sıçan nedeniyle onun büyüklüğü, kullanılabilirlik ve oldukça uysal davranış, yıllardır bir araştırma modeli olarak kullanılmıştır. Bu protokolün amacı, kronik yaraların patofizyolojisi değerli bilgiler sağlamak için bir iskemik deri yara iyileşmesi modeli olarak sıçan kullanmaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçan İskemik Cilt Yara Modeli Gösteri
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsanlarda kronik yaralar için eğilimi gibi bağlı hareketsizlik diyabet ve bozulmuş kardiyovasküler fonksiyonu, ve bası gibi yaşlanma, hastalık durumlarında artar. Hayvan modelleri, kronik yaraların karmaşıklığı anlayışını ileri götürmek amacıyla bu koşulları taklit etmek için bu girişimi geliştirilmiştir. Burada açıklanan model, iskemik hale gelir ve kronik yara fenotipi (indirgenmiş vaskülarizasyon, artmış enflamasyon ve gecikmiş yara kapatma) benzer yaralarda elde edilen kan akımının uzun bir azalma sağlayan bir fare iskemik flep modelidir. Bu kontroller olarak flep ile yanal merkezi olarak yerleştirilmiş 2 iskemik yara ve 2 iskemik olmayan yaralar bir bipediküllü dorsal flep oluşur. Bu iskemik deri flep modeli bir roman ilave bir bariyer ve revaskülarizasyon önlemek ve yaralar iyileşecek gibi daralmayı azaltmak için bir atel olarak işlev flep altına silikon tabakanın yerleştirilmesidir. Rağmennedeniyle insanlara kıyasla oldukça farklı anatomik ve fizyolojik farklılıklar çalışmalar yara iyileşmesi için sıçanları kullanarak tartışma (yani, bir panniculus carnosus kas, kısa ömrü varlığı, saç köklerinin sayısı artmış, ve enfekte yaralar iyileşecek onların yeteneği) Bu modelde kullanılan modifikasyonlar daha önce geliştirilen iskemik flep modelleri için değerli bir alternatif yapmak.
Giriş
Etkili ilaç geliştirme ve diğer yara iyileştirici terapötik insan tedavilere 1 hayvan modellerinde bulguları çevirisinde bilinen sorunlara rağmen, in vivo modellerde uygun gerektirir. Aşağıda mekanizmaları patolojik yara iyileşmesi daha anlayış araştırmak için iskemik deri yara iyileşmesi bir sıçan modelinde kullanımı için detaylı bir protokol bir açıklama. fare türleri, genellikle geniş kullanılabilirliği, boyuta bağlı olarak kullanılan ve kesik ve eksizyon yaralama, görüntüleme ve doku toplanması 2 için uygun bir deri alanı sağlamak için yeterince büyük olduğu uysal yapısı yara iyileşmesi çalışmaları için kullanılır. Ancak sıçanlar, gevşek derili hayvanlar ifade edilen ile, fare ve insan cilt anatomik farklı dikkatli dikkate alınmalıdır. Bu farklı karakteristik sıçan derisi kapanış w ölçüde katkıda yerine epitelizasyona çok yara kasılması sağlarbileşiklerdir 2. Buna ek olarak, sıçanlarda deri altından istemsiz kas carnosus varlığı, hem de daralma ve kolajen oluşumunda 3,4 ile iyileşmeye katkıda bulunur. Bunlar çok önemli anatomik farklar sıçan iskemik deri yara modelinin geliştirilmesi dikkate alınmıştır ve belirli değişiklikler yara daralma azaltmak ve panniculus carnosus kas 5 etkisini azaltmak için uygulanmıştır.
Diyabetik ayak ülserleri, venöz bacak ülseri ve basınç ülserlerinde, şifa gecikir ve bu yaralar, kronik olarak kabul edilir. yaralar yara onarımı 6 sonraki aşamalarında dönüşmesini engeller yara aşırı enflamasyon ile karakterize edilir. Kronik yara gelişiminde en önemli faktörlerden biri iltihabı temizlemek için yetersizlik katkıda lokalize doku iskemisi (düşük kan akışı) 5'tir. Bu model, 2003-4 yılında (geliştirilmiş ve valide ediliyordu sırasında zaman), Yara yatağında, normal yara iyileşmesi sırasında önemli bir aşama ve bu modeli 5 geliştirilmesi için motivasyon anjiyogenez indüksiyonu test etmek için yeterli doku sağlayabilir standart bir hayvan modelleri vardı. Burada sunulan modeli Chen ve arkadaşları tarafından değiştirilmiş bir biçimde kullanılan orijinal Schwartz ve diğerleri., 7 ve daha sonra tarif edilen iskemik yara modeli bir değişiklik, adı geçen. 8
Modifiye iskemik yara modelinde değişiklikler yerine epitelizasyona daha kasılması ile şifa yol sıçan yukarıda belirtilen anatomik özelliklerini aşmak için yapılmıştır: (1) İki tam kalınlıkta eksizyonel yaralar bir bipediküllü dorsal deri flebi ve içinde oluşturulan panniculus carnosus kas sadece kas fasya üzerinde diseksiyon ile yara yatağı çıkarılır. (2) kapağı kendisi t orta noktasında yer alan daha dar bir kan temini rastgele sağlamak boyutları ve yaralar vardırO flep iskemik bulunmaktadır. (3) silikon tabaka, alt dokularla kanadın readherence ve reperfüzyon önlenmesi, dalgalanmanın altına sokulur. Yara daralma ankraj veya silikon tabaka 5 kapağı dikilerek (elimine değil) sınırlıdır.
Model son zamanlarda yaşlı sıçanlarda 11 karşı genç iskemik yara iyileşmesi için 9,10 şifa iskemik yara üzerinde hiperbarik oksijen etkileri arasında değişen çalışmalarda kullanılmıştır ve uzun süreli doku iskemi güvenilir bir model olarak kanıtlanmıştır. bipediküllü flep boyutları da domuz 12 ve fareler olmak üzere ve diğer türler, (3,0-3,5 cm genişliğinde 10.5 cm uzunluğunda) ve F344 sıçanlarda (2 cm genişliğinde 11 cm uzunluğunda) Sprague Dawley sıçan dahil olmak üzere farklı suşları, adapte edilmiş 13,14. Bu video iskemik deri yara modeli gösteriye F344 doğuştan sıçan gerginlik kullanır.
Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri için onay almak olduGüney Florida Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) Üniversitesi ed ve Hayvan Refahı Yasası ve Bakım Kılavuzu ve Laboratuvar Hayvanları Kullanım tüm gereksinimleri uymak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri için onay Güney Florida'nın Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) Üniversitesi elde ve Hayvan Refahı Yasası ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu için tüm gereksinimleri uymak edildi.
Silikon Levha ve Cerrahi Aletler 1. Hazırlık
- Hazır kesilmiş şeritler ve (10.5 cm x 3.0 cm) 0.01 kalınlığında, tıbbi silikon çarşaf olmayan takviyeli ve bir otoklav kullanarak sterilize.
- Temizleyin ve (ameliyat sırasında steril bir alan oluşturmak için makas, forseps ve perdeler veya havlu) uygun cerrahi aletler sterilize.
2. Deney Hayvanları
- Yetişkin erkek veya ticari bir yetiştiriciden edilen 250-350 g aralığında ağırlığındaki dişi farelerin kullanın. Yaşlı sıçan kullanıldı, bunlar daha iyi hayatta kalma ameliyat sonrasında olmak üzere ≥350 gram olması gerekmektedir. Herhangi bir deney başlamadan önce en az seyahati hayvanlar alışmalarıYemek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir ışık-karanlık döngüsü standart koşullar altında 7 gün.
3. Anestezi, preoperatif Analjezi ve Operatif Hazırlık
- Indüksiyon odasında aracılığıyla% 3 -4% izofluran ile genel anestezi øndükle ve cilt hazırlığı ve ameliyat sırasında O 2 ile% 1 (bir burun konisi kullanımı yoluyla) -2% korumak. Oranı ve solunum, interdijital tutam veya palpebral kırpma refleksinin derinliği gözlem yoluyla anestezi derinliği izleyin.
NOT: Şu anda, bir veteriner merhem hayvan anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze yerleştirilebilir. - Steril cerrahi alanında bir konum uzak, yüzüstü pozisyonda sıçan yerleştirin ve aşağı boyun yaklaşık 11 cm tabanından kesme makineleri ile dorsumuna tıraş. Kalıcı bir kalem ile Stencil, 3,0 cm x 10,5 cm flep için anahat (Şekil 1A bakınız).
- Temiz, belirlenen Surgica sıçan taşıonaylanmış bir ısıtma yastığı ve steril cerrahi örtüler ya da havlu ile donatılmış l alanı. Ağrı yönetimi için ilk cerrahi kesiler 5 mg / kg Ketoprofen deri önce enjekte. Gerektiğinde ek sıvıların (tuzlu su), deri altından (5 cc) verilebilir.
- Steril bir alan oluşturmak için steril örtüler uygulamak, sonra,% 70 izopropil alkol ve% 0.2 klorheksidin ile ikinci ilk sürüntü daha da cildi hazırlayın. % 10 povidon-iyodin (Betadinede) de kullanılabilir.
NOT: antibiyotik (15 mg / kg ampisilin) deri altından tatbik edilebilir, ama iyi aseptik teknikler kullanılır ise, bu gerekli değildir.
4. Hastaya yaralar ve bipediküllü Kanatçığını oluşturma
- Steril, tek kullanımlık 6 mm biyopsi yumruk aracını kullanarak, belirlenen flep alanı (Şekil 1B) merkezinde iki dairesel "iskemik" yaraları oluşturun. Yaranın derinliği (değil aracılığıyla) panniculus Carno altında yatan fasya olmalıdırsus kas (Şekil 1B ek).
- Forseps punch biyopsi tarafından oluşturulan yara anahat ortasında cilt kaldırın ve daha sonra (panniculus carnosus kas dahil) doku dairesel parça çıkarılması için (kavisli ipuçları) iris makas kullanın. Sonuç yara üs olarak fasya ile yara tam kalınlıkta olacak.
Not: eksize edilen doku (yara fişler) sıvı azot içinde dondurulmuş ya da kontrol olarak, daha sonra işlemci, normal bir cilt için 10% tamponlu formalin O / N sabit ek bileşeni olabilir. - Ayrı uzunluğu 10,5 cm ve 3.0 cm önceden çizgilerle (Şekil 1C) boyunca iskemik yaraların her bir yanı üzerinde, steril bir bisturi ile insizyon yaparak bipediküllü kanatçık oluşturur. kesiler derinliği aşağı paraspinöz kaslara olmalıdır. Iris makas kullanarak, (6 mm yumruklar "üs" olarak sağlam fasya tutmak için dikkatli olmak, paraspinöz kaslarının F panniculus carnosus fasya ayrıigure 1D).
- 1 steril önceden kesilmiş silikon levha alın ve panniculus carnosus fasya ve levha toka veya kat etmediğini sağlanması paraspinöz kasların (Şekil 1E) arasına yerleştirmek. Siyah, emilemeyen sütürler (boyut 4.0) kullanılarak flep (Şekil 1F ve 1G) uzunluğu boyunca, her iki tarafta en az 8 kesintiye dikiş ile cilt silikon tabakanın demirleme her iki kesiler kapatın.
- Steril, tek kullanımlık biyopsi yumruk aracını kullanarak, 1 cm flep (Şekil 1G) her iki tarafında iskemik yaralara yanal (panniculus carnosus kasının ön fasya aşağı) iki iç kontrol "non-iskemik" yaraları oluşturun.
- Yaralar altında bir cetvel yerleştirin ve yara ölçüm amaçları (Şekil 3A bakınız) dijital fotoğraf çekmek. Bu zamanda, kan akışı (perfüzyon) lazer Doppler ya da yapılan diğer manipülasyonlar (topikal ilaç yerleştirme) kullanılması ile izlenir.
- Kranial ve kaudal yaralara ve nemli ve (steril) temiz yara ortamı tutmak için soyunma şeffaf bir film hem de onaylı bir sıvı yapıştırıcı uygulayın. Ek soyunma en kaudal sütür kaldırmasını hayvan önlemek için flep kaudal ucunda yerleştirilebilir.
5. Post-operatif Prosedürleri
- Besleyici karşı sürtünme gelen cerrahi siteyi önleyecek şekilde sığ besleyiciler ile donatılmış kafeslere (tek başına ev sahipliği) hayvanları yerleştirin. Hayvanlar katılımsız sol ya da sternum yatma korumak ve maksatlı hareket sergilemek için yeterli bilince yeniden kadar diğer hayvanların şirkete iade edilmemelidir. Isıtma paspaslar kurtarma sırasında en fazla 2 gün kafesin yarısı altına alınmalıdır.
- Operasyon sonrası ağrı yönetmek için, en fazla 48 saat sonrası ameliyat için ertesi sabah ve günde 1x hayvanlara deri altından Ketoprofen (5 mg / kg) yönetmek. Hayvanlar ayrıca, her gün izlenmelidirağrı, kilo kaybı veya cerrahi alan infeksiyonlarının uzun işaretler.
6. sonraki Yara Ölçümleri ve Soyunma Değişiklikler
- Indüksiyon odasında aracılığıyla% 3 izofluran kullanarak genel anestezi altında sık sık -4% iskemik ve non-iskemik yaraları ölçün ve adım 3.1 gibi O 2 ile% 1 -2% (a burun konisi yoluyla) yapılmaktadır.
- Yapıştırıcıyı deriden çekmeyin olarak yavaşça soyunma çıkarın. Ek dijital fotoğraf yara ölçümleri için alınan bu anda, topikal tedaviler yeniden uygulanan lazer Doppler görüntüleme (LDI) veya araştırmacının ihtiyaçlarını karşılamak üzere yapılan diğer manipülasyonlar.
- Yapışkan ve temiz bir pansuman uygulayın ve hayvan adım 5.1 olarak kurtarmak için izin verir.
7. Yara Toplama ve Ötenazi
- Hayvan bir ind üzerinden% 3 -4% izofluran kullanarak genel anestezi altında iken Hasat iskemik ve non-iskemik yaralar (günlerde araştırmacı uygun gördüğü)uction bölmesi ve adım 3.1 olarak O 2 ile% 1-% 2 (a burun konisi ile) korunur.
- Bir neşter kullanarak, yaranın etrafındaki sağlıklı dokuların dahil yaranın etrafında bir kare şekilli eksizyon yapmak. 1.5 ml eksizyon yerleştirin başlıklı bir tüp içerisinde ek ve gelecekteki moleküler analiz için (-80 ° C'de saklayın) sıvı azot içinde dondurularak bileşenini veya histolojik inceleme için oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin O'da / N inkübe edin.
NOT: yara eksizyon da analiz için daha fazla örnek sağlamak için yarıya olabilir. - Yara doku çıkarıldıktan sonra, CO 2 inhalasyon onaylanmış yöntemi kullanarak hayvan euthanize.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
verimli yapıldığı takdirde sıçan iskemik yara iyileşmesi modeli protokol hayvan başına yaklaşık 20 dakika sürer. Önce bir Şekil 1G temsil gibi görünmelidir modeli soyunma uygulanması. Bu bipediküllü flep ve yaralar içinde iskemik olduğunu doğrulamak için önemli olacaktır. Yaraların düzeyinde Subkutan oksijen basıncı (PSCO 2) iki iskemik yaralarda arasındaki deri altı dokuda bir polarografik elektrot yerleştirerek bu modelin 5 doğrulama sırasında ölçülmüştür. PSCO 2 değer...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sıçanlarda yara iyileşmesi nedeniyle genellikle enfekte yaralar ve interanimal değişkenlik 5 yüksek oranda iyileşmek için kendi yeteneklerine tartışma konusu olmuştur. Gelişimi sırasında modelin orijinal hedeflerinden biri bu varyasyonu azaltmak oldu. Belirli yerleştirme ile yaraların sayısını azaltarak kanadın genişliği Değişiklikler, silikon levha ve giriş (tutarlı kranyokaudal konumu ile kapağın merkezli) Bu hedefe gerçekleştirmiştir. Daralma Yara iyileşmesi de insanlarda olduğu gibi, ölçülen sonuçtu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Güney Florida Üniversitesi Cerrahi Bölümü'nden (Mack Wu, MD, PhD) fon desteğini kabul etmek istiyor.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sil-Tec tıbbi sınıf kaplama | Teknik Ürünler A.Ş. | 500-3 | takviyesiz, 0.01 inç kalınlığında |
| Mini İris makas, 8 cm, kavisli, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Ethilon Naylon Sütürler | Ethicon | 1964G | siyah, boyut 4.0, PC-3 16 mm iğneler (3/8 daire) |
| Lazer Doppler Görüntüleyici | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standart kan akışı görüntüleyici: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | ücretsiz indirin | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Bilimsel NC9922128 |
Kaynaklar
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
- Dorsett-Martin, W. A. Rat models of skin wound healing: a review. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 12 (6), 591-599 (2003).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290 (S1-11), (1998).
- Finn, G., Magnus, S. A., Tonny, K. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue). Wound Repair and Regeneration. 8, (2000).
- Gould, L. J., Leong, M., Sonstein, J., Wilson, S. Optimization and validation of an ischemic wound model. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 13 (6), 576-582 (2004).
- Loots, M. A., et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. The Journal of investigative dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Schwartz, D. A., Lindblad, W. J., Rees, R. R. Altered collagen metabolism and delayed healing in a novel model of ischemic wounds. Wound Repair Regen. 3 (2), 204-212 (1995).
- Chen, C., et al. Molecular and mechanistic validation of delayed healing rat wounds as a model for human chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 7, (1999).
- Zhang, Q., Chang, Q., Cox, R. A., Gong, X., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model. The Journal of investigative dermatology. 128 (8), 2102-2112 (2008).
- Zhang, Q., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen reduces matrix metalloproteinases in ischemic wounds through a redox-dependent mechanism. The Journal of investigative dermatology. 134 (1), 237-246 (2013).
- Moor, A. N., et al. Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure. Age (Dordrecht, Netherlands). 36 (2), 733-748 (2014).
- Roy, S., et al. Characterization of a preclinical model of chronic ischemic wound). Physiological genomics. 37 (3), 211-224 (2009).
- Biswas, S., et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6976-6981 (2010).
- Winocour, S., Vorstenbosch, J., Trzeciak, A., Lessard, L., Philip, A. CD109, a novel TGF-beta antagonist, decreases fibrotic responses in a hypoxic wound model. Exp Dermatol. 23 (7), 475-479 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
