Yöntem makalesi

Etanol sedasyon Hassasiyet ve hızlı Hoşgörü Ölçüm Ucuz bir, Ölçeklenebilir Davranış Deneyi

10K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52676

⸱

15 Nisan 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

Bu makalede

Özet

Drosophila'da etanol duyarlılığını ve hızlı toleransı ölçmek için yapılan basit tahliller, etanol ile ilgili bu önemli davranışları araştırmak için bu model organizmanın kullanımını kolaylaştırır. Burada, sineklerde etanol duyarlılığını ve hızlı toleransı ölçmek için nispeten basit, ölçeklenebilir bir test açıklanmaktadır.

Özet

Alkol kullanım bozukluğu (AKB) ciddi bir sağlık sorundur. TL büyük bir kalıtsal bileşeni olmasına rağmen, birkaç gen açıkça etiolojilerine implike edilmiştir. meyve sineği Drosophila melanogaster, alkolle ilişkili davranışları altında yatan moleküler genetik mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir modeldir ve bu nedenle belirlenmesi ve TL etkileyen genlerin fonksiyonunu anlamak için büyük umut vaat ediyor. çalışmaların bu tür Drosophila modelinin kullanılması güvenilir etanol davranışsal tepkilerini ölçmek tahlillerin bulunmasına bağlıdır. Bu rapor sinekler etanol duyarlılığı ve hızlı tolerans değerlendirmek için uygun bir deneyi anlatır. Bu deneyde ölçüldüğü Etanol duyarlılık sinekler testten hemen önce gıda olmadan muhafaza edilir seviyesi ve kullanılan etanol konsantrasyonu, daha önce bildirilen genetik manipülasyonlar, bir dizi ve zamanın da uzunluğu ile etkilenir. Bunun aksine, etanol sBu deneyde ölçüldüğü ensitivity uçucu işleme, sinekler cinsiyeti ve antibiyotik veya canlı maya büyüme ortamı takviyesi gücü etkilenmez. Nicelleştirme etanol hassasiyeti için üç farklı yöntem esas itibarı ile ayırt etanol duyarlılık sonucu yol açıklanmıştır. genel sadeliği ile birlikte bu testin ölçeklenebilir yapısı, ve nispeten düşük gider set-up Drosophila etanol duyarlılığı ve hızlı hoşgörü küçük ve büyük ölçekli genetik analiz için uygun hale getirmek için.

Giriş

Alkol kullanım bozukluğu (AKB) dünya çapında (1 gözden) büyük bir sağlık sorunudur. AUD gelişimini sürüş mekanizmaları karmaşık olmasına rağmen, bu bozukluklar önemli bir genetik bileşeni var (örneğin, 2). AUD ve korunmuş davranışsal tepkilerin büyük kalıtım daha moleküler temelini anlamaya yönelik etanol ilgili davranışlar belirli genleri araştırmak için genetik model organizmalar kullanarak güçlü bir ilgi yarattı (3,4 gözden) birçok türler arasında etanole AUD. meyve sineği Drosophila melanogaster, (3,4 gözden) etanol ile ilgili davranışlar moleküler genetik mekanizmaları keşfetmek için bir lider model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Sinekler Çalışmaları (5 gözden) etanol davranışsal tepkilerin çeşitli sinyal yolları için roller sermiştir. Ilginç genlerin ve yolların bazı davranışsal RESPONS etkilediğisinekler etanol için es de kemirgen etanol ilgili davranışlar ve / veya insan AUD (örneğin, 6-14) suçlanmıştır. Drosophila modeli sisteminde mevcut genetik araçları paketi ile birleştiğinde türler arasında etanol ilgili davranışları, sürüş mekanizmalarının korunması, etanol davranışsal tepkilerin genetik araştırmak için meyve sineği modelinin programı altını çiziyor.

Hassasiyet 15,16 ve insanlarda etanol (17 gözden) tolerans AUD gelişimine bağlıdır. Etanol bu davranışsal tepkilerin her ikisi de (3,4 gözden) laboratuar deneyleri çeşitli yoluyla sinekler örnek alınabilir. Yazarlar tarafından bilinen uçucu deneylerinin her etanol sakinleştirici ya da zamana-bağlı etanol kaynaklı sedasyon / koordinasyon bozukluğu veya zamana bağımlı geri dayanmaktadır.

Etanol duyarlılık ve r genetiği bizim gruptan bir önceki makaledeDrosophila apid toleransı, sineklerin etanol buharı kaynaklı sedasyon dayalı bir davranış tahlil 18 kullanılmıştır. Bu tahlilde Test canlı yetişkin aktararak başlatılan selüloz asetat fişinin üst (yani olmayan sinek tarafı) etanol ilave bir selüloz asetat fişi ile şişeler içinde sinekler yakalama, gıda şişeleri boşaltmak için anestezi olmadan uçar, ve Bir silikon tıpa ile sinekler, selüloz asetat fişi ve etanol içeren flakon sızdırmazlık (18 referans, Şekil S3 şematik bakınız). Sinekler farklı grupları temsil Çok sayıdaki vial, bu tahlilin arttırarak, paralel olarak değerlendirildi. Şişeler anonim kod verildi ve deneyci sedasyon değerlendirilmesinde istenmeyen önyargı önlemek için tedavi grubuna kör edildi. Standart bir deneyde, şişeler içinde, 30 saniyelik bir geri alındıktan sonra her şişeye sedasyon sinekler sayısı sayılmış ve Converte edildi, 6 dakika aralıklarla yavaşça akıtıldı, daha edildi ve sineklerYüzde aktif sinekler d. Sinekler iç etanol 18 ve sedasyon (bu raporda cf referans 18 ve Şekil 1A ve 1B) ilerici artışa neden bir zaman-bağımlı bir şekilde selüloz asetat prizinden etanol buharı absorbe. Bu tahlilde Sedasyon operasyonel yürüyüş veya (ii) veya kanatlarını çırparak olmadan sırtlarında yatan yokluğunda sinekler (i) ayakta olarak tanımlandı. Burada, bu etanol sedasyon deney ayrıntılı olarak tarif edilmiştir, bunu kullanarak ilgili daha fazla işlevsel optimizasyonu sağlanır ve deney uçucu sedasyon duyarlılık gıda takviyesi seçenekleri katkı adreslemek için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tahlil önce 1. Gün

  1. Kısa (1-5 dk) CO 2 altında 11 (tek seks) gruplar halinde taze gıda şişeleri içine sinekler toplayın.
  2. Sinekler, çevre şartları kontrol alanı gıda şişeler içinde (tipik olarak 25 ° C,% 60 nispi nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü) O / N kurtarmak için izin verin.
  3. Planlanan deney için uygun nihai konsantrasyon (lar) saflaştırılarak (≥18 MΩ) su içinde (% 100), etanol seyrelterek etanol çözeltisi (ler) hazırlayın. Çözüm (ler) RT O / N dönmek için izin verin.
    Not: etanol seyreltilmesi ekzotermiktir.

Deney 2. Gün

  1. Sineklerin her flakon test edilebilmesi için, temiz, boş gıda flakon (i) hazırlamak; yani, test şişe, (ii), yeni bir selüloz asetat fiş, (iii) silikon durdurucu ve (iv) etanol çözeltisi (bakınız Tablo 3), 1 mi.
  2. 55-65% 20-25 ° C sıcaklık ve bağıl nem ayarlayarak test odası hazırlayın.
  3. Başka bir işçi varflakon her grup için benzersiz bir kod atamak ve sonrası için kod kaydedin. Bir kaç dakika ACCLIMATE test odasında sinekler ile kodlanmış şişeleri yerleştirin.
  4. 2.3 den sinek şişeleri kodları maç boş test şişeleri etiketleyin.
  5. Tablo 1 benzer bir elektronik sütunların içine kodları (tek sütun / şişe) girerek sert bir kopya test günlüğü oluşturun.
  6. Bir kılavuz olarak test günlüğünü kullanarak, test odasında dizileri eşleşen içine sinek ve boş şişeleri test ile kodlanmış gıda şişeleri düzenlemek.
    Not: sınamak için flakon makul sayısı 24 olan (yani, 4 flakon her 6 setleri).
  7. Aktarım eşleşti / etiketli boş test şişeleri içine gıda şişeleri uçar ve selüloz asetat fişler flakon üstleri altında 2 cm kadar hemen test şişeleri içine selüloz asetat fişlerini takın.
  8. Bundan sonra, sendeleyerek 1 dakika aralıklarla bir dizi olarak dört flakon her satırı ele.
  9. Zaman 0 değerlendirme için, ayrı ayrı w her şişeyi kavramaki başparmak ve işaret parmağı, şişenin dibine vurmak sinekler 30 saniye bekleyin ve sonra ölü / hareketsiz olan sinekler sayısını saymak için masaya hafifçe üç kez dokunun. Zaman basılı test günlüğüne 0 dakika, her flakon için hareketsiz / ölü sinekler numarasını kaydedin.
  10. Zamanlayıcı 0 zamanında sürekli olarak saymaya başlar ve hemen ardından 4 şişeleri birinci satır / grubu için, ampuller içindeki selüloz asetat fişleri etanol, 1 ml ilave başlar. Bu test edilecektir amacıyla 5 saniye aralıklarla şişeler içinde selüloz asetat fişleri etanol 1 ml ilave edilir. Etanol selüloz asetat fişleri boyunca eşit emilir ve böylece bir dairesel hareketlerle selüloz asetat fişleri etanol ekleyin. Etanol kümesindeki tüm 4 test şişelerine eklendi, bunu kapatmak için her bir tüp içinde bir silikon fiş yerleştirin.
  11. Kez 1, 2, 3, 4 ve 5 dakika içinde, sırasıyla, 4 şişeleri ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümelerine etanol 1 ml. Sonra silikon tapalar ekleyerek devam4 şişelere her bir grubu için etanol ilave edilmesi.
  12. Süresi 6 dk, başparmak ve işaret parmağı ile her flakon açgözlü şişenin dibine sinekler devirmek için masaya hafifçe üç kez dokunarak, 30 sn bekledikten sonra sayma ve toplam sayısını kaydederek 4 flakon ilk seti testi sedasyon olan sinekler. Skor onlar (i) şişenin yere durmak fakat ya kanatlarını çırparak olmadan sırtlarında yürümek veya (ii) yalan yoksa sedasyon gibi uçar.
  13. Tablo 2'de zamanlama ile 5 sn aralıklarla kümesi içinde her şişeyi tutun.
  14. Ilk kümesi için yapıldığı gibi kat 7, 8, 9, 10 ve 11 dakika içinde, sırasıyla küçük şişeler, ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümeleri test edin.
  15. Süresi 12 dakika içinde 2.12 tarif edildiği gibi, tekrar 4 şişeleri ilk seti test sırasıyla, 13, 14, 15, 16 ve 17 dakikada şişeleri ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı kümeleri test etmektedir.
  16. Tüm sinekler s kadar 2.12 açıklandığı gibi test sinekler Devamedated.
  17. Basılı test günlüğüne her şişe içinde sinekler toplam sayısını girin. Sineklerin sayısı zaman 0 hareketsiz / ölü sinekler sansür.
  18. Zaman (x-ekseni) karşı% aktif sinekler (y-ekseni) ve her değerlendirme noktasında yüzde aktif sinekler ve arsa verileri hesaplar. Polinom veya Sigmoidal eğrisi uyan üçüncü sırasından Sedasyon Süresi 50 değerleri (ST50,% 50 sedasyon süresi) interpolating veya eğri altında kalan alan hesaplanarak etanol sedasyon nicelleştirmektedir.
  19. Çözülmüş şişeleri verileri derlemek ve istatistiksel analizler gerçekleştirmek (örn, tek yönlü ANOVA Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile) deneysel tasarım için uygun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu etanol sedasyon testte elde edilen ham veriler, etanol buhar maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak sedasyon edilir sinek sayısıdır. Ham veri zamanın bir fonksiyonu olarak yüzde aktif sinekler dönüştürülür (birincil veri 1A Şekil, B, D - F). Eğri uygun birincil veri etanol sedasyon duyarlılık interpolasyon yoluyla, Sedasyon Süresi 50 (ST50) olarak eğri (AUC) altında sedasyon veya aea olmak için sinek% 50 için gerekli zamanı miktarı belirlenebilir. Daha önce (ortalama R 2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tekrarlanabilir anlamlı fenotipleri ölçmek basit testler davranış analizi için büyük değer taşımaktadır. Burada anlatılan çalışmalar Drosophila etanol sedasyon hassasiyet ve hızlı tolerans ölçmek için bir tahlil birkaç pratik yönlerini ele almaktadır. Bu çalışmanın bir odak rağmen, davranışsal analizler bir çalışma içinde denek için çevre ve genetik arka plan sabit sürdürerek kolaylaştırılmıştır. Ayrıca, karşılaştırma tipik haliyle yetiştirilen ve yan yana test sinekler gruplar arasında yapılmalıdır. Bu amaçla,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alkolizm ve Alkol Suistimali Enstitüsü'nden M.G.'ye (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537) hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar, yararlı tartışmalar için Jill Bettinger'e ve teknik yardım için Jacqueline DeLoyht'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
gıda şişeleriVWR89092-772dar
FlugsGenesee/flystuff.com49-102dar
silikon tıpaFisher Scientific09-704-1l# 4
etanolPharmaco-Aaper111000200200 kanıt

Kaynaklar

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Etanol Sedasyon DeneyiDrosophila MelanogasterEtanol Duyarl li e Test Y ntemiSedasyon S resi 50Genetik AnalizAlkol Kullan m Bozuklu uSel loz Asetat T ka lar

İlgili makaleler