Östrojene duyarlı meme kanseri hücreleri için kemik iliğinde in vitro bir uyku hali modeli geliştirdik. Bu protokolün amacı, uyku halinin moleküler ve hücresel biyolojisinin incelenmesi ve daha sonraki in vivo testler için hipotezlerin üretilmesi için modelin kullanımını göstermektir.
Kemik iliğinde meme kanseri uyku halinin incelenmesi, uyuyan hücrelerin mikro çevreleri ile etkileşimlerinin karmaşıklığı, nadirlikleri ve hematopoietik hücrelerin ezici fazlalığı nedeniyle son derece zor bir girişimdir. Bu amaçla, kemik iliğinde östrojene duyarlı meme kanseri hücrelerinin uyku hali için in vitro 2D klonojenik bir model geliştirdik. Model, uyku hali için gerekli olan birkaç temel unsurdan oluşur. Bunlar şunları içerir: 1) uzun süre uykuda kalması muhtemel tip olan östrojene duyarlı meme kanseri hücrelerinin kullanımı, 2) her hücrenin yapısal etkileşiminin esas olarak substratum ile olduğu klonojenik yoğunlukta hücrelerin inkübasyonu, 3) fibronektin, kemik iliğinin önemli bir yapısal elemanı ve 4) FGF-2, kemik iliği stromal hücreleri tarafından bol miktarda sentezlenen ve hücre dışı matriste yoğun bir şekilde biriken bir büyüme faktörü. FGF-2 ile inkübe edilen hücreler, 6 gün sonra, belirgin düz bir görünüme sahip 12 veya daha az hücreden oluşan, büyüyen hücrelerden önemli ölçüde daha büyük ve daha fazla yayılmış ve büyük sitoplazma / çekirdek oranlarına sahip olan uykuda klonlar oluşturur. Buna karşılık, FGF-2 olmadan inkübe edilen hücreler, esas olarak >30 nispeten küçük hücreden oluşan büyüyen koloniler oluşturur. İnkübasyondan sonraki 3. günde sistemin antikorlar, inhibitörler, peptitler veya nükleik asitlerle bozulması, 6 günde uyuyan hücrelerin çeşitli fenotipik ve moleküler yönlerini önemli ölçüde etkileyebilir ve zar lokalize veya hücre içi moleküllerin, faktörlerin veya sinyal yollarının uyku hali veya uykuda kalan hücrelerin hayatta kalması üzerindeki rollerini değerlendirmek için kullanılabilir. Testin in vitro doğasını tanırken, uykuda olan hücrelerin kurulması ve hayatta kalması için gerekli moleküler mekanizmalar hakkında önemli bilgiler toplamak için oldukça yararlı bir araç olarak işlev görebilir. Bu veriler, in vivo modellerde test edilecek hipotezler oluşturmak için kullanılabilir.
Hastalık kısa sürede küçük tümörler kan damarlarını 2,3 geliştirmek olarak saptanabilir 1 önce meme kanseri hücrelerinin kemik iliğine metastaz. Metastatik sürecin hızlı ama verimsiz. Hücreler günde 4 başına milyonlarca hızla yeni kan damarları girmek ancak birkaç uzak organlara 5 gezi hayatta. Bununla beraber, bazı mikrometastazlar kemik hayatta ve tek hücre veya yeni tanı konmuş hastaların 1 kemik iliği aspiratlarında küçük hücreli kümeleri olarak bulunabilir. Bu hücreler, onları 6 ortadan kaldırmak çok amaç için uygulanır adjuvan kemoterapi, karşı. Bu direnç kemik iliği mikroçevresindeki 7,8
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. clonogenic Deneyi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Deneyler tahlili özetlemek için yürütülmüştür. Deney zaman süreci Şekil 2A'da gösterilmiştir. Hücreler, gün -1 'de klonojenik yoğunlukta inkübe edilir, FGF-2, taze ortam içinde 0. günde ilave edilir ve boyanmış ve koloniler sayılmıştır, hücreler 6 gün kadar kültürlenir. Sistem için herhangi bir pertürbasyonlar 10 X son konsantrasyonda 100 ul hacim içinde 3. günde tatbik edilmektedir, istenen. Şekil 2B büyüyen ve atıl kolonilerin tipik bir görünüm gösterir. Büyüyen kolonile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bizim modeli kemik iliğindeki uyuşukluk birkaç anahtar unsurlarından oluşur. O fibronektin, kemik iliği önemli bir yapı elemanının, FGF-2, bir büyüme faktörü bol kemik iliği stroma ile sentezlenebilir oluşur, östrojen uzun süreler için 10 iliğinde atıl kalması muhtemel tip duyarlı hücreler, oluşmaktadır ve ağır etkileşimleri alt tabaka ile öncelikle klonojenik yoğunlukta hücrelerin kemik iliğinden 31,32 ve inkübasyon dışı matriks içinde yatırılır. Kemik iliği mikroçevresinin çok daha karmaşık olsa .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Savunma Hibeler DAMD17-01-C-0343 Bölümü ve DAMD17-03-1-0524, New Jersey Eyalet Komisyonu Kanser Araştırma 02-1140-CCR-E0 ve Kanser Araştırma Ruth Estrin Goldberg Memorial (RW) tarafından desteklenen
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MCF-7 hücreleri | ATCC | HTB-22 | |
| T47D hücreleri | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronektin 24 Kuyu Şeffaf Düz Tabanlı TC İşlemli Çok Kuyulu Plaka | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronektin 60 mm Kültür Kapları | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronektin 100 mm Kültür Kapları | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 İnsan fibronektininin tek tip bir uygulaması ile Cam Lamel | Corning | 354088 | |
| 6 Kuyulu doku kültürü plakası | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modifiye Eagle Orta Yüksek Glikoz 10X Toz | Corning Yaşam Bilimleri | 50-013-PB | |
| Isı ile Etkisizleştirilmiş, Fetal Sığır Serumu | Serum Kaynağı Uluslararası | FB02-500HI | |
| %0.25 Tripsin / 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamin, 100X, Sıvı | Corning | 25-005-CI | |
| Rekombinant İnsan FGF temel | Ar-Ge D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt İnhibitörü (1L6-Hidroksimetil-chiro-inositol-2- (R) -2-O-metil-3-O-oktadesil-sn-gliserokarbonat) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitörü |
| C3 transferaz | Hücre iskeleti | CTO3 | , RhoA, RhoB ve RhoC'yi inhibe eder, ancak Cdc42 veya Rac1 |
| Y-27632 dihidroklorür gibi | Santa Cruz Biyoteknoloji | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (yeşil) | Moleküler Problar | B607 | Fibriller aktin boyama için florokrom, |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (kırmızı) | Fibriller aktin boyama için | Moleküler Problar | R415 |
| Alexa Fluor 488 Eşek anti-Fare IgG Antikoru, ReadyProbes Reaktifi ve nbsp; | Moleküler Problar | R37114 | |
| ProLong DAPI ile Altın Antifade Mountant | Moleküler Problar | P-36931 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste