Yöntem makalesi

Senkronizasyon Caulobacter crescentus Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

DOI:

10.3791/52633

⸱

8 Nisan 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri hücrelerinin senkronizasyonu, bakteri hücre döngüsü ve gelişimi ile ilgili çalışmalar için esastır. Caulobacter crescentus, yoğunluk santrifüjleme yoluyla senkronize edilebilir ve bakteri hücre döngüsü çalışmaları için hızlı ve güçlü bir araç sağlar. Burada Caulobacter hücrelerinin senkronizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsü, tüm hücrelerde büyüme, genom replikasyonu ve gelişme için önemlidir. Bakterilerde, hücre döngüsü çalışmaları büyük ölçüde senkronize edilmemiş hücrelere odaklanmıştır ve bu da hücre döngüsü ilerlemesi, genom replikasyonu ve bölünmesi için gerekli zamansal olayların sıralanmasını zorlaştırmıştır. Caulobacter crescentus, hücrelerin yoğunluk santrifüjleme ile G0 durumunda hızlı bir şekilde senkronize edilebildiği bakteri hücre döngüsü için mükemmel bir model sistem sağlar. Hücre döngüsü senkronizasyon deneyleri, kromozom replikasyonunu ve ayrışmasını yöneten moleküler olayları belirlemek, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden genetik bir düzenleyici ağı haritalamak ve asimetrik hücre bölünmesi için gerekli polar sinyal komplekslerinin oluşumunu belirlemek için kullanılmıştır. Burada Caulobacter NA1000 hücrelerinin hızlı senkronizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Senkronizasyon, gen ekspresyon profili oluşturma ve western blot testleri için büyük ölçekli bir formatta ve ayrıca mikroskopi veya FACS tahlilleri için küçük ölçekli bir formatta gerçekleştirilebilir. Caulobacter'in hızlı senkronizasyonu ve yüksek hücre verimi, bu organizmayı bakteri hücre döngüsü çalışmaları için güçlü bir model sistem haline getirmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bakteriyel hücre döngüsü genomunun çoğaltma ve kızı hücrelerinin bölünmesini kontrol eder. Antibiyotik direnci halk sağlığı için büyüyen bir tehdit olarak önemlisi, bakteri hücre döngüsü antibiyotik gelişimi için bir hedef kullanılmayan sunuyor.

Bakteri Caulobacter crescentus, her bir hücre döngüsü Farklı kaderi (Şekil 1A) 1,2 iki kız hücre sağlar, asimetrik bölünmesi yol açar. Bir yavru hücre, bir kamçı miras ve diğer kızı sap miras ve sapsız ise hareketlidir. Entegre devre genetik transkripsiyon regülasyonu, fosfor-sinyalizasyon ve düzenlenmiş proteoliz 3 hücre döngüsü ilerlemesini ve hücre kaderi kontrol eder. Buna ek olarak, kromozom replikasyonu ve eşzamanlı ayrımcılık verim kızı hücreleri kromozom 4 tam bir kopyasını içeren. Önemli bir şekilde, bu iki hücre tipi hızla collo ile ayrılabiliryüksek verim (Şekil 1B) ile nüfusun geri kalanından swarmer hücrelerinin izolasyonu sağlayan synchronizable NA1000 suşu 5-7 idal silika parçacık yoğunluğu santrifüj. Hücrelerin swarmer İzole sonra asimetrik hücre bölünmesi yoluyla eşzamanlı devam edin. Burada, biz detay protokolü Caulobacter suşu NA1000 senkronize etmek için kullanılır. Biz protokolleri ve büyük ve küçük ölçekli her iki eşitleme için ortak sorun giderme ipuçları sağlar. Bu deneysel prosedür Caulobacter hücre döngüsü ve hücre kaderinin kontrolünü zamanmekansal sorgulamak için güçlü bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Büyük ölçekli Synchrony - Western Blot, Mikroarray / RNA-Sek, ve Diğer Malzeme Yoğun Tahliller için optimal

  1. Bir dondurucu stok veya bir plaktan, pye ortamı içinde 28 ° C'de çalkalama ile streyn NA1000 5 ml'lik bir O / N kültürünün yetiştirilmesi.
  2. M2g 25 ml (Tablo 1-2) 'de, adım 1 hücreleri, 0.5 ml inoküle ve Kültür 0.5 ve 0.6 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar 28 ° C' de çalkalanır.
  3. M2g 1 L hücreleri ile inoküle ve 28 ° C de çalkalanır.
  4. OD 600 0,5-0,6 ulaştığında, sıvı monte faz mikroskobu kullanarak hücrelerin swarmer varlığını doğrulamaktadır. Faz mikroskobu ile bir cam slayt üzerinde hücrelerin 1 ul, bir kapak kayma ile kapak Noktası, ve görüntü. Nüfusun hızla yüzme hücrelerin görselleştirerek swarmer hücrelerinin varlığını doğrulamak.
  5. JA-10 rotor içinde 4 ° C'de 7 KXG 15 dakika boyunca hücreler dönerler.
  6. Süpernatantı atın ve soğuk M2 180 ml ekleyin (Tablo 1-2) ve yavaşça resserolojik bir pipet kullanılarak tüm hücreleri uspend. Gevşek pelet hücreleri atın; bunlar predivisional ve saplı hücrelerdir.
  7. Soğuk Kolloidal silika çözeltisi 60 ml ekleyin ve iyice karıştırın hücre süspansiyonu (iyi hücrelere eklemeden önce Kolloidal silika süspansiyonu karıştırmak için emin olun).
  8. Sekiz 30 ml tüpler içinde hücre süspansiyonu dökün ve bir JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG C'de 30 dakika boyunca dönerler.
    NOT: Bir iki ayrı bantları görmelisiniz; saplı / predivisional hücreler üst bant (Şekil 1B) iken swarmer bant alt grubudur.
  9. Dikkatle kapalı üst bandı aspire ve swarmer bant (alt bant) Yukarıda ~ 1 cm sıvıyı çıkarmak.
  10. Pasteur pipeti kullanarak (Kritik), dikkatlice swarmer bandı çıkarın ve temiz bir tüpe yerleştirin. JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 10 dakika boyunca koloidal silis, iyi soğuk M2 ile tüp kapalı ve spin aşındırmak için.
  11. Dikkatle süpernatant atmak ve tekrar süspansiyon20 soğuk M2 ml JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 10 dakika boyunca bir dönüş hücreler.
  12. Soğuk M2 30 ml içine tüm pelet yeniden süspanse ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 600 ölçmek ve soğuk M2 ortamı kullanarak boş. Hücreler swarmer kontrol etmek için faz görüntüleme için 1 ul kaydedin; Hücrelerin% 90-95 diğer canlılar olmalıdır.
  13. JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 5 dakika boyunca hücreler dönerler. 28 ° C M2G ortam içinde yeniden süspanse edilen hücreler, 600 ~ 0.3-0.4 ve 28 ° C'de çalkalanarak başlar, böylece.
    NOT: Tipik verimler 30 ve eşitlenmemiş hücrelerin 1L den swarmer hücre kültürü 60ml arasındadır.
  14. Zaman noktaları (vahşi tip kültür bölmek için yaklaşık 135-140 dakika sürecektir) 8,9 alarak başlayın. Her zaman noktasında, OD 600 ölçer. Bölünmeden sonra OD 600 yaklaşık 2X başlangıç ​​OD 600 olduğunu kontrol edin.
  15. Western blot ya da gen sentezleme tahlilleri için, cu 1 ml alikotları kaldırmaİstenen zaman noktalarında lture, hızlı bir şekilde 30 saniye için bir masa üstü santrifüjü içinde maksimum hızda aşağı spin süzün veya orta havalandırın, ve sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurma. Alt baş analiz edilinceye kadar -80 ° C'de hücreler saklayın.

2. Küçük ölçekli Synchrony - Mikroskopi için Optimal

  1. Bir dondurucu stok veya bir plaktan, 5 ml'lik bir O / N kültür m2g 28 ° C'de çalkalanarak büyür.
  2. M2G 15 ml (Tablo 1-2) sulandırmak ve orta-log (OD = 0.5-0.6 600) kadar büyür.
  3. 1 ml soğuk M2 (Tablo 1-2) ve 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne transfer JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6.4 KXG dönerler ve süspansiyon haline getirin.
  4. Süpernatantı aspire, hücreler topak haline getirilip, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, 3 dakika için 15 KXG Spin soğuk M2 900 ul buz üzerinde pelet ve tekrar süspansiyon koydu.
  5. Bir mikrofon 4 ° C'de 15 KXG C'de 20 dakika koloidal silis ve spin kaplama soğuk PVP 900 ul eklerocentrifuge tüp.
  6. (Kritik) aspire garnitürü saplı / predivisional hücre bandı kapalı pipetlemeyin ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine bant swarmer alt toplamak veya.
  7. 3 dakika boyunca 15 KXG santrifüj edilirken, M2, 1 ml swarmer hücreler iki kez yıkayın.
  8. Son sıkma önce, önceden soğutulmuş bir 1 ml'lik bir cam deney tüpü içine hücreleri taşımak ve M2 bir boşluk ile karşılaştırıldığında hücrelerin OD 600 ölçer.
  9. 0,3 arasında bir OD 28 ° C M2G içine son hücre pelletini - 0.4 ve 28 ° C'de / rulo hücreleri sallayın.
    Not: Tipik verimler swarmer hücre kültürünün 2 ila 4 ml dir.
  10. Görüntüleme için bir M2G agaroz ped üzerine hücrelerin istenilen zaman noktaları yer 1 ul mikroskopi deneyleri için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha yüksek bir yoğunluğa sahip swarmer bandı, ve daha düşük yoğunluklu bir saplı / predivisional hücre bandı: eşitleme genellikle hücrelerin iki bant (Şekil 1B) verir. Etkili bir senkronizasyon ortak kontrol OD 600 izleme ve farklı hücre döngüsü zaman noktalarında western blot ile CtrA'nın protein seviyelerinin ölçülmesi dahildir sağlamak. OD 600, hücre döngüsü sırasında (Şekil 2) boyunca, yaklaşık 2 kat artış gerekir. hücre döngüsü ana regülatör CtrA'nın için bat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri hücre döngüsü, yaşamda temel bir süreçtir ve büyüme çalışmaları için ve yeni nesil antibiyotikler için bir hedef olarak önemlidir. Burada, bakteriyel hücre döngüsü ve asimetrik hücre bölünmesi çalışması için bir model organizma olan C. crescentus NA1000 için hızlı senkronizasyon prosedürlerini detaylandırdık. Bu yöntem, bakteri hücre döngüsünün uzay-zamansal düzenlemesini araştırmak için western blot, gen ekspresyon profili oluşturma ve floresan mikroskobu deneyleri ile değiştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, el yazması hakkındaki yorumları için Shapiro laboratuvarı üyelerine ve Erin Schrader'e teşekkür eder. Yazarlar, NIH doktora sonrası bursu F32'nin JMS'ye GM100732 ve NIH'nin LS'ye R01 GM51426 ve R01 GM32506 hibeleri olduğunu kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PVP Kaplı Kolloidal Silika (Percoll)Sigma-AldrichP4937
Kolloidal Silika (Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 RotorBeckman-Coulter369687
JA20 RotorBeckman-Coulter334831
Demir Sülfat Şelat ÇözeltisiSigma-AldrichF0518
30 ml Santrifüj TüpleriCorning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
  2. McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
  3. McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
  4. Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
  5. Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
  6. Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
  7. Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
  8. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
  9. Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
  10. Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
  11. Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
  12. Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
  13. Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
  14. Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
  15. Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
  16. Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744(2013).
  17. Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
  18. Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179(2011).
  19. Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D ng s SenkronizasyonuDiferansiyel Yo unluk Santrif jasyonuSwarmer H cre zolasyonuFaz Kontrast MikroskobuWestern Blot AnalizleriGen Ekspresyon Profili kar mCTRA Protein AnaliziAsimetrik H cre B l nmesi

İlgili makaleler