştirmek hedef ve ilgili fizyolojik süreçleri izlemek için küçük bir molekül, makromolekül, veya nanopartikül formunda bir dışsal görüntüleme ajanın verilmesini içerir. moleküler görüntüleme araştırılmıştır olan çeşitli görüntüleme yöntemleri MR, CT, PET, SPECT, ultrason, photoacoustics, Raman spektroskopisi, ışıldaması, floresan ve intravital mikroskopi ³ içerir. Multimodal görüntüleme kombinasyonu görselleştirmek ve çeşitli biyolojik süreçleri ve olayları ⁴ karakterize yeteneğini geliştirir, iki veya daha fazla görüntüleme yöntemlerinin birleşimidir. Multimodabireysel sınırlamalar ³ telafi ederken l görüntüleme, bireysel görüntüleme tekniklerinin güçlü patlatır.

Multimodal, moleküler görüntüleme maddeleri için yeni bir sınıf - Bu madde biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezi (PB Nps) 'daki protokole sunulur. PB NPS floresan görüntüleme ve moleküler MR için kullanılmaktadır. PB yüzey merkezli kübik ağ demir (II) ve demir (III) atomu alternatif oluşan bir pigment (Şekil 1). CN - - üç boyutlu ağın ⁵ içindeki ücretleri dengelemek için katyonları içerir Fe ^III bağlantısı PB kafes Fe ^II lineer siyanür ligandların oluşmaktadır. onun kafes içine katyonları dahil PB yeteneği ayrı ayrı MRG kontrast PB NPlerin içine gadolinyum ve manganez iyonları yüklenerek istismar edilmektedir.

MRG kontrast bir nanoparçacık tasarım peşinde gerekçesi nedeniyle olduğunuavantajları bu tasarım mevcut MR kontrast ajanlar göre sunmaktadır. ABD FDA onaylı MRG kontrast maddelerin büyük çoğunluğu doğada paramanyetik olan ve spin-örgü gevşeme mekanizması ^6,7,8 pozitif kontrast sağlayan gadolinyum şelatlarıdır. Kendi başına düşük sinyal yoğunluğu sağlayacak tek gadolinyum şelat ile karşılaştırıldığında, nanopartiküller PB kafes içinde çok sayıda gadolinyum iyonu dahil sinyal yoğunluğu (pozitif kontrast) ^3,9 şarlar. Ayrıca, PB kafes içinde birden gadolinyum iyonlarının varlığı dolayısıyla spin-spin gevşeme mekanizması negatif kontrast yaratan, genel sıkma yoğunluğu ve çevresinde yerel manyetik alan bozan nanopartiküllerin paramagnetizmanın büyüklüğünü artırır. Böylece gadolinyum içeren nanopartiküller T (pozitif) ₁ ve T ₂ (negatif) kontrast maddeler ^10,11 hem işlev.

Böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda bir alt grubunda, gadolinyum bazlı kontrast maddelerin uygulanması nefrojenik sistemik fibrozis ^{8,12, 13} gelişimine bağlı olmuştur. Bu gözlem kontrast ajanlar gibi alternatif paramanyetik iyonların kullanımı için soruşturma açtı MR. Bu nedenle, nanopartiküller yönlü tasarım PB kafes içinde manganez iyonlarını da uyarlanmıştır. Gadolinyum şelatları benzer şekilde, mangan şelatlar, para-manyetik olan ve tipik olarak MR ^7,14 pozitif sinyal yoğunluğu sağlamak için kullanılır. Gadolinyum içeren PB NPler gibi manganez içeren PB NPler da (pozitif), T ₁ ve T, ₂ (negatif) kontrast maddeler olarak işlev görürler.

Flüoresan görüntüleme yetenekleri birleştirmek için, nanopartikül "çekirdekler" floresan etiketli glikoprotein avidin oluşan bir "Biyofonksiyonel" kabuk (Şekil 1 ile kaplanır). Avidin sadece floresan görüntüleme sağlayan, aynı zamanda belirli hücreleri ve doku hedef biyotinli ligandlar için bir yerleştirme platformu olarak hizmet vermektedir. avidin-biyotin bağ avidin ve biotin ¹⁵ ile son derece güçlü bir bağlanma afinitesi ile karakterize güçlü bilinen, kovalent olmayan bağlar biridir. avidin kaplı PB NPlerin için biyotinilatlı ligandların eki PB NPlerin moleküler hedefleme yetenekleri verir.

Bu görüntüleme yöntemleri tamamlayıcı özelliklere sahip çünkü PB NPs kullanarak floresan ve MR görüntüleme takip için motivasyondur. Floresan görüntüleme en yaygın kullanılan optik moleküler görüntüleme tekniklerinden biri olan ve yüksek hassasiyetleri ^1,16,17 anda birden fazla nesne aynı anda görselleştirme sağlar. Floresan görüntüleme güvenli, non-invaziv bir tedavi yöntemidir ancak düşük penetrasyon derinlikleri ve mekansal çözünürlüklerde ^1,3,16 ile ilişkilidir. Öte yandan, MR yüksek zamansal An üretird uzaysal çözünürlüğü non-invaziv ve radyasyon ^1,3,16 iyonlaştırıcı bir ihtiyaç olmadan. Ancak MRG düşük hassasiyet muzdarip. Bu nedenle floresan görüntüleme ve MR nedeniyle derinlik penetrasyonu, duyarlılık ve mekansal çözünürlük tamamlayıcı özellikleri moleküler görüntüleme teknikleri olarak seçildi.

Bu makalede, PB NP sentezi ve biofunctionalization için protokol sunulur, gadolinyum içeren PB NP (GdPB) ve manganez içeren PB NP (MnPB) ^10,11. Aşağıdaki yöntemler, tarif edilmektedir: 1) boyut, yük ölçümü ve nanopartiküllerin zamansal stabilitesi, MR relaksivitelerine 3) ölçüm nanopartiküllerinin sitotoksisite 2) değerlendirilmesi ve floresans ve moleküler MR için nanopartiküllerin 4) kullanımı in vitro olarak hedef hücre popülasyonunun. Bu sonuçlar, in vivo olarak çok modlu, moleküler görüntüleme maddeleri olarak kullanım için NP potansiyelini göstermektedir.

Protocol

PB NP GdPB ve MnPB 1. sentezi

Nanopartiküller (PB NPler, GdPB veya MnPB) sentezi aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirerek bir tek-kap sentez şeması kullanılarak elde edilir:

1. Çözeltisi hazırlayın 'A', deiyonize (Dİ) su içinde 5 mM potasyumkarbonat (II) 5 ml ihtiva etmektedir. Aşağıdaki gibidir: PB NPler, GdPB veya MnPB, çözelti "B" hazırlamak - nanopartikül tipine bağlı olarak sentezlenen
   1. Için PB NP: DI su içinde 2.5 mM demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak.
   2. GdPB NPlerin için: 2.5 mM deiyonize suda gadolinyumun biri (III) nitrat, demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak
   3. MnPB NPlerin için: 2.5 mM DI su içinde manganez biri (II) klorür ve demir (III) klorür ihtiva eden bir çözelti, 10 ml hazırlamak.
2. Yuvarlak tabanlı bir şişeye bir çözüm 'B' ekleyin ve oda sıcaklığında şişe içeriği (RT) karıştırıldı ve1.000 rpm. Çözüm 'A' damla damla yuvarlak dipli bir şişeye çözümü içeren 'B' içine ekleyin. Yaklaşık 10 ml / saat olarak dağıtmak için bir peristaltik pompa ile "B" çözelti "A" ilave edilmesi için akış hızını kontrol eder.
3. "B" çözelti "A" ilave edildikten sonra ek bir 30 dakika için oda sıcaklığında 1000 rpm'de karıştırma devam ediniz. Karıştırma durdurun ve karışımı toplamak.
4. Girmemiş bileşenlerin serbest nanopartiküller durulama mikrosantrifüj tüpler içine karışımın hacimde aktarın. Santrifüj ile parçacık toplama yardımcı olmak için her bir kana 5 M NaCl (0.2 mi NaCl / ml tepkime karışımı) ekleyin.
5. Santrifüj 20,000 x g 'de, en az 10 dakika boyunca nanopartiküllerin her bir sıvı bölüntü. Santrifüj işleminden sonra dikkatlice süpernatant kaldırmak.
6. Bir mikro uçlu (sonikasyon darbe kullanarak sonikasyon ile 1 ml Dİ su içinde her bir nanopartikül pelletini / kapalı = 1/1 saniye, genlik =% 50, süre =5 sn, sonikatör güç derecesi = 125 W) pelet kırmak için.
7. Tekrar nanopartiküller ilk tepki ve reaksiyon yan bileşenleri serbest olmasını sağlamak için 1,4-1,6 en az 3 × adımları. Nihai Santrifüj işleminden sonra, 1 ml Dİ su içinde parçacıklar yeniden süspanse edin.

PB NP GdPB ve MnPB 2. Biofunctionalization

Aşağıda tarif edildiği gibi nanopartiküllerin Biofunctionalization avidin ve biyotinile edilmiş ligandlan ekleyerek nanopartikül "çekirdek" bir kaplama içerir:

1. Floresan Avidin'e ile Nanopartiküller Kaplama
   Pozitif avidin (pl ~ 10.5) ¹⁸ aşağıdaki gibi negatif yüklü nanopartiküller üzerine kaplanır ücret nerede floresan avidin ile nanopartiküllerin Kaplama elektrostatik kendini derleme kullanılarak elde edilir:
   1. 1 ml Dİ su içinde PB NP, GdPB veya MnPB süspansiyonları hazırlanır. Alexa Fluor 488 etiketli avidin Filtre (A488, DI su içinde yeniden)10 dakika için 14,000 x g 'de, 0.2 um'lik bir naylon filtreden geçirilerek mikrosantrifüj. ≤0.2 mg, avidin mg / nano-tanecikleri ekleyin. PB NP GdPB veya MnPB alikolar ayrı A488 her süzüldü kısım ekleyin.
   2. 4 ° C'de nazik sallayarak veya rotasyon ile 2-4 saat A488 ile nanopartiküller başvurun. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan örnekleri koruyun.
      NOT: PB NPs (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), ve MnPB (MnPB-A488) kaplamalı Bu adım verimleri A488.
2. Biyotinile Antikorların Ek
   Aşağıdaki gibi avidin kaplı nanopartiküller kaplanan biyotinlenmiş hedef antikorların bağlanması, avidin-biyotin etkileşimi kullanılarak elde edilir:
   1. PB-A488, GdPB-A488 ve 1 ml Dİ su içinde MnPB-A488 - Avidin kaplı nanopartiküllerin süspansiyonlar hazırlayın. 10 dakika için 14,000 x g 'de bir 0.2 mikron naylon filtre içinden mikrosantrifüj biyotinlenmiş antikor (üretici tarafından tedarik edilen) filtre.
      NOT: Burada, bu çalışmada biotu kullanırinylated anti nöron-glia antijen 2 (Ang2) NG2 hücreleri ve merkezi sinir sistemi dokusu ve içinde aşırı ifade hedef biyotinile anti-insan eotaksini-3 eozinofillerin veya eozinofil hücre çizgileri üzerinde fazla sentezlenmiş reseptörlerin hedef (Eot3).
   2. Avidin kaplı nanopartiküllerin hacimde ayrı biyotinile antikor, süzüldü kısım ekleyin. ≤0.05 mg biyotinile antikor mg / avidin kaplı nano-tanecikleri ekleyin. Yumuşak, 4 ° C'de çalkalayarak veya döndürme ile 2-4 st için biyotinile edilmiş antikorların (Ang2 veya Eot3) ile avidin kaplı nano-tanecikleri başvurun. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan örnekleri koruyun.
      Not: Bu adım verimleri antikor kaplı nanopartiküller (örn GdPB-A488-Eot3 ve MnPB-A488-Ang2).

Nanopartiküller 3. boyutlandırılması, Zeta Potansiyeli ve Geçici Kararlılık

nanopartiküllerin boyut dağılımı, ücret ve istikrar, dinamik kullanılarak ölçülürışık saçılımı (DLS) yöntemleri, aşağıda tarif edildiği gibidir:

1. Nanopartiküller Boyutlandırma
   Nanopartiküller boyutlandırılması aşağıdaki gibi dinamik ışık saçılması ile elde edilir:
   1. Tek kullanımlık bir plastik küvet içinde DI su içinde 990 ul nanopartikül örnek (1 mg / ml) 10 ul ekle.
      NOT: Bu iyi bir DLS sinyali için temsili değerdir.
   2. Iyice karıştırın küvet ve vorteks Cap. Nanopartiküllerin boyutunu ölçmek için, parçacık büyüklüğü analiz etmek için kullanılan bir sistemde, küvet yerleştirin. 173 ° ölçüm açıyla partikül büyüklüğü analizi yürütmek.
2. Nanopartiküller zeta potansiyeli
   Aşağıdaki gibi nanopartiküllerin Zeta potansiyeli faz analizi ışık saçılması kullanılarak ölçülür:
   1. Bir tek kullanımlık plastik kılcal hücre DI suyun 900 ul nanopartikül örnek (1 mg / ml) 100 ul ekle. Bu değer iyi bir zeta potansiyeli ölçümü için temsilcisidir.
   2. Kılcal yerleştirin25 ° C 'de varsayılan parametreler kullanılarak, nanopartiküllerin zeta potansiyelini ölçmek için zeta potansiyelinin analiz etmek için kullanılan bir sistem y hücresi.
3. Nanopartiküller Zamansal Kararlılık
   Nanopartiküllerin Zamansal istikrar şöyle dinamik ışık saçılması ile ölçülür:
   1. DI su hem de Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde nanopartiküllerin boyutları ölçülerek nanopartiküllerin stabilitesini değerlendirmek.
   2. 5 günlük bir süre boyunca DI su ve DMEM bir kere / gün boyutu ölçümleri tekrar edin.

Nanopartiküller 4. Sitotoksisite

Aşağıdaki gibi nanopartiküllerin Sitotoksisite bir XTT hücre çoğalması tahlili kullanılarak ölçülmüştür:

1. Tohum 10,000-15,000 hücre / göz, her hücre tipi, 96 oyuklu bir plaka (Neuro2a BSG D10 EOL-1 ve OE21) incelenmiştir. Seribaşı hücrelerin toplam hacmi e değil emin olunxceed 0.2 ml / oyuk. Gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile Serpilen hücreleri, inkübe edin.
2. Hücrelerle nano-tanecikleri Bağlantı:
   1. (- 0.5 mg / ml 0.01) nanopartiküllerin değişen konsantrasyonlarda kuluçkaya bırakılır. (50 ul) nanopartiküllerin miktarda tanımlayan bir temsili bir tablo olarak, Tablo 1 'e bakın / Orta ila 50 ul çıkarılmasından sonra hücrelere eklendi.
      1. Tahlilinde nanopartiküllerin engelleyici emme hesaba katmak için, nanopartiküller, uygun konsantrasyonlarda oluşan bir boş eklemek (0-0.5 mg / ml hücrelere ilave miktarda eşdeğerliğine) hücreler olmaksızın ortama.
   2. 37 ° C'de gece boyunca nanopartiküller ile kuluçkaya bırakılır ve% 5 _CO2. Aspire ortamından her bir ve fosfat tamponlu çözelti (PBS) içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden bir lekeleme tampon maddesi ile durulanır. Fenol kırmızısı olmadan ortam 100 ul ilave edin ve 37 ° C'de ve% 5 _CO2 inkübe16-18 saat karıştırıldı.
3. Üreticinin özelliklerine göre kit bileşenlerini (XTT Reaktif ve XTT Activator) karıştırarak XTT Hücre Çoğalma Deneyi çalışma çözeltisi hazırlayın. Kuyu ortamı aspire ve çalışılan hücre tipi için uygun bir ortamda (/ o fenol kırmızı +% 10 FBS + 1 x Pen-strep w RPMI) RPMI 100 ul ilave edin. Her bir oyuğa, XTT çalışma çözeltisinin 50 ul ilave edin ve 2-2.5 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5.
4. Parmak izi veya leke düzeltmek için 630 nm'lik bir referans dalga boyu ile 490 nm'de absorbansı ölçülür. Her iyi için düzeltilmiş absorbansı (A _{490-A 630)} hesaplayın ve çoğaltır için okumaları ortalamasını.
5. Nihai düzeltilmiş absorbans değerlerini hesaplamak için her kuyuya değerinden boş okumalar çıkarın. Nanopartiküller olmadan muamele edilmemiş hücrelerin bu son düzeltilmiş absorbans normalize ederek, her numune için hayatta kalma yüzdesi hesaplanır. Arsa sunanopartikül konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak rvival yüzdesi.

5. MRG PB NPlerin relaksivitelerine, GdPB ve MnPB

MR relaksivitesi T ₁ kullanılarak ölçülür - ve T _2, aşağıda tarif edildiği gibi nano-tanecikleri içeren bir 96-çukurlu plaka kullanılarak MRI "hayalet" hazırlanmasıyla -ağırlıklı dizileri

1. Phantom Hazırlık
   1. Uygun konsantrasyonda ihtiva eden her bir göze 100 ul nanopartiküller (PB NPler, GdPB veya MnPB) ile 96 oyuklu plaka hazırlanması. Nanopartikül her türü için 0.4 mM konsantrasyonunda ile başlayarak, seri E ulaşılır 2.4 x 10 ^-5 arasında bir konsantrasyona kadar distile su ile nano-tanecikleri, 2 × seyreltin (bu 14 dilüsyonları, 15 kuyu gerektirir).
   2. Her bir kuyunun içine deiyonize suda eritilmiş% 1 agaroz çözeltisi 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Jel 12 saat için 4 ° C'de katılaşmaya izin verin.
      NOT: Bu seri dilüsyonlarını içeren bir hayalet verirKatılaşmış agaroz nanopartiküller aldılar.
   3. % 2 agar (150 cm ³⁾ katı bir blok altında yatay 3 T klinik mıknatıs hayalet yerleştirin. 8-kanal HD beyin bobin merkezi içinde agar hayalet ve blok sabitleyin. 96 gözlü plaka ¹¹ orta yükseklikte 0.5 mm kalınlığında koronal kesitler kullanılarak dinlenme süreleri ölçün.
2. T ₁ - T ₂ -ağırlıklı dizileri
   Klinik mıknatıs dizileri elde etmek için aşağıdaki temsili ayarları kullanın.
   NOT: Bu değerler bu çalışmada kullanılan nanopartiküller için optimize edilmiştir:
   1. T Edinme aşağıdaki sıvı zayıflatılmış inversiyon kurtarma (FLAIR) sekans kullanılarak ₁ -ağırlıklı (T1A) MR görüntüleri: tren Echo (ET) = 8, Tekrarlama zamanı (TR) = 2.300 msn, Echo zamanı (TE) = 24.4 msn, Matris boyutu = 512 x 224, Görüş alanı (FOV) 16 x 16 cm ² =.
   2. Aşağıdaki hızlı Relaxa kullanarak T ₂ -ağırlıklı (T2A) MR görüntüleri Edinmeyon hızlı spin eko (FRFSE) dizisi: ET = 21; TR = 3.500 msn; TE = 104 ms; Matris boyutu = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm ^2.
   3. Aşağıdaki inversiyon zamanlarda 127 MHz (3 T) T1A ve T2A MR görüntüleri elde: 50, 177, 432, 942, 1961, 4000 msn.
3. MRG relaksivitelerine Ölçme
   1. Bölüm 5.2 açıklanan dizileri kullanılarak T1A ve T2A görüntüleri aldıktan sonra, daha sonra, bundan böyle ana araç çubuğunda bulunan oval kırpma düğmesini kullanarak her yatırım getirisi seçerek ilgi (ROI) bölge olarak belirlenen her bir kuyunun kullanarak ImageJ için sinyal yoğunluğunu ölçmek > Ölçü analiz seçerek.
      NOT: Bir pop-up "Mean" etiketli sütununda her ROI ortalama sinyal yoğunluğunu göstermesi gerekir.
   2. Her ROI için, kendine özgü inversiyon zamana karşı ölçülen sinyal yoğunluğunu arsa. Gerekli invert noktaları arsa başında bir başlangıç ​​"kabarcık" ya da aykırı oluşturmak (okuma) (alt inversiyon isekez).
      NOT: MRG yerine ¹⁹ düzeltilmiş sorumluydu gereken gerçek (negatif) değeri / daha görüntülerin büyüklüğü veya mutlak değerini ölçen çünkü bu okumalar düşük inversiyon zamanlarda oluşturulur.
   3. Bölüm 5.2 de anlatıldığı gibi inversiyon kat vs ROI (SI) (T _I) için sinyal yoğunluğu her arsa için bir üstel uyum hazırlayın. X-ekseni üzerinde Konu T _I, y-ekseni SI; ɑ ve Δ regresyon ile belirlenir sabitlerdir, ve T, ₁ ya da T ₂ çözülecek değişken olup,
      
      nerede t T _1, T ₂ =.
   4. Yukarıdaki denklem kullanılarak T ₁ veya ₂ T için çözün ve her ROI kullanılan nanopartiküllerin konsantrasyonlarına karşı hesaplanan değerler (1 / T ₁ ve 1 / T ₂₎ tersini arsa.
   5. Lineer grafiğin eğimini hesaplamak hangirelaksiviteleri ₁ r ve ₂ r verir.
      NOT: Protokol Aşağıdaki bölüm floresan etiketleme ve hedeflenen hücrelerde üreten MRG kontrast nanopartiküllerin uygulamasını açıklar.

Konfokal Mikroskopi - Nanopartiküller kullanma Hedefli Hücre 6. Floresan Etiketleme

Not: nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) floresan aşağıdaki gibi (konfokal mikroskopi ile izlenmiştir) hedef hücrelerden oluşan bir popülasyonu etiketlemek için kullanılabilir:

1. Floresan Nanopartiküller Sentezi
   1. Bölüm 1 ve 2'de ayrıntılı olarak adımları hedef hücre popülasyonunun bir floresan etiketlemesi için GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-Ang2 sentez.
2. Hücrelerin Hazırlanması Floresans Hedefleme
   1. Coat hayır. 90 dakika boyunca% 0.002 poli (L-lisin), hidrobromür eden bir çözelti içine daldırılmak suretiyle 1.5 mikro örtücü camlar. Çözelti kapak gözlük çıkarın ve bunları 24 saat kurumasını bekleyin.
   2. Tohumlar hücreler (örneğin EOL-1 BSG D10, SUDIPG1) bir 6-yuvalı plaka içine yerleştirilmiş ve en az 16 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5 kaplamalı kapak gözlük. 1 x PBS çözeltisi ile hücrelerin durulayın (isteğe bağlı) 15 dakika boyunca nötr tampon çözeltisi içinde% 10 formaldehid ile sabitleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de, PBS içinde 5 uM kırmızı-turuncu hücreye nüfuz edici boya ile Leke hücreleri. Daha sonra, hücreler PBS ile yıkayın.
3. > Hedeflenen Hücre Floresan Etiketleme
   1. % 1 sığır serum albümini (BSA; DI su içinde) hücrelere hücreleri üzerinde spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek ve 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe etmek.
   2. 1 saat boyunca% 1 BSA içinde nanopartiküller ile hücreleri inkübe edin. EOL-1 için: 0.2 mg / ml GdPB-A488 veya GdPB-A488-Eot3 kuluçkalanması; BSG D10 ve SUDIPG1 için: 0.2 mg / ml MnPB-A488 veya MnPB-A488-Ang2 ile inkübe edilir. Unbou kaldırmak için PBS 3 × hücreleri durulayınnd nanopartiküller.
   3. Dikkatle içinde sıkışmış hava kabarcıkları vardır sağlanması, bir mikroskop lamı üzerine (hücreleri ve nanopartiküller içeren) cam kapak ters. Dikkatle net oje uygulayarak kapak cam ve mikroskop lamı arasındaki kenar Seal. Görüntü bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak hücreler.

Sitometrisi - Nanopartiküller kullanma Hedefli Hücreleri 7. Floresan Etiketleme

aşağıdaki gibi nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) floresan etiket (akış sitometrisi ile izlenmiştir) hedef hücrelerden oluşan bir popülasyonu kullanılabilir:

1. Hücrelerin hazırlayın süspansiyonları PBS hedef alınıyor. Saf kültür çalışmaları için, süspansiyonlar, tek bir hücre tipi (örn BSG D10) oluşur; 100,000 hücre / ml (10 ml toplam) ile PBS içinde BSG İşlem D10 hücreleri ve hücre pelletini. Karışık kültür çalışmaları için, süspansiyonlar en az iki hücre tipleri (örn EOL 1 ve OE oluşur21); (10 ml toplam) 100,000 hücre / ml her biri BSG D10, PBS EOL-1 ve OE21 ve tekrar süspansiyon hücre peletleri benzer.
   1. EOL-1 arasında değişen oranlarda hazırlayın: OE21 1: 0 (2 mi EOL-1), 3: 1 (1.5 mi EOL-1, 0.5 mi OE21), 1: 1 (1 mi EOL-1 ve OE21 her), 1: 3 (EOL-1 0.5 mi, 1.5 mi OE21), 0: 1 (2 mi OE21).
2. Hücreler (saf ve karışık süspansiyonlar) bloke spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için% 5 BSA ve 2 ml Nanopartiküllerin tarafından hedef.
3. Hücrelere 1 ml (1 mg / ml) nano-tanecikleri ilave edilir ve 1 saat süre ile inkübe edilir. BSG D10 için, MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (kontrol antikoru), ya da MnPB-A488-Ang2) hücreleri kuluçkaya yatmaktadır. EOL-1 ve OE21 karışımları için, GdPB-A488-Eot3 sabit bir miktarı ile karışımları inkübe edin.
4. Bağlanmamış parçacıkları kaldırmak için 5 dakika boyunca 1.000 × g en az 3 × örnekleri aşağı iplik bağlanmamış nanopartiküllerin ücretsiz hücreleri durulayın. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, PBS içinde% 10'luk formaldehid ile yapışması. 10 ug / ml ile inkübe edilerek Leke hücreleri30 dakika boyunca buz üzerinde PBS içerisinde 7-Aminoactinomytcin D. PBS ile durulayın, sonra bir akış sitometrisi kullanılarak her numune 10.000 geçirilen hücreler analiz eder.

Nanopartiküller kullanma Hedeflenen Hücreleri 8. Yaratma MR Kontrast

aşağıdaki gibidir: hedef hücre popülasyonu olarak - nanopartiküller (PB NPler, GdPB ve MnPB) (T ₂ -ağırlıklı dizileri her iki T ₁₎ MRT-kontrast oluşturmak için kullanılabilir

1. Phantom Hazırlık
   1. % 80 izdiham ~ kadar T75 matara hücreleri (örneğin BSG D10) büyür. Uygun büyüme ortamı ve koşulları kullanın. BSG D10 için, 37 ° C'de DMEM +% 10 FBS + 1 x Pen-strep hücrelerin büyümesi ve% 5 _CO2.
   2. 5 ml PBS ile orta serbest hücreleri durulanır ve spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için 1 saat süre ile, PBS içinde 5 ml% 1 BSA ile bloke hücreleri. Hücrelere 5 ml (0.5 mg / ml), nano-tanecikleri ekleyin. BSG D10 için, MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (kontrol antikoru), ve MNP hücreleri inkübeB-A488-Ang2 1 saat karıştırıldı.
   3. Ilişkisiz nanopartiküller kaldırmak için hücreler 5 ml PBS ile 3 × durulayın. Fantom hazırlanması için bir şişe bunları ayırmak için 37 ° C ve% 5 _CO2 ile 2 ml EDTA,% 0.25 çözeltisi ile 5 dakika boyunca 1 × hücreler inkübe edilerek hücreler tripsinize. Hücrelerin tripsinizasyon söndürmek için DMEM 8 ml ilave edilir.
   4. 5 dakika boyunca 1.000 × g onları santrifüj hücreleri toplamak; süpernatant dışarı aspire. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri hücrelerin tespit etmek için PBS içinde 1 ml% 10 formaldehit ekleyin. 96 oyuklu bir plaka, ayrı bir oyuğuna her bir numune 100 ul ekle.
   5. Her bir kuyunun içine deiyonize suda eritilmiş% 1 agaroz çözeltisi 100 ul ilave edin ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Jel 12 saat için 4 ° C'de katılaşmaya izin verin.
      NOT: Bu katılaşmış agaroz bağlı nanopartiküller hücreleri içeren bir hayalet verir.
   6. (Önümüzdeki 2% agar sağlam bir blok yatay 3 T klinik mıknatıs 150 cm hayalet yerleştirin ^11, yarı yükseklikteki 0.5 mm kalınlığında koronal kesitler kullanılarak gevşeme kez ölçülür.
2. T ₁ - T ₂ -ağırlıklı dizileri
   Klinik MRG mıknatıs dizileri elde etmek için aşağıdaki ayarları kullanın:
   1. Aşağıdaki spin eko sekansı kullanarak T1A MR görüntüleri elde: tren Echo (ET) = 1, Tekrarlama zamanı (TR) = 650 msn, Echo zamanı (TE) = 11 msn, Matris boyutu = 320 x 256, Görüş alanı (FOV) = 10 x 10 cm'lik ^2.
   2. Aşağıdaki FRFSE dizisi kullanarak T2A MR görüntüleri elde ET = 28; TR = 3.000 msn; TE = 101 ms; Matris boyutu = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm ^2.
3. Post-satın alma İşleme
   1. Gri skala görüntü dönüştürmek için, Görüntü Seç> Yazım> 8-Bit: kolay okuma için, ImageJ kullanarak bir renk skalası görüntü içine orijinal gri tonlu görüntüleri dönüştürebilirsiniz.
   2. Agaroz çözüm sinyal katkı düşüldükten sonra her bir numune için normalize yoğunluğunu hesaplayın.

Results

Tek pota sentez şemasını kullanarak, PB NPlerin nanopartiküller (çapı 78.8 nm, dağılırlık indeksi (PDI) = 0,230 anlamına gelir; dinamik ışık saçılması cihaz tarafından hesaplanan), GdPB veya MnPB (çapı 164,2 nm, KAE = 0.102 ortalama) ( çapı DLS ile yapılan ölçümlere göre (tek dağılımlı 122.4 nm PDI = 0.124)) sürekli olarak sentezlenebilir (Şekil 2A) anlamına gelir. sentezlenen nanopartikuller arasında ölçülen, zeta potansiyelleri, yüzey üzerindeki yüklere göre parçacıkların orta kararlılığını gösteren e...

Discussion

Bu makalede, biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküller göre çok modelli, moleküler görüntüleme maddeleri için yeni bir sınıfının sentezlenmesi için yöntemler sunmuştur. nanopartiküller dahil moleküler görüntüleme yöntemleri nedeniyle tamamlayıcı özellikleri, floresan görüntüleme ve moleküler MR vardır. biofunctionalized Prusya mavisi nanopartiküller bir çekirdek-kabuk bir tasarıma sahiptir. Bu nanopartiküllerin sentezi önemli adımlar şunlardır: 1) Tek pota Prusya mavisi nanopartiküllerin oluşmaktadır çekirdeklerin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potasyum hekzasiyanoferrat (II) trihidrat (K4Fe(CN)6· 3H < alt > 2 < / alt >O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganez (II) klorür tetrahidrat (MnCl2< / sub> ve orta nokta; 4H < alt > 2 < / alt >O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinyum (III) nitrat hekzahidrat (Gd (NO< alt > 3 < / alt >) < alt > 3 < / alt > ve orta nokta; 6H < alt > 2 < / alt > O)	Sigma-Aldrich	211591
Demir (III) klorür hekzahidrat (FeCl < alt > 3 < / alt > ve orta nokta; 6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Kondroitin Sülfat Proteoglikan, Biotin Konjugat Antikoru	Millipore	AB5320
Biyotinile Anti-İnsan Eotaksin-3	Peprotech	500-P156GBT
Nöro-2A Hücre Hattı	ATCC	CCL-131
BSG D10 Hücre Hattı Laboratuvarı	stoğu	---
OE21 Hücre Hattı	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Nörosferler	Laboratuvarı stoku	---
Eol-1 Hücre Hattı	Sigma-Aldrich	94042252
Poli (L-lizin) hidrobromür	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehit	Sigma-Aldrich	F8775
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoaktinomisin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Kırmızı-Turuncu,	Yaşam Teknolojileri	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Yaşam Teknolojileri	A21370
Santrifüj	Eppendorf	5424
Peristaltik Pompa	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonikatör	QSonica	Q125
Sıcak Plaka/Manyetik Karıştırıcı	VWR	97042-642
Ultra Temiz Alüminyum Folyo	VWR	89107-732
Vorteks Karıştırıcı	VWR	58816-121
1.7 ml konik mikrosantrifüj tüpleri	VWR	87003-295
15 ml konik santrifüj tüpleri	VWR	21008-918
Boru tutucular	VWR	82024-342
Tek kullanımlık plastik küvetler	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer kılcal hücre	VWR	DTS1070
Santrifüj Filtreler, 0.2 mikrometre döndürme sütunu	VWR	82031-356
96 oyuklu hücre kültürü tepsisi	VWR	29442-056
Tripsin EDTA %0.25 çözelti 1x	JR Scientific	82702
Hücre Kültürü Sınıfı PBS (1x)	Yaşam Teknolojileri	10010023
XTT Hücre Proliferasyon	Kiti Trevigen	4891-025-K
T75 Şişesi	89092-700	VWR
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Sığır Serumu	Yaşam Teknolojileri	10437-010
Pen-Strep 1x	Yaşam Teknolojileri	15070063
Fluoview FV1200 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu	Olympus	FV1200
Odacıklı Mikroskop Slaytları	Thermo Scientific	154534
Mikro Kapaklı Camlar, Kare, No. 1.5	VWR	48366-227
Mikroskop Slaytları	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agaroz	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Akış Sitometresi	BD Biosciences
3 T Klinik MRI Mıknatısı	GE Healthcare
100 ml yuvarlak tabanlı şişe