Yöntem makalesi

Bir

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52672

⸱

30 Haziran 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

Bu makalede

Özet

Östrojene duyarlı meme kanseri hücreleri için kemik iliğinde in vitro bir uyku hali modeli geliştirdik. Bu protokolün amacı, uyku halinin moleküler ve hücresel biyolojisinin incelenmesi ve daha sonraki in vivo testler için hipotezlerin üretilmesi için modelin kullanımını göstermektir.

Özet

Kemik iliğinde meme kanseri uyku halinin incelenmesi, uyuyan hücrelerin mikro çevreleri ile etkileşimlerinin karmaşıklığı, nadirlikleri ve hematopoietik hücrelerin ezici fazlalığı nedeniyle son derece zor bir girişimdir. Bu amaçla, kemik iliğinde östrojene duyarlı meme kanseri hücrelerinin uyku hali için in vitro 2D klonojenik bir model geliştirdik. Model, uyku hali için gerekli olan birkaç temel unsurdan oluşur. Bunlar şunları içerir: 1) uzun süre uykuda kalması muhtemel tip olan östrojene duyarlı meme kanseri hücrelerinin kullanımı, 2) her hücrenin yapısal etkileşiminin esas olarak substratum ile olduğu klonojenik yoğunlukta hücrelerin inkübasyonu, 3) fibronektin, kemik iliğinin önemli bir yapısal elemanı ve 4) FGF-2, kemik iliği stromal hücreleri tarafından bol miktarda sentezlenen ve hücre dışı matriste yoğun bir şekilde biriken bir büyüme faktörü. FGF-2 ile inkübe edilen hücreler, 6 gün sonra, belirgin düz bir görünüme sahip 12 veya daha az hücreden oluşan, büyüyen hücrelerden önemli ölçüde daha büyük ve daha fazla yayılmış ve büyük sitoplazma / çekirdek oranlarına sahip olan uykuda klonlar oluşturur. Buna karşılık, FGF-2 olmadan inkübe edilen hücreler, esas olarak >30 nispeten küçük hücreden oluşan büyüyen koloniler oluşturur. İnkübasyondan sonraki 3. günde sistemin antikorlar, inhibitörler, peptitler veya nükleik asitlerle bozulması, 6 günde uyuyan hücrelerin çeşitli fenotipik ve moleküler yönlerini önemli ölçüde etkileyebilir ve zar lokalize veya hücre içi moleküllerin, faktörlerin veya sinyal yollarının uyku hali veya uykuda kalan hücrelerin hayatta kalması üzerindeki rollerini değerlendirmek için kullanılabilir. Testin in vitro doğasını tanırken, uykuda olan hücrelerin kurulması ve hayatta kalması için gerekli moleküler mekanizmalar hakkında önemli bilgiler toplamak için oldukça yararlı bir araç olarak işlev görebilir. Bu veriler, in vivo modellerde test edilecek hipotezler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Hastalık kısa sürede küçük tümörler kan damarlarını 2,3 geliştirmek olarak saptanabilir 1 önce meme kanseri hücrelerinin kemik iliğine metastaz. Metastatik sürecin hızlı ama verimsiz. Hücreler günde 4 başına milyonlarca hızla yeni kan damarları girmek ancak birkaç uzak organlara 5 gezi hayatta. Bununla beraber, bazı mikrometastazlar kemik hayatta ve tek hücre veya yeni tanı konmuş hastaların 1 kemik iliği aspiratlarında küçük hücreli kümeleri olarak bulunabilir. Bu hücreler, onları 6 ortadan kaldırmak çok amaç için uygulanır adjuvan kemoterapi, karşı. Bu direnç kemik iliği mikroçevresindeki 7,8 ile etkileşimler tarafından başlatılan sinyalizasyon canlılığında, esasen, sahip olduğunu. Mikrometastaz lokalize meme kanseri olan kadınların yaklaşık üçte birinde bulunabilir ve tek değişkenli analizde 9 tarafından bakıldığında sağkalım bağımsız göstergesi temsil edilebilir. Bazı micromeyıda metastaz yapmış büyüme başlatılan, ancak nüks hücre türüne bağlıdır. Üçlü negatif meme kanserli hastalar uykuda devlet üzerinde kötü kontrol düşündüren, 1 ila 4 yıl arasında tekrarlama eğilimindedir. ER / PR + hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, nüks 10 sabit, sürekli oranı ile en fazla 20 yıl boyunca uykuda kalabilir. ER + ve ER- meme hücre hatları ve tümörler arasında dinlenme gen ifadesi imzaları farklılıklar farklı dinlenme potansiyelleri 11 yansıtmak iken, kemik iliği stroma ile etkileşimleri olası dinlenmesi önemli bir katkı oluşturmaktadır.

mikrometastazlar nadirdir ve 10'dan fazla 6 kat ile hematopoetik hücreler tarafından sayıca az, çünkü in vivo uyuşukluk çalışma son derece zordur. Bu nedenle, ilgili modelleri mekanizmaları önermek ve in vivo test edilebilir hipotezler üretebilir in vitro verilere sağladığı oluşturulmalıdır. MATHE içeren dinlenme modellerinin bir sayımatical modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo ksenograft modelleri 16, in vitro kombinasyonları ve ksenograft modelleri 17,18 ve spontan tümör ve metastaz modelleri 19, kanser hücresi dinlenmesi 20 içine bazı bilgiler vermiştir . Bu modellerin her biri, kendi sınırlamaları vardır ve kendileri moleküler sinyalizasyon ve dormansi daha biyolojik ilgili modelleri test edilmesi yöneten etkileşimler ile ilgili hipotezler üretme için öncelikle yararlıdır.

Dormansinin moleküler mekanizmaları, ER + hücreleri nüks neden döngüsü tutuklama, redifferentiation ve tedavi direnci ve mekanizmalar ile sonuçlanan mikroçevresinin ile etkileşimleri tanımlayan genel hedefi ile, ilgili unsurları seçilmiş sağlayan bir in vitro model geliştirdi stromal mikroçevresinin 7. Kendi bilefleninde ise nispeten seyrek Bu model,alınan parçaları, dormansi önemli fonksiyonlarını etkileyen spesifik moleküler mekanizmaları elde etmek için araştırmacılar izin yeterince sağlamdır. Bu deneyler, doğrudan in vivo test edilebilir hipotezler üretir. Model biz dormansi ilgili olduğu gösterilmiştir birkaç temel unsuru dayanır. Bunlar etkileşimi alt tabakası ve orta çözünür bileşenler, bir fibronektin alt tabaka ve bazik fibroblast büyüme faktörünün varlığı ile öncelikle bir klonojenik yoğunlukta estrojene bağlı meme kanseri hücrelerinin, hücre kültürünün kullanımı (FGF-2) ortam içinde.

Biz, TGFβ 22 aracılık FGF-2 21 ile hücre döngüsü tutuklama indüksiyon dahil olmak üzere in vitro sistemi yöneten mekanizmalar, karakterize bağlıydı bir epitel fenotip için PI3 Kinaz 7,8 ve ERK 8 ve morfojenik farklılaşma yoluyla sinyal sağkalım RhoA inaktivasyonu integrin45; 5β1 upregülasyonu ve hayatta kalma için 7,15 stromal fibronektin ligasyonu (Şekil 1). MCF-7 hücreleri üzerinde FGF-2, in vitro hücre döngüsü etkileri konsantrasyonlarda 10 ng / ml 21,23 altında en az bir günlük başlar. mantık memeli sistemlerinde 24-27 bir dizi meme kanalı morfojenezi siklik genişleme ve durgunluk yöneten FGF-2 ifadesinin zamansal kontrol dayanıyordu. Biz FGF-2 duktal 3D kültür 28 morfogenez ve genellikle insan tümörlerinin 29 malign transformasyonu ile kaybolur FGF-2 ifadesi de dahil olmak üzere, farklılaşmasını uyardığı gösterilmiştir. FGR1 ifadesi, tüm 4 FGF alıcılarını 30 ifade etmeye devam 29 ve MCF-7 hücreleri incelenen göğüs karsinomalarında bozulmadan kalmıştır. Uyuşukluk bağlamında, FGF-2 tarafından verilen ve ağır hematopoetik kök hücrelerin 33 korunmasında fonksiyonları, kemik iliği stroma 31,32 üzerine bırakılır. Biz demFGF-2 o morfojenik farklılaşmasını 7 indükler kemik iliğinde, ayrıca bol fibronektin Tabakasındaki, kültüre ER + meme kanseri hücrelerinde sönmüş bir devlet uyardığı belirlenmiütir. Modelde, göğüs kanseri hücrelerinin büyümesi inhibe edilir, RhoGap GRAF ile Rho A inaktive epitelyal fenotipe redifferentiate ve habis ilerlemesi ile integrinleri α5β1 lost-ekspres yeniden. Bu integrin α5β1 ile fibronektin bağlanan ve bu sitotoksik tedavi 7,8,15 (Şekil 1), karşı dirençli hale sinyal hayatta aktive eder. Rho sınıfı GTPases inhibisyonu atıl bir fenotip 34 uyarılması için, daha önce ortaya konmuştur.

Burada modelini kurmak ve ER + meme kanseri hücrelerinin dormansi düzenleyen spesifik moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için araştırmacılar izin verecektir belirli prosedürleri açıklayacağım. Burada yer alan deneylerde modeli kullanımını göstermek içinBiz bir Akt inhibitörü ve bir PI3K inhibitörü ve bir pan-Rho inhibitörü ve bir Rho Kinaz (ROCK) inhibitörü ile Rho ailesi (Şekil 1B) tüm üyeleri ile PI3K yolu (Şekil 1B) hedef aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. clonogenic Deneyi

  1. Adımları kullanarak MCF-7 ve T47D hücreleri aşağıda belirtilen estrojene bağlı meme kanseri hücre çizgilerinin bir tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması
    1. MCF-7 ya da T-47D hücreleri ile en fazla% 50 konfluent bir 10 cm'lik bir doku kültürü kabı kültür ortamı (DMEM /% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu / glutamin ve pen / strep) aspire. PBS ile durulayın. 1-4 dakika boyunca, 37 ° C'de% 0.25 / 2.21 mM EDTA DMEM yüksek glukoz içinde çözüldü tripsin kuluçkalayın.
    2. Tek bir hücre dağılımı sağlamak için faz kontrast mikroskop altında 1 dakika aralıklarla hücreleri kontrol edin. Hemen hemen değişmez, tek hücre durumunu elde etmek için, hücre-hücre teması bozmak için birkaç kez pipetleme ve aşağı 2 mi pipet ile tekrar süspansiyon hücreleri.
    3. Inkübasyon sadece 2 dakika sonra, hücre kümeleri gözlemlemek halinde en fazla 4 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin hücreleri inkübe devam edin. Onlar e yapışık kalırsa clonogenic çalışmalar için bu hücreleri kullanmayıntrypsinization 4 dakika sonra diğer ach hata koloni sayısı veriminde tanıtılacak çünkü.
      NOT: Hücreler clumped ise, oluşan kolonilerin sayısı kuluçkaya sayısından daha az hücre ürünü yansıtacaktır. Hücreler aşırı tripsinize edilir ise, bunların klonojenik potansiyeli azalabilir.
    4. Için gerekli olan tüm birimi ihtiva eden bir ana tüp içinde seri seyreltmeler ile, (hücre türü ya da geçiş sayısına bağlı olarak, + 500 hücre / ml) 24 yuvalı plakalar ya da daha az, / ml kültür ortamı 1500 hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak deneyde tüm değişkenler.
      Not: Amaç 800 hücre / cm2 (yaklaşık 500 1.100 hücre / cm2 aralığında) bir nihai hücre yoğunluğu. amacı, nispeten kolay sayma izin veren, yaklaşık 100 ± 50 koloniler elde etmek için olan engellerse ve koloniler artan ya da deneysel perturba azalmıştır zaman istatistiksel olarak anlamlı farklar ile sonuçlanması için yeterli koloniler izin verirleri.
  2. Adımlar Kullanma Clonogenic Yoğunluk inkübe Hücreler Aşağıda Outlined
    1. 1500 hücre / ml'lik bir ana tek bir hücre süspansiyonu tüp / oyuk 1500 hücre klonojenik yoğunlukta 24 yuvalı fibronektin kaplı plakalar üzerine dört kere ölçülen kuyucuklardaki hücreleri inkübe edin. 3 ml hazırlanması ve 2 kuyu her 1 ml ortam dağıtma ile 5 ml pipet olan hücreleri içeren bir ortam Karışım.
      Not: fibronektin kaplı plakalar önceden kaplanmış satın alınması gereken bir ticari bir satıcıdan. Kontrollü bir kalite dışında Kaplama tabaklar, pürüzlü bir yüzeyde otomatik işlem sonuçları bu deney için elverişsiz.
    2. , 5 ml pipet ile pipetleme ve aşağı süspansiyon karıştırın hücre süspansiyonu 3 ml hazırlamak ve 1 ml her biri 2 kuyu doldurun. Tek pipet herhangi bir anda sadece 2 kuyu doldurun. Aşağı yukarı pipetleme ve tekrar ana tüp içinde hücre süspansiyonu pipet tekrar süspansiyon hücreleri kalan hacim dönün ve başka bir 2 wel doldurmak için başka 3 ml hazırlamak1 ml her biri ls.
      NOT: Hücreler sürekli tortu çünkü ana borusunun sürekli karıştırma gereklidir. Sadece 2 kuyu doldurmak için yeterli sesini Çizim hücrelerin yanı sıra pipet tortu, çünkü her bir kuyunun benzer hücre sayıları eklemek gerekir.
    3. Izin hücreler clonogenic potansiyel (yayınlanmamış gözlemler) modüle edecek oda sıcaklığında ve CO 2 konsantrasyonunda süspansiyon oturup çünkü hücrelerin geniş hacimli dağıtmak için hızla çalışın.
    4. Koloni deneyleri için kuyulara içine pipetleme eylemi sırasında hücrelerin mekansal dağılımını optimize edin. Yavaş yavaş kuyunun ortasına nihai hücre konsantrasyonu içeren süspansiyonu pipetleme bunu. Hücreler dibe önce hareket ilerletmek için plaka maruz bırakmayın. Dairesel karıştırma etkin bir 6 gün iyi yaratarak yüksek hücre yoğunlukları ve sayılamayan konfluen kolonilerinin çevresine hücreleri santrifüj çünkü plaka girdap etmeyin.
      NOT: Bu tüm süspansiyon hücreleri ile ses tanıttıktan sonra hiçbir karıştırma daha az tercih edilir çünkü gerekli olmadıkça karıştırmayın. Bu hücrelerin karışımı için gerekli ise, düz bir yüzeye duruyor ise dik yönlerde ileri geri hareket ettirerek plakayı bunu.
    5. 6 gün süre ile ortam değişikliği olmadan, 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. iyi 6 gün sonra hücrelerin sayısının az ölçüde besin veya sitokin kompozisyonu ne de orijinal ortamın pH etkisi olmayacaktır.
    6. Analiz aşağıda belirtildiği gibi zaman sürecini Tasarım: 1 ml taze ortam ve taze ortam içeren ortam, mevcut yerine 1. günde fibronektin kaplı alt tabakalarının üzerinde hücrelerin inkübe FGF-2 aşağıdaki 6. günde 0. günde Leke hücreleri üzerinde 10 ng / ml 1.4). ) 1.3 olarak aşağıda, 3. günde herhangi bir deneysel tedirginlikler yürütün.
  3. Moleküler Sinyali veya Adezyon Molekülleri Kurma Deneysel pertürbasyonlarının
    1. 3 gün, 100 eklemek56; kuyularda 1 mi ortamına bozucu maddenin nihai amaçlanan konsantrasyonu 10x ihtiva eden bir çözeltiye, l. Karıştırma. İlave bir 3 gün için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe hücreleri devam edin.
      Not: maddeler rahatsızlık vermesini atıl durumunu desteklemek rol oynayabilir bir önleyicileri çeşitli ve yapışma moleküllerinin, reseptör veya diğer yüzey proteinleri, hücre içi sinyal yolları, moleküller, faktör, kofaktörler veya yapısal proteinlerin inhibitörleri bloke edici ajanlar içerebilir.
    2. 6. günde leke koloniler, aşağıdaki gibi.
  4. Leke Koloniler
    1. % 2 etanol / 10 mM sodyum borat taze yapılmış bir% 0.1 kristal violet (pH 9.0) çözeltisi ile kültür içinde 6 gün sonra leke hücreleri. Aspire ortam ve 20 dakika boyunca her bir göze bir ml kristal viyole çözeltisi ilave edilir.
    2. Bir buz kovası içine dar bir açıyla aşağı bakacak kuyu açıklıklar sürekli çalışan musluk ile taşan onları daldırarak plakaları yıkayınlavabo su. Kez sualtı yatay açı plaka yatırın kuyuya açarak ve bir yumuşak akan hareket çıkarırken daha sonra bir dar açıda geri yatırın.
    3. Kuyuların dibinde su artık mavi olana kadar daldırma 2 ya da 3 kez tekrarlayın. Güçlü yıkama sayma ve veri hata önemli ölçüde katkı, deneysel müdahale daha az yapışkan olan hücreler ya da koloniler kaldırabilir.
    4. Baş aşağı bunlara karşılık gelen etiketli kapakları bitişik tezgah üstünde havlu yerleştirerek gecede Kuru plakalar.
  5. Koloni Sayısı
    1. İnkübasyon, boyama ve kurutma her iyi sonra 6 gün büyüyen ve uykuda kolonilerin sayısını. Bir ters faz kontrast mikroskop optimal 40X büyütmede kolonileri sayın. Hücreler büyüdükten büyük expa kıyasla çok büyük boyutta morfolojik görünüşü ile, büyüyen ve 12 ya da daha az hücre koloniler olarak> 30 hücre kolonileri sayınBüyük sitoplazmalı NDED sitoplazma Şekil 1'de 7,15 gösterilen oranları, çekirdeğe.
      NOT: basit uyuşukluk tayinlerde çok sık değil gibi 13-29 hücre kümeleri normal sayılmaz. Tedirginlikler ya büyüyen ya da durağan hücrelerin büyüme potansiyelini vardiya halinde Onlar sayılabilir. Bu sonuçlar, daha sonra biyolojik öneme sahip ilişki gerekecektir.

İmmünofloresan Çalışmaları 2. clonogenic Kuluçka

  1. Sayılar / 24 yuvalı deneylere benzer bir yüzey alanı hücre karşılık, 6 oyuklu plakalarda / oyuk yaklaşık 7,500-8,000 hücrelere hücre sayısını ayarlar.
  2. Hücre eklenmesinden önce görüntüleme çalışmaları için 6 oyuklu plakaların her bir oyuğa tabanına yuvarlak steril, fibronektin kaplı kapak kayma yerleştirin. ) 1.2 yukarıda clonogenic deneyler için tarif edildiği gibi, her kuyuya 3 ml hacminde Pipetleyin hücreleri konsantrasyonlarda bir anda 2 kuyu, ana hatlarıyla.
  3. Inkübe hücreleriYukarıdaki 1.2.4 ve 1.2.5, 6 gün için. 1,3 koloni deneyi prosedürleri de tarif edildiği gibi), 300 ul hacminde 10 x konsantrasyonda günde 3 bozucu etkenler ekleyin.
  4. Antikorlarla 6. günde Leke hücreleri, örneğin integrinler α4, α5, α6, β1, β3, örneğin fokal yapışma karmaşık moleküllerdir FAK, paxillin ve vinkülin olarak hücre yapıştırma moleküllerine, örneğin α-tubulin motilitesinde karışan proteinler, örneğin, fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, örneğin, ya da uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi, doğrudan ya da dolaylı olarak ilişkin standart teknikler kullanılarak, herhangi bir başka protein gibi sinyal yolu üyeleri immünofloresan boyama.
    1. Aseton forseps gün 6. Fix slaytları çıkarın / metanol 1: 1 -20 ° C'de 20 dakika ve kuru hava için ° C. Alternatif bir sabitleyici, gerektiğinde paraformaldehid gibi, kullanılabilmektedir. 2 dakika f% 0.1 Triton X-100,% 0.1 sodyum sitrat ile Permeabilize hücrelerihücre içi antijenlere ya da tespiti. Hücrelerin PBS ile yıkayın.
    2. Dolaylı immunofluorecence boyama,% 5 BSA ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile ya da ikincil bir antikor elde edildiği türe% 10 preimmün serum blok slaytlar için.
    3. Yol üyeleri veya PBS içinde üretici tarafından tavsiye edilen özel dilüsyonları seyreltilmiş uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi olan herhangi bir başka protein sinyalizasyon, yapışma molekülleri, fokal moleküllerin hücre primer antikorlar ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe% 0.1 TRİTON X- -100.
    4. 3 kez PBS ile yıkayın. 2 st için oda sıcaklığında florofor-konjuge antikor ile kapak slipi inkübe edin. Bir örnek olarak, Alexa Fluor 488 eşek anti-fare IgG antikoru murin monoklonal primer antikorları tespit etmek için kullanılabilir. Dağı Dapi ile antifade madde kullanılarak cam slaytlar aşağı hücre tarafı lamelleri. Oje ile çevrelerinin Seal.
    5. Doğrudan Immünofloresan için, BSA yürütmekYukarıdaki 2.4.2) bloke 4 ° C'de gece boyunca florofor ile konjüge primer antikor ile inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Oje ile bir antifade ajan ve Dapi ve mühür ile slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
    6. 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile Kapak slayt tepsiler Görüntüleme ve fotoğrafçılık zaman kadar birkaç hafta sonra C °. 1,000x büyütmede bir kamera ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskobik görüntüleme sistemlerini kullanarak görüntüleme ve fotoğraf hücreleri.
    7. Fibril aktin boyama için,% 1 sığır serum albümini (BSA), blok slaytlar, 30 dakika ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında BODIPY FL-Phallacidin (yeşil) ya da Rhodamine phalloidin (kırmızı) inkübe edilir. Bir antifade maddesi ekleyin ve yukarıdaki gibi mühür.

Moleküler Çalışmaları 3. clonogenic Kuluçka

  1. Western blot
    1. Fibronec 20.000 hücre / 60 mm levha ve 50,000 hücre / 100 mm plaka klonojenik yoğunluklarda ER + meme kanseri hücreleri, MCF-7 ya da T47D inkübekalay kaplı% 5 CO2 içinde 37 ° C'de plakalar.
    2. Lizatlanndan protein mg miktarlarda gerektiren moleküler çalışmalar için 75.000 hücre / 100 mm plaka biraz daha yüksek yoğunluklarda hücreleri inkübe. Western lekeleri kullanılarak molekül çalışmalar ya da Northern blotlar için RNA izolasyonu için yeterli protein toplamak için deney noktası için on plakalara kullanın.
    3. Hücre sayısı göre jel yükleme çok farklı büyüklükte büyüyen ve durağan hücrelerde protein ifadesini karşılaştırmak için gerekli bir ilave maddedir. Trypsinizing hücreleri toplamak ve yerine tek kenar bıçak ile hücrelerin kapalı kazıma Western lekeleriyle için lizatları hazırlanması için% 0.2 Tripan Mavi bir hemositometrede bir kısım saymak.
    4. Santrifüj hücreler 2 dakika için 10,000 x g'de, aspirasyon ile ortamını çıkarın 200 ul liziz tamponu ilave lizis tampon hücreleri sonikasyon ve protein konsantrasyonu belirlenir.
    5. Hücrelerin sayısına göre protein verimi bölünmesiyle hücre başına protein miktarını hesaplayıno miktarda üretilir. Eşdeğer hücre sayıları temsil protein) eşdeğer miktarlarda ve B) protein miktarları hem de temsil eden ayrı bir poliakrilamid jeller her kuyuya lizat yükleyin. En az 25 ug protein, her bir kuyunun içine yüklenmiş olması gerekir.
      NOT: Bu boyut ve protein içeriği (şekil 1) önemli ölçüde farklı olan büyüyen ve uykuda hücreleri arasında karşılaştırmalar izin verir.
  2. Akış sitometrisi
    1. 3.1 gibi, tripsinizasyon ile 100 mm tabak hücreleri toplamak ve 2.4 de tarif edilen hücre içi ya da hücre dışı antijenlere ya birincil veya ikincil immünofloresan boyama ile (FACS) protokollerini ayırma, standart floresan aktive hücre tarafından analiz eder.
      Not: Antikor etiketleme ile belirlendiği gibi tripsinizasyon ile doku kültürü plakalarından hücrelerin ayrılması membran proteinlerinin konsantrasyonu etkilemez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deneyler tahlili özetlemek için yürütülmüştür. Deney zaman süreci Şekil 2A'da gösterilmiştir. Hücreler, gün -1 'de klonojenik yoğunlukta inkübe edilir, FGF-2, taze ortam içinde 0. günde ilave edilir ve boyanmış ve koloniler sayılmıştır, hücreler 6 gün kadar kültürlenir. Sistem için herhangi bir pertürbasyonlar 10 X son konsantrasyonda 100 ul hacim içinde 3. günde tatbik edilmektedir, istenen. Şekil 2B büyüyen ve atıl kolonilerin tipik bir görünüm gösterir. Büyüyen kolonile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bizim modeli kemik iliğindeki uyuşukluk birkaç anahtar unsurlarından oluşur. O fibronektin, kemik iliği önemli bir yapı elemanının, FGF-2, bir büyüme faktörü bol kemik iliği stroma ile sentezlenebilir oluşur, östrojen uzun süreler için 10 iliğinde atıl kalması muhtemel tip duyarlı hücreler, oluşmaktadır ve ağır etkileşimleri alt tabaka ile öncelikle klonojenik yoğunlukta hücrelerin kemik iliğinden 31,32 ve inkübasyon dışı matriks içinde yatırılır. Kemik iliği mikroçevresinin çok daha karmaşık olsa ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Savunma Hibeler DAMD17-01-C-0343 Bölümü ve DAMD17-03-1-0524, New Jersey Eyalet Komisyonu Kanser Araştırma 02-1140-CCR-E0 ve Kanser Araştırma Ruth Estrin Goldberg Memorial (RW) tarafından desteklenen

Teşekkürler

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MCF-7 hücreleriATCCHTB-22
T47D hücreleri ATCCHTB-123
BD BioCoat Fibronektin 24 Kuyu Şeffaf Düz Tabanlı TC İşlemli Çok Kuyulu PlakaCorning354411
BD BioCoat Fibronektin 60 mm Kültür KaplarıCorning354403
BD BioCoat Fibronektin 100 mm Kültür KaplarıCorning354451
BD BioCoat 22x22mm #1 İnsan fibronektininin tek tip bir uygulaması ile Cam LamelCorning354088
6 Kuyulu doku kültürü plakasıCellTreat229106
Dulbecco Modifiye Eagle Orta Yüksek Glikoz 10X TozCorning Yaşam Bilimleri50-013-PB
Isı ile Etkisizleştirilmiş, Fetal Sığır SerumuSerum Kaynağı UluslararasıFB02-500HI
%0.25 Tripsin / 2.21 mM EDTACorning25-053-CI
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100XCorning30-002-CI
L-Glutamin, 100X, SıvıCorning25-005-CI
Rekombinant İnsan FGF  temelAr-Ge D Systems234-FSE-025
Akt İnhibitörü (1L6-Hidroksimetil-chiro-inositol-2- (R) -2-O-metil-3-O-oktadesil-sn-gliserokarbonat)CalBiochem124005
LY294002 CalBiochem19-142Chenical PI3K inhibitörü
C3 transferaz Hücre iskeletiCTO3, RhoA, RhoB ve RhoC'yi inhibe eder, ancak Cdc42 veya Rac1
Y-27632 dihidroklorür gibiSanta Cruz Biyoteknoloji129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (yeşil) Moleküler ProblarB607Fibriller aktin boyama için florokrom,
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (kırmızı) Fibriller aktin boyama içinMoleküler ProblarR415
Alexa Fluor 488 Eşek anti-Fare IgG Antikoru, ReadyProbes Reaktifi ve nbsp;Moleküler ProblarR37114
ProLong DAPI ile Altın Antifade Mountant Moleküler ProblarP-36931
ilgili GTPazları inhibe etmez; Florokrom

Kaynaklar

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569(2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914(2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik li i DormansisiFibronectin Kapl PlakalarFGF 2 UygulamasKlonojenik Yo unluk K lt rKoloni Olu um AnaliziPI3K nhibit r UygulamasKristal Viyole BoyamaDormant Koloni Kantifikasyonu

İlgili makaleler