Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

15.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52662

⸱

16 Mart 2015

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Ophthalmology, Duke University

Bu makalede

Özet

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Özet

elektroretinogram (ERG) retina fonksiyonunu belirlemek için bir noninvaziv elektrofizyolojik yöntemdir. Kornea yüzeyi üzerinde bir elektrotun yerleşimi sayesinde, elektrik aktivitesi ölçülür ve in vivo olarak retina hücrelerinin faaliyetini değerlendirmek için kullanılabilen ışığa karşılık olarak oluşturdu. Bu makale zebrabalıkları görme fonksiyonu ölçmek için ERG kullanımını tarif eder. Balığı dolayı uzun morfolino oligonükleotitler ve farmakolojik manipülasyonu ile gen bastırma kolaylığı, omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. 5-10 dpf'e, sadece konileri larva retinada işlevsel. Bu nedenle, zebra balığı ve diğer hayvanlarda farklı olarak, in vivo olarak koni görme fonksiyonu çalışma için güçlü bir model sistem. Bu protokol, standart anestezi, Mikromanipülasyondan ve zebra balığı araştırma yapmak laboratuvarlarda yaygın olan stereomikroskobi protokolleri kullanır. özetlenen yöntemler standart elektrofizyoloji eq faydalanmakuipment ve düşük ışık kamera larva kornea üzerine kayıt mikroelektrot yerleşimini rehberlik. Son olarak, ilk olarak farelerde kullanılmak üzere tasarlanmış bir ticari olarak temin edilebilir ERG uyarıcısı / kayıt cihazı kolayca zebrabalıkları ile kullanım için adapte edilebilir gösterilmektedir. Larva zebrabalıkları ERG bir morfolino oligonükleotid enjeksiyon ile tadil edilmiş olan hayvanlarda koni görme fonksiyonunu analiz etmek ve mükemmel bir yöntem olarak, örneğin çinko parmak Nükleaz (ZFNs) gibi daha yeni genom mühendislik teknikleri içerir, transkripsiyon aktivatör-gibi efektör Nükleaz (TALENS) ve Düzenli kümelenmiş interspaced Kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / büyük ölçüde verimlilik ve zebrafish gen hedefleme etkinliğini artırmıştır hepsi Cas9. Ayrıca, biz photoresponse katkıda moleküler bileşenleri değerlendirmek için Zebra balığı larva nüfuz farmakolojik ajanların yeteneği yararlanmak. Bu protokol modifiye ve araştırmacılar tarafından kullanılabilecek bir kurulum özetliyorÇeşitli deneysel gol ile.

Giriş

elektroretinogram (ERG), insanlarda retina fonksiyonunu belirlemek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir invazif olmayan elektrofizyolojik bir yöntemdir. Bir ışık uyarısına tepki olarak elektrik aktivitesi korneanın dış yüzeyi üzerinde kayıt elektrotları yerleştirilmesiyle ölçülür. uyarıcı paradigması ve tepki dalga özellikleri yanıt katkıda retina nöronlar tanımlar. Bu yöntem, fareler ve zebrabalıkları de dahil olmak üzere, hayvan modellerinde bir çok kullanım için adapte edilmiştir. Tipik omurgalı ERG tepki dört ana bileşeni vardır: fotoreseptör hücre aktivitesi türetilmiş bir kornea negatif potansiyel bir-dalga; b-dalgası, bipolar hücrelerden AÇIK türetilmiş bir kornea-pozitif potansiyeli; D-dalgası, KAPALI bipolar hücrelerin aktivitesi olarak yorumlanır bir kornea-pozitif potansiyeli; b-dalga sonra birkaç saniye içinde gerçekleştiğini ve c-dalga, Müller glia ve ret aktivite yansıtırinal pigment epiteli 1-4. İnsanlarda ve hayvanlarda modeli ERG analiz tarihini ve ilkelerini anlamak için Ek başvurular gibi İlkeleri ve Vizyon 4, 5 Klinik Elektrofizyoloji Uygulama olarak Utah ve metinlerin Üniversitesi'nden çevrimiçi ders kitabı, Webvision vardır.

Danio rerio (zebra balığı) uzun nedeniyle organ sistemlerinin, davranışsal testlerin noninvaziv morfolojik analiz ve ileri hem geri ve genetik ekranlar (inceleme için, Fadool ve görmek için izin veren hızlı olgunlaşma ve şeffaflık için, omurgalı gelişimi için bir model olarak tercih edilmiştir Dowling 6). Zebra balığı larvaları, yüksek doğurganlık ile birleştiğinde, onları yüksek verimli biyolojik analizler için mükemmel bir hayvan modeli yapmak genetik ve farmakolojik manipülasyon, son derece müsait. Larva zebrabalıkları çubuklara koni yüksek oranı - yaklaşık 1: 1 farelerinde (~% 3 koni ile karşılaştırıldığındalar) - koni fonksiyonu 7-9 çalışma için özellikle kullanışlı olmasını sağlar.

Gözdeki, koni çubuklar 10 önce gelişir. İlginç bir şekilde, zebra balığı koniler Bu aşamada 6, 11,12 koni seçici elektrofizyolojik analizine izin veren erken 4 dpf olarak işlemektedir. Buna karşılık, çubuklar ERG yanıtları 11 ve 21, 13 dpf'e arasında görünür. Bu nedenle, 4-7 de Zebra balığı larvaları dpf'e bir all-koni retina gibi fonksiyonel hizmet vermektedir. Ancak, 4-7 dpf larvaları yerli Fotopik ERG tepki b-dalgası hakimdir. (+) - - 2-amino-4-fosfono-butirik asit (L-AP4), metabotropik glutamat için bir agonist iki kutuplu hücreler üzerindeki tarafından ifade edilen (mGluR6) reseptörü, etkili bir şekilde bloke nesil L gibi farmakolojik ajanların uygulanması b-dalga ve izole koni reseptör potansiyeli kitle, ("a-dalgası") 14-17 ortaya koymaktadır.

Burada basit ve reliabl tarifzebra balığı larvası ile kullanım için adapte edilmiş fareler ile kullanım için tasarlanmış ticari olarak temin ERG ekipman kullanılarak ERG analizi e yöntemi. Bu sistem, görsel duyarlılık ve adaptasyona 16 katkı sinyal yollarının tanımlanması araştırmacılar yardımcı olmak için, bir genetik arka değişen, hem de farmakolojik maddeler ile tedavi gibi bir zebra balığı larva üzerinde kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürler vizyona ilgili biyolojik soruları çeşitli cevap ERG analiz kullanımı araştırmacıları rehberlik ve esnek bir ERG kurulum inşaatı gösterecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan bakım ve deneysel protokolleri Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Laboratuar Hayvan Refahı NIH Ofisi ve Değerlendirme ve Laboratuar Hayvan Bakımı International Akreditasyon Derneği tüm gereksinimlerini karşılamak bulundu.
NOT: Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için ERG analizi için larvaları elde etmek için, yayınlanmış protokoller 18 kullanılmıştır. Larva doğal yetiştirme yoluyla elde edilen ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngüsü altında muhafaza edilir. Bu protokol sonrası fertilizasyon (dpf) 5-7 gün larvaları için optimize edilmiştir, ancak ideal prosedüre küçük değişiklikler ile eski balık yapılabildi. Burada, 5 dpf'e yabani tip Zebra balığı larvalarının TL gerginlik kullanın.

1. Mikropipet Üretim

  1. Yangın cilalı borosilikat cam kılcal 1.5 x 0.86 mm (iç çapı ile dış çapı) kullanarak birkaç mikropipetler çekinFilament (821 ° C, erime sıcaklığı) ve P-97 Flaming / Brown Mikropipet Çektirme kutusu ısı filament ile donatılmış. Tablo 1'de açıklanan mikropipetler fashioning için programı kullanın.
  2. Ipuçları çapı 10-15 mikron olmasını sağlamak için uygun bir graticule cetvelle bir mikroskop altında her mikropipet kontrol edin ve düzgün bir ucu açıklığı (yani, hiçbir pürüzlü kenarlar) sahiptir.
  3. Dikkatle toz ucu hasarı ve maruziyetini önlemek için mikropipetler saklayın. Depolama seçenekleri laboratuvar bant, köpük kaplı kutulara ya da ticari olarak temin edilebilir mikropipet depolama kapları ile Petri kapları bulunmaktadır.
    Not: diğer mikropipet çekiciler ve cam kılcal kısımların doğru mikropipet çaplı, yüksek kaliteli bir uç elde edildiği sürece kullanılabilir.
Basınç Isı Çek Hız Zaman
500 560 - 30 200
500 450 - 30 200
500 410 55 40 200

Tablo 1: Bir kutu sıcaklık filaman ile donatılmış, bir P-97 alevlenebilirlik / kahverengi bir Mikropipet çekici kullanılarak mikropipetler üretimi için program Mikropipetler filamanlı yangın parlatılmış borosilikat cam kılcal 1,5 x 1,0 mm 2 (iç çapı ile dış çapı) kullanılarak yapılır. (erime sıcaklığı 821 ° C).

2. Tampon hazırlama

  1. Mikroelektrot kılcal, oksijenli goldfish Ringer tampon 19 süzülür kullanın ve larva deneyler için yerleştirildiği üzerine polivinil alkol (PVA) sünger doyurmak için. Seçenek olarak ise, E3 kullanımı embriyo medya veya Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi.
  2. PH değeri 7.8 ayarlayın ve bir 0.22 um filtre kullanılarak sterilize edildi ve 4 ° C'de 10 x stok saklamak Tablo 2'de tarif edildiği gibi 10x balığı Ringer çözeltisi hazırlayın.
  3. Iyonu giderilmiş, damıtılmış su ile 1x, 10x Ringer çözeltisinin, deney gününde çalışma çözeltisi oluşturmak. 0.22 mikron filtre sistemini kullanarak Filtre. 10 dakika boyunca% 95 O ile 2/5% CO2 gazı geçirilmesi yolu ile oksijenat. Sıkıca sonradan Cap çözümü oksijenli kalmasını sağlamak için.
NaCl 1.25 M
KCI 26 mM
CaCl2 25 mM
MgCI2 10 mM
glikoz 100 mM
HEPES 100 mM
jove_content "> Tablo 2: 10x balığı Ringer çözeltisinin hazırlanması.

3. Elektroetinogram Platformu

  1. Sinyal gürültü oranı artırmak için bir Faraday kafesi içinde bir anti-vibrasyon masaya ERG deneyleri. Altıgen somunları kullanılarak anti-vibrasyon masaya özel bir çelik platformu takın. Işık kaynağı altında masaya bir viskoelastik üretan polimer şok emici alt ile bir hareketli plastik platformu yerleştirin.
  2. Hareketli plastik platformu aşağı amaçlayan bir manyetize standı ile kamera yerleştirin. Hareketli plastik platformunun sağ ikinci manyetize stand ile (kayıt mikroelektrot yapacak) mikromanipülatör yerleştirin. Kamera ve mikromanipülatör diğer ekipmanların hareketi tarafından rahatsız olmayacak ve onlar ışık kaynağından aydınlatmayı bloke etmediğinden emin olun.
  3. Bir video monitöre bağlayın ve göz görüntülemek için konumlandırmakUygun pozisyonda elektrot yerleştirmek için larva.
  4. Kurulum düzgün bakır tel ile topraklı emin olun. Gürültü kontrol etmek, Ringer solüsyonu ile dolu bir 35 mm Petri kabındaki kayıt mikroelektrot referans elektrodu ve bahşiş yerleştirin. Bir osiloskop veya ERG aygıtının dahili özelliği ile kurulum elektrik gürültü seviyelerini kontrol edin. Gürültü seviyeleri başlangıçtan itibaren en fazla ± 10 mV olmalıdır.

4. Sünger Hazırlık

  1. 35 mm'lik bir Petri tabağına sıkıca oturacak ve kuru PVA sünger küçük bir dikdörtgen kesin. sünger mm çanak derinliğinden daha büyük olmamalıdır. Kesim için temiz bir jilet ile bir maket bıçağı kullanın.
  2. (Sünger alt veya daha küçük uçlarından biri aracılığıyla dikey kesilmiş bir kelebeğin üzerinde uzunlamasına ya sığ kesim) referans elektrot yerleştirmek için sünger içine ek bir kesim olun.
  3. Bir kimyasal dirençli işaretleyici kullanınkamerayı konumlandırılması için kullanılabilen bir sünger (larva yerleştirileceği yerde) küçük bir nokta işaretleyin.
  4. Doyana kadar Ringer solüsyonu PVA sünger batırın. 2-3 kez kaldırın ve bir kağıt havlu üzerine hızla kurulayın. Temiz bir 35 mm Petri kabı içinde sünger yerleştirin.
  5. Işareti kamera tarafından görüntülendi edilecek şekilde plastik platform üzerinde sünger içeren Petri kabı yerleştirin.

5. Elektrot Hazırlanması

Not: zebra balığı kurulum Ringer çözeltisi doymuş PVA sünger ve kornea ile temas halinde bir kayıt elektrotu ile temas halinde olan bir referans elektrot içermektedir. Referans elektrodu, bir Ag / AgCİ pelet oluşur. Kayıt elektrot Ag tel içeren bir mikroelektrot sahibi tarafından Ringer solüsyonu ile doldurulmuş ve tutulan bir çekti cam mikropipet olduğunu.

  1. 5 dakika (kayıt micr için% 6-9 sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) onları iliklerine elektrotlar Kloritlereoelectrode tel) veya 15 dakika (referans elektrot). 5 dakika boyunca bir Kimwipe Hava kuru.
    1. Adım 4.2 yapılan kesme tarzı bağlı olarak, sünger (alt uzunlamasına sığ kesim için) (dikey kelebek kesim için) veya altında içine referans elektrot Ag / AgCl pelet yerleştirin. Kayıt sistemine referans elektrot kurşun takın.
    2. ERG kurulum alanı kısıtlamaları vardır veya Ag / AgCl elektrot gelen özellikle güçlü fotovoltaik eserler varsa Alternatif, ışık yolu dışına elektrodu taşımak için bir agar tuz köprüsü üzerinden sünger referans elektrodu bağlayın.
  2. 5 ml olmayan Luer kilit şırınga ile ~ uygun büyüklükte boru 40 cm takın. Ringer solüsyonu ile şırınga doldurun. Basınç noktaları genelde adaptörleri ile gemi sahip Mikroelektrod sahipleri, "3/32" 1/8 1/16 iç çapları boru karşılamak "veya 5/32" için.
  3. Ile 1 ml olmayan Luer kilit şırınga doldurunMikro-fil ile Ringer çözeltisi ve dikkatlice mikroelektrot tutucu doldurun. Kabarcıklarının oluşmasını önlemek.
  4. Boru ile Mikroelektrot sahibinin basınç portuna 5 ml şırınga takın ve mikroelektrod sahibi Ringer solüsyonu ile dolu olmasını sağlamak için kullanabilirsiniz. Ringer solüsyonu ile dolu mikro-fil ve 1 ml şırınga kullanarak, ucundan mikropipet cam doldurmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olduğundan emin olun.
  5. Elektrot tel düz tutmak için dikkatli olmak, mikroelektrod tutucu cam mikropipet takın. Bir kez, güvenli çözümün küçük bir miktar ucunda görünür oluncaya kadar dikkatle mikroelektrot yoluyla Ringer çözeltisi zorlamak için 5 ml şırınga kullanın. Mikropipet ucu, toz ya da tuz birikimine bağlı, hava kabarcıkları ve aynı zamanda oklüzyonu oluşumunu önler (kornea yok) şırıngaya basınç sıra uygulaması.
    1. Çözüm akışı olarak çıkarsa, g değiştirinlass mikropipet ucu açıklığı çok büyük ya da zarar görmüş gibi.
  6. Dikkatle mikromanipülatör kayıt mikroelektrot yerleştirin ve kayıt sistemine kurşun takın.

6. Elektroetinogram Analizi

NOT: Kayıt için hazırlıklar dolaylı beyaz ışığın düşük seviyelerde altında yapılan zaman larva retinanın koni egemenliğine, yüksek kaliteli ERG sonuçlar elde edilebilir dolayı (<1 lux) veya kısa süreler yüksek yoğunlukta (<1 dakika) ( ≤250 lux) çalışma ışığı. Karanlık adaptasyonu kısa süre hala kayıt önce gerekli (adım 6.7 bakınız). Bununla birlikte, deneyler, kızılötesi duyarlı kamera kullanılarak loş, kızıl ötesi ışık altında gerçekleştirilebilir. Bütün deneyler, UNC balığı su ürünleri yetiştiriciliğinde bünyesinden filtre ile sterilize edilmiş (0.22 um) sistemi su yapıldı, ancak alternatif bir embriyo ortam da kullanılabilir.

  1. Yaklaşık 1 ölçme Kes kağıt havlu karelercm 2.
  2. Izole edilmiş bir koni kütle reseptör potansiyelinin ölçümü ise, 5 dakika boyunca, 500 uM, (±) -2-Amino-4-fosfonobütirik asit (APB) sistem suda 3-5 larva inkübe edilir.
    Not: APB bir aktif (L) 'in rasemik karışımı AP4 inaktif (R) form iken, L-AP4 kadar etkili olduğu ve daha az pahalıdır.
  3. % 0.02 yanıt vermeyen, yaklaşık 1-2 dakika kadar (ağırlık / hacim) Tricaine sistem suda 3-5 larva anestezisi.
  4. Dikkatli bir şekilde en az bir aydınlatma (<1 dakika boyunca ≤250 lux) ile bir kesme Stereoskop altında kağıt havlu kareleri üzerine tek tek larvalar aktarmak için bir Pasteur pipeti ve pipet pompası kullanın. Her larva konumunu kontrol edin ve bir kapatılmamış gözle dorsal yüzü yukarı bir aday seçmek.
    1. Genişletilmiş kayıtları (> 30 dk) için, vücut kadar cam ama ince deve tüyü fırça kullanarak% 3 metilselüloz ile baş dahil değil tarafından nemli larva tutun.
  5. Forseps kullanarak, kağıt havlu squar transferinemli PVA sünger larva e.
    1. Genişletilmiş kayıtları (> 30 dk) için, damıtılmış su ihtiva eden bir yan kol şişede airstone üzerinden gaz kabarcıkları geçirmek suretiyle larva üzerinde su ile doyurulmuş% 100 O2 gazı sürekli bir akış uygulanır. Larvaların kafasının yakınında nemlendirilmiş oksijen taşır şişe yan kol çıkan boru yerleştirin.
      NOT: Adım 6.4.1 ve 6.5.1 adım balık 16 ömrünü uzatacaktır.
  6. Minimal aydınlatma altında, burun ve göz kaudal uçları arasında orta noktada mikroelektrod ucu konumlandırmak için mikromanipülatör ve kamera kullanımı ve korneanın dorsal sınırı üzerine yavaşça bastırın.
    Not: kornea kadar uzak bölgelere elektrot ucu yanlış yerleştirilmesi ters polarite ERG dalga formları ile sonuçlanabilir.
  7. Için larva 5-10 dakika karanlık adapte izin verin.
  8. Lanılabilir kullanarak bir LED ışık kaynağı ya da optik stimülatör sağlanan ışık rekor testi flaş yanıtlarıetikel stimülasyon ve kayıt cihazları. Flash yoğunluğu, flaş uzunluğu, flaş rengi, arka plan yoğunluğu ve deney uygun renkli ve filtre ayarları gibi protokol parametrelerini ayarlayın.
  9. Deney ile bittiğinde, AVMA / IACUC kurallarına göre larva euthanize.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tipik olarak, ERGler bir dizi çalışma bu aşamada 9, 16,20 ile ERG kayıtları yayınlandı beri, 5 dpf'e Zebra balığı larvaları kaydedilir. Larva tepkiler beyaz LED ışık 20 msn uyaran kullanarak arka plan aydınlatma ile karanlık adapte koşullar altında ölçüldü. Biz bir Ganzfeld ışık uyarıcısı ve bilgisayar denetleyici / kaydedici oluşan piyasada mevcut ERG sistemi kullanılmaktadır. stimülatör arka plan ve flaş uyaran hem de parlaklığı kontrol etmek için sıkı bir şekilde kontrol tescilli darbe genişlik modülas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol larva zebrafish ERG kayıtları için basit bir prosedür ayrıntılı. Akılda tutulmalıdır prosedür boyunca birçok kritik adımlar Bu prosedür görsel function.There hızlı ve kapsamlı bir tahlil için izin verir vardır. Deney potansiyel ilaç tedavileri sırasında ölümleri önlemek ve ERG kayıtları sırasında uzun süreli geçimini sağlamak için önce Zebra balığı larvaları sağlıklı olmalıdır. Buna ek olarak, bu deneylerde kullanılan larva yakın yaş uyumlu olması önemlidir. Bunun nedeni retina (koni alt tiplerinin yani,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

UNC Zebra Balığı Su Ürünleri Yetiştiriciliği tesisi üyelerine zebra balığının bakımı için teşekkür ederiz. ERG cihazının kurulumuna yardımcı olduğu için Diagnosys, LLC'ye de teşekkür ederiz. Elektrofizyolojik yöntemler konusunda yardım için Dr. Portia McCoy'a ve Dr. Ben Philpot'un laboratuvarına ayrıca teşekkür ederiz. Ayrıca Lizzy Griffiths'e larva zebra balığı illüstrasyonu için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ödülleri F32 EY022279 (JDC'ye) ve R21 EY019758 (ERW'ye) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Faraday kafesi80/20 IncözelKafes çerçevesi PVA sünger için özel tasarlanmış alüminyum "Endüstriyel Montaj Seti"
AmazonB000ZOWG1CZebra balığı larvalarının yerleştirilmesi için yumuşak, nemli bir platform sağlar
150 ml Steril Filtre sistemleriCorning431154Küçük eklemlerin mikropipetleri tıkamasını önlemek için filtreleme çözümleri
Espion E2Diagnosys, LLCiletişimHerhangi bir stimülatör için görsel uyaranlar üretebilen ve özel yazılım kullanarak yanıtların dijital kaydı ve analizini yapabilen modüler elektrofizyoloji sistemi, http://www.diagnosysllc.com Colordome'da daha fazla bilgi
Diagnosys, LLCkontağıGanzfeld ERG için RGB LED ve Xenon ışık kaynaklarına sahip ışık stimülatörü, http://www.diagnosysllc.com Micromanipulator'da daha fazla bilgi
Drummond3-000-024-RKayıt mikroelektrodunun tutulması ve konumlandırılması
Manyetik halka standıDrummond3-000-025-MBKameranın ve referans elektrodunun tutulması ve konumlandırılması
Kurşun uzantılarıÇim TeknolojileriF-LXElektrotları bağlamak için yedek dişi - erkek 1,5 mm kurşun kablolar
Erkek Pin - Dişi SAFELEAD AdaptörüÇim TeknolojileriDF-215/102 mm'lik pimlerin 1,5 yatak başlığı pimine bağlanması
Pencere ekran çerçevesi (metal) ve splineLowes veya Home DepotçeşitliFaraday kafesi çerçevesine bakır ağ takmak için
Steriflip 50 ml filtrelerKırlangıç SCGP00525Küçük eklemlerin mikropipetleri tıkamasını önlemek için filtreleme çözümleri
BNC adaptörüMonoprice4127Kamerayı BNC kablosuna bağlama
BNC kablosuMonoprice626Kamerayı video adaptörüne bağlama
Kamera lensiNavitar1582232Kayıt mikroelektrodunun larva korneası üzerine konumlandırılmasının görselleştirilmesi
Kamera kuplörüNavitar1501149Kayıt mikroelektrodunun larva korneası üzerindeki konumunun görselleştirilmesi
Luna BNC - VGA + HDMI DönüştürücüSewellSW-29297-PROBNC - VGA adaptörü, kamera görüntüsünün bilgisayar monitörüne yansıtılmasına izin verir
APBSigmaA1910mGluR6 agonisti, izole koni kütle reseptörü potansiyelinin analizine izin veren b dalgasını bloke eder
Borosilikat camSutterBF-150-86-10Ateşle cilalanmış borosilikat cam (ölçüm sıcaklığı = 821 °; C) filament ve 1,5 mm x 0,86 mm boyutları (dış çapa göre iç çap) 
P97 Alevli/Kahverengi çektirmeSutterP97Cam mikropipetleri çekmek için
Sorbotan levhaThorlabsSB12AŞoku emmek ve kaymayı önlemek için Pasif İzolasyon Bağlantıları ve ERG platformunun altına yerleştirilen sentetik viskoelastik üretan polimer, boyuta göre kesilebilir
BreadboardThorlabsB2436FERG stimülatörü ve zebra balığı numunesi
için titreşim izolasyon platformuPasif İzolasyon BağlantılarıThorlabsPWA074Breadboard'a titreşim yalıtımı sağlar
Bakır örgüTWP022X022C0150W36TFaraday Kafesi Pipet pompasını hizalamak için
VWR53502-233Zebra balığı larvalarını dikkatli bir şekilde aktarmak için Pasteur pipetleriyle birlikte kullanılır
Pasteur pipetleriVWR14672-608Zebra balığı larvalarını dikkatli bir şekilde aktarmak için Pipet pompası ile birlikte kullanılır
KameraWatecWAT-902BKayıt mikroelektrodunun larva korneası
Trikain (MS-222)Tricaine-S,Farmasötik dereceli anestezik,
Micro-filWPIMF28G-5Doldurma mikroelektrot tutucusu ve mikroelektrot camı
Mikroelektrot tutucuWPIMEH2SW15Cam mikroelektrodu tutar, ERG ekipmanına bağlanır
Referans ElektroduWPIDRIREF-5SHElektroliti boşaltmak ve sinterlenmiş Ag/AgCl pelet elektrodunu açığa çıkarmak için muhafazanın son santimetresini dikkatlice kırın
Referans Elektrot (alternatif)WPIEP1DRIREF-5SH'ye alternatif. Bağlantı kablosuna kablolanması/lehimlenmesi gereken Ag/AgCl elektrodu
Mikroelektrot tutucu için düşük gürültülü kabloWPI13620Kayıt mikroelctrode tutucusunun adaptöre/başlığa bağlanması
: : üzerindeki konumunu görselleştirme: Western Chemical , , :,

Kaynaklar

  1. Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
  5. Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Konu G rsel FonksiyonuMikroelektrot Yerle imiERG AnaliziRetinal Fonksiyon De erlendirmesiAnestezi ProtokolStereomikroskopi KurulumuI k Stim lasyonuFotoresept r Duyarl l
Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.