Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Karaciğer sinusoidal endotelyal hücreleri (LSECs) yüksek hepatik sinusoid duvarını kaplayan endotel farklılaşmış hücrelerdir. LSECs olmayan diyaframlı olan fenestrasyonlar ile delinir, transselüler çapı 50-250 nm gözenekleri. LSECs yüzeyinin% 20 kadar elek plakalar ^1-3 (Şekil 1) olarak adlandırılan yüzlerce onlarca gruplar halinde genellikle fenestrasyon, ile kaplıdır. Fenestrasyonlar bir yüksek verimli ultrafiltrasyon sistemi oluşturmak, plazma ve kan ve hepatositler arasında nanosubstrates aktarımını sağlar. Fenestrasyonlar dinamik yapıları vardır - kendi büyüklüğü ve / veya numara hem çeşitli fizyolojik devletler, uyuşturucu ve hastalığa tepki olarak değiştirilebilir. Örneğin, fenestrasyonlar tok halde ⁴ daha aç bırakılmış daha büyük olan; Hücre yaşlanması ve bir çok hastalık durumunda ^7-13 oluşur başına ^5,6 ve büyüklüğü bir azalmaya ve fenestrasyonlar sayısı; 2-di-iodoamphetamine fenestrasyon sayısını artırır 1 fenestrasyonuna modüle.

fenestrasyonlar çalışma zordur. sağlam karaciğer dokusu veya kültür LSECs hem daha önce sadece gözlem kullanılarak elektron mikroskobu mümkün olmuştur bu yüzden fenestrasyonlar çapı, geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü altında yatıyor. taramalı elektron mikroskobu (SEM), en sık SEM binlerce endotel yüzeyi ve ölçüm geniş alanların gözlem için sağlar, çünkü fenestrasyon boyutu, frekans ve gözeneklilik (fenestrasyon delinmiştir LSEC membran yüzdesi) incelemek için kullanılmıştır değil onlarca fenestrasyonlar binlerce eğer. Kendi programını rağmen, rapor sonuçlara yönelik çalışmalar SEM-tabanlıBu tür fenestrasyon boyut, sayı, frekans ve gözeneklilik LSEC parametreleri literatürde (Tablo 1) geniş çapta değişebilir.

Fenestrasyonlar ve elek plakaları sözleşme, kırmak dilate veya numune hazırlanması sırasında birleşme kırılgan yapılardır, bu nedenle dikkatli işleme kendi bütünlüğünü korumak için gereklidir. Artmış perfüzyon basıncı ^14; Fiksatif ve tampon ¹⁵ yanlış ozmolarite; yetersiz fiksasyon veya fiksasyon süresi; ve post-fiksasyon dehidrasyon ve kurutma hızı ultrastrüktürü korunması müdahale eserler (Şekil 2) üretebilir SEM için işleme her alanlardır. Fenestrasyonlar kaybı ("Defenestration ') ve fenestrasyon çekme indirgenmiş fenestrasyon çapı ve hücre gözeneklilik ile sonuçlanır, kötü tespitin sonucu olarak meydana gelebilir. SEM analizi için numunelerin korunmasını geliştirmek için yöntemler daha önce ^15-17 tarif edilmiştir ve tartışılacaktırBurada örnek korunmasını artırmak için nasıl ek ipuçları. Numune korunması temel amaçları LSEC yüzeyi görsel böylece sinüzoidler kan kaldırmak ve yüksek basınç ya da geciktirilmiş tespit birinden LSEC zarar görmesini önlemek için vardır. Portal ven yoluyla fiksatif Whole karaciğer perfüzyon karaciğer fiksasyon için tercih edilen bir yöntemdir. Detaylı olarak tarif edildiği gibi başka bir yerde ^16,18 perfüzyon düşük bir basınçta yapılmalıdır (örneğin, H ₂ 0 10 cm) LSEC basınçla ilgili perfüzyon eserler ve zarar gelmesini önlemek için, tipik olarak, hücre membranında içinde olduğu gibi büyük boşluklar göstermiştir. Başka bir yerde ¹⁹ detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi Bununla birlikte, makul bir sabitleme genellikle, insan ve hayvanlarda karaciğer biyopsi iğnesi perfüzyon kullanılarak elde edilebilir. Kan örneği üzerinden temizlendi kadar bu teknik, doğrudan dokuya sabitleştirici enjekte içerir ve doku sağlam ve sabitlenir. Elektron mikroskobu için örneklerin Fixation perf olması gerekirkaraciğerleri derece hızlı otolitik süreçleri sonucunda ortaya çıkan ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek için kan akımının kesilmesini takiben mümkün olduğunca çabuk ormed.

Biz de eserler dahil en aza indirir ve fenestrasyonlar ölçümünü standartlaştıran görüntü analizi bir yöntem mevcut. Gözeneklilik ve fenestrasyon frekansı için mikrograflar için sinüzoidler seçiminde değişimi, eserlerin görüntü analizi ve hücre alanının ölçümü geçme sonuçlarını büyük farklılıklara yol açmıştır. Değerlendirilmesi ve fenestrasyonları ve veri sunumu için minimum gereksinimleri ölçümü için bir standart yaklaşım açıkça daha önce ^4,10,20-31 literatürde ele alınmamıştır.

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız Sydney İl Sağlık İlçe Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır. izin prosedürleri, proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahı sağlayacak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri mevzuat uyumu sağlayın.

1. Protokol EM sabitleyici Hazırlama için

1. Sabitleştirici 100 ml için, 65 ° C bir konik bir şişe içinde 25 ml distile su, ısıya paraformaldehit toz 2 g eklenerek manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmak suretiyle paraformaldehid hazırlar.
   NOT: Glutaraldehyde, paraformaldehıt ve sodyum kakodilat tampon tüm tehlikeli maddeler ve her zaman fumehood ele alınmalıdır.
2. Daha sonra soğumaya bırakın 65 ºC min 2 ısı. Gerekirse, sodyum hidroksit çözeltisi ekleme dropwISE tamamen çözeltinin-berraklaştırılması için karıştırılırken.
   NOT: sodyum hidroksit tehlikeli, dikkatli olun.
3. EM notu stok glutaraldehit 10 ml, 50 ile 0.2 M sodyum kakodilat tamponu ml sükroz 2 g ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 1.0 M CaCl ₂ 2 ml ekleyin.
4. Damıtılmış su ile 100 ml'ye solüsyonu yapmadan önce pH 7.4'e ayarlayın. Nihai sabitleyici% 2.5 glutaraldehit,% 2 paraformaldehit, 2 mmol _CaCl2, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 2 sukroz içermektedir. Toplam Osmolalite 440 mOsmol / L olduğundan emin olun. Preparat 24 saat içinde kullanın.

Karaciğer 2. perfüzyon Fixation

1. 37 ºC - 35 Sıcak perfüzyon tampon ve fiksatif. kan kaybı tamponu ve fiksatif doğru sıcaklık doku bütünlüğünü sağlamak için yardımcı olur.
2. 50 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg iksilazin tek bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezi uygulayın.
3. Hayvan altına alındıktan sonraarka bacak çekilmesi ve kuyruk tutam tarafından değerlendirilen derin anestezi, Y kesi karaciğer ve portal ven ortaya çıkarmak için hayvanın karın künt uçlu makas ile yapılır.
   NOT: Bu ekipman kolayca SEM görülecektir mikroorganizmalar ve genel enkaz ile örneklerin kirlenmesini önlemek için temiz olduğundan emin olun.
4. Diğer daha distalde karaciğer, karaciğer portal ven yaklaşık bir proksimal iki çok gevşek sütür kravat.
5. Kanül sabitlemek için .Tighten dikişler (fareler için sıçanlar için 18 G, 22 G) uygun boyutta IV kanül ile portal ven cannulate.
6. Fosfat tamponlu tuzlu su ile perfüzyon başlar 37 ° C ısıtıldı ve H ₂ 0 10 cm arasında bir basınçta. PBS içinde 5 ila 20 mi, genellikle karaciğer asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​için gereklidir.
   NOT: hava kabarcıkları da embolizasyon ve basınca sekonder eserler neden olarak kanül bağlı tüpler aracılığıyla karaciğer girmesine izin vermeyin; Hepatositlerde hasar, siPerfüzyon basıncı fazla yüksek ise, nusoids ve LSEC fenestrasyonlar oluşur.
7. Abdominal ve torakal vena kava tampon karaciğer serbestçe çıkmak için izin Sever. Bu LSECs yüksek geri basınç hasarını önler.
8. Karaciğer kan ücretsizdir sonra, EM fiksatif ile PBS değiştirin ve karaciğer sertleştirilmiş ve çok solgun kadar, yaklaşık 5 dakika boyunca serpmek.
9. Perfüzyon durdurun ve 1 sabitlenir karaciğer kesti - keskin neşter kullanılarak 2 mm ³ blok.
10. 4 ºC'de 72 saat - 24 EM sabitleştirici sonrası düzeltme doku.
    Not: Genellikle, underfixation overfixation daha eserler neden olur.
11. 4 ºC'de depolama için 0.1 M sodyum kakodilat tampon sonrası düzeltme dönemi izleyen sabitleyici değiştirin.
    NOT: Bu şekilde saklanan örnekler bir (12 aya kadar) önemli zaman döneminde, ancak zamanında ikincil sabitleme için korunacaktır ve sınav En iyi sonuçlar için tavsiye edilir.

3. İğne Perfusion

NOT: İğne sabitleme doğrudan biyopsi karaciğer dokusu içine fiksatif enjekte edilmesini içeren perfüzyon fiksasyon bir çeşididir. sabitleştirici onları asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve sabitleştirici doku bloğun tüm teşhir amacıyla kan damarları aracılığıyla temizlenmesi için amaçtır. Bakım basınç yaralanması ^18,19 önlemek için düşük enjekte etme basıncını tutmak için alınmalıdır.

1. Hayvan veya konunun karaciğer küçük bir parça çıkarıp kan ve enkaz kaldırmak için tuzlu suda durulayın.
2. Ince uçlu bir iğne (tipik olarak bir insülin şırıngası) ile donatılmış bir şırınga halinde normal tuzlu su çizin.
3. Kan dokusu dışarı kızarmış kadar karaciğere çok yavaş tuzlu su enjekte edilir. Çoklu enjeksiyonlar gerekebilir.
4. Ince delikli bir iğnesi (tipik bir insülin şırınga) ile donatılmış bir başka şırınga içine EM fiksatif çizin.
5. Zor ve renk tan hale gelinceye kadar karaciğere çok yavaş fiksatif enjekte edilir. Çoklu püskürtmes gerekebilir.
6. Keskin bir neşter kullanılarak 2 mm ³ blok - 1 içine sabit karaciğer kesin. 72 saat 4 ° C - 24 EM sabitleştirici kuluçkaya yatmaktadır. İkincil fiksasyon başlamadan önce 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kere yıkayın.

Taramalı Elektron Mikroskobu için 4. Hazırlık

1. Yıkama örnek 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kez. Lipidler düzeltmek için, sonrası 2 saat süreyle 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde% 2 osmiyum tetroksit numuneyi düzeltin.
   NOT: glutaraldehit ve osmiyum tetroksit çapraz reaksiyona ve SEM eserler üretmek olarak komple yıkama çok önemlidir.
2. Dehidrasyonu başlatma etanol artan konsantrasyonlarda örnekleri durulayın. 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde ilk durulama; % 70 etanol ile 5 dakika boyunca, sonra 3 kez; % 90 etanol ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın; % 100 etanol içinde 5 dakika için 2 defa yıkayın; ve son olarak% 100 etanol (moleküler elek) içinde 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
3. Örneklerinden her etanolü çıkarmak ve fumehood içinde ve heksametildisilazan (HMDS) ile değiştirin ve 10 dakika süre ile bırakın. Doku örneklerinden HMDS 'yi çıkarın ve buharlaşmasına izin verin.
   NOT: Bu nedenle son dehidrasyon aşaması için kullanmadan önce RT ulaşmak için izin yaparken soğuk HMDS oldukça higroskopik olduğunu.
4. İsteğe bağlı olarak, hemen örnekleri monte veya SEM mount hazır olana kadar bir kurutucu içine yerleştirin.

5. Montaj

NOT: Doğru örnek montaj SEM altında analiz için kullanılabilir açıkça belirlenen sinüzoidler sayısını en üst düzeye çıkaracaktır.

1. Metal SEM taslakları tabanını Etiket ve taslakları üstüne çift taraflı iletken karbon bandı uygulayın.
2. Sonraki SEM için en iyi sinüzoidlerin ile yüzeyi tanımlamak için diseksiyon mikroskop kullanılarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Saplama karbon bant yüzeyine yukarı o yüzeyi yerleştirin.
3. Çubuk örnekleri sıkıca saplama, numuneler artık serpme kaplama için hazırız.

NOT: Bir püskürtme kaplayıcı gerekçesiyle numune iletken metal (altın veya platin) ince bir film ile kaplanması örnek ve elektron ışını hasardan korur. Kaplama ise ilgi çok kalın yapıları gölgede olabilir.

1. Otomatik ince püskürtme kaplayıcıda vakum odasına yerleştirin taslakları, 45 saniye boyunca rotasyona modu ve otomatik püskürtme kaplama ayarlayın. Ancak altın da uygundur, ince ayrıntılarıyla için platin kaplama kullanın.
2. Monte karaciğer örneklerinin dış yüzeylerine karbon boya ince bir tabaka sürün kat değil sinüs yüzeyleri özen.
3. Örnekler platin ile kaplanır ve karbon boya kuruduktan sonra da SEM ile ilgili gözlem için hazırdır. Örnekler bir kurutucu içinde saklanabilir.

7. Tarama Elektron Mikroskobu Kullanımı

1. Yer taramalı elektron mikroskobu içine numune ve vakum mikroskop dönün. </ Li>
2. Düşük büyütmede başlanarak numunelerin görünüm için standart mikroskop çalışma prosedürleri kullanarak, giderek artan büyütme.
3. Mikroskop mesafe, nokta boyutunu ve astigmatizma çalışmak için uygun ayarlanır emin olun.
4. Tespit bütünlüğü için kontrol edin. LSEC boşluklar çoğunlukla ücretsiz ve 30 ölçüm fenestrasyonlar içeriyorsa - 250 nm çapında bu genellikle o numune hazırlama başarılı olmuştur işaret eder.
5. Sinüzoidlerinde boşlukların tamamen veya fenestrasyonlar yoksun iseniz numune hazırlama başarılı olmamıştır veya önemli bir patoloji yoktur. Bu durumda, çok ince bir jilet ile örnek dilim ve kesme yüzeyleri kaplanabilir ve başarılı bir şekilde sabit sinüzoidler için analiz edilmiştir.
6. Yaklaşık 15.000-20.000 × büyütme iyi fiksasyon ve fenestrasyonlar açıkça (görünür nerede genellikle en az 10 fenestrasyonlar içeren enkaz ücretsiz düz LSEC yüzeyleri seçin).
7. Karaciğer başına en az iki blok kullanılarak, blok farklı alanlarından, karaciğer başına en az 10 sinüzoidler görüntülerini kaydedin. 15.000 10 mikrografları Örnekleme - fenestrasyonlar ölçümü tüm karaciğer temsilcisi olmak için hayvan başına 20.000 × büyütme genellikle yeterlidir.

8. Analiz

NOT: NIH ücretsiz indirebilirsiniz ImageJ yazılım fenestrasyonu çap ve frekans (ölçmek için kullanılmaktadır www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Açık Resim J ve resim (Ekran shot 1) gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın.
2. Fenestre ve defenestrated alanlar dahil LSEC tüm düz alanı etrafında çokgen ImageJ aracını iz kullanma. Bu yanlış gözenekliliği şişirmek gibi sadece elek plakaları iz yok. Obscuri olabilir hücre yüzeyi üzerinde artıkların herhangi bir büyük parçalar hariçng fenestrasyonlar.
3. , Fenestrasyonu çapını ölçmek satırı aracını seçerek her fenestrasyon en uzun çapı boyunca bir çizgi takip ve çizgi ölçmek için "m" basın ve "D" kalıcı resmin üzerine çizgi çizmek (berabere). Bu çizgi fenestrasyonu çapı olarak tanımlanır. hat uzunluğu artık ImageJ sonuçları kutunun (Ekran shot 2) satışa sunulacak.
4. Daha büyük 250 nm üzerindeki LSEC sitoplazmada delikler, hem de fenestrasyonlar tüm boşlukları ölçün. Boşluklar genellikle boşluklar da hastalık ve toksisite sonucu oluşabilir, ancak kötü perfüzyon veya fiksasyon, yansıtan eserler bulunmaktadır. boşluklar verileri daha sonra analiz fenestrasyon parametrelerinin hesaplanması dışında tutulacaktır.
5. Dairesel olmayan boşluklar alan boşlukları etrafında izleme ve ImageJ kendi alanını hesaplayarak hesaplanmalıdır.
6. Furthe için bir EXCEL elektronik tabloya ImageJ sonuçları kutusundan verileri yapıştırınr analizi.

9. Hesaplamalar

1. (Boşluklar ≥ 250 nm boşluklar, dahil değil) Tüm fenestrasyonu çapları ortalama fenestrasyon çapı = ortalama.
2. R, yarıçap, tek tek fenestrasyon çapı (r = D / 2), aşağıdakileri içeren olmayan boşluklar hesaplanır fenestrasyon alan = πr ^2.
3. Gözeneklilik (%) = (Σ (πr ²⁾ / analiz edilen toplam alan - boşlukların Σ (alan =)) ⁽² um)) x 100.
4. Fenestrasyonu frekansı = fenestrasyonlar toplam sayısı / (toplam alan (boşlukların alan) (mikron ^2)-Σ analiz.

Fenestrasyonlu Verilerin 10. Sunumu

NOT: fenestrasyonu verilerinin ölçümü de dahil olmak üzere Mümkün yayınlar aşağıdaki bilgileri içermelidir

1. Kullanılan sınır çapları genellikle (fenestrasyonlar tanımlamak ne doğrulayan bir açıklama ile fenestrasyon çapı,fenestrasyonu frekans (sayı / um ²⁾ ve porozite (%),) nm 50-250 arası.
2. Boşluklar analizi, fenestrasyon çapı ve ciğer, bloklar, görüntü ve fenestrasyonlar sayısının frekans dağılımı grafiği analize dahil edilmelidir dahil edilip onaylayan bir açıklama.

Taramalı elektron mikroskopisi işlemiyle düşük büyütme ilk görselleştirme çok büyük karaciğer damarları ve sinüzoidlerde (Şekil 1A) gözlemlemek için yeterince büyük bir açık alan ile, karaciğer numunesinin düz bir yüzey ortaya koyar. Montaj saplama doğru karaciğer blok yerleştirme sağlanması Bu nedenle (Şekil 1B) kaçınılmalıdır sinüzoidlerin ve karaciğer Glisson kapsülü net görüntüler elde etmek için gereklidir. Büyütme artan karaciğer yoğun damar yakın denetlenmesine izin verir ve damarları (Şekil 1C) bölmek hepatositlerin tek bir hücre plakaları ortaya koymaktadır. Kötü görüntü kalitesi, kan hücreleri ve enkaz karaciğer sonuçlarının Kötü sabitleme karaciğer (Şekil 1D) görünümünü belirsiz.

Bundan başka büyütme artan LSEC fenestrasyon (Şekil 2A) gözlenmesini sağlar. Bu sinüzoidlerinde corr olması esastır ectly tespit - hepatositlerin plakaları, bazı durumlarda bu tür oryantasyon (Şekil 2B) yardımcı Kanalikülleri safra olarak kan damarları ancak özellikleri gibi görünebilir. Yüksek perfüzyon basıncı, LSEC elek levha birleşmesine sebep olduğu düşünülmektedir endotelyumda büyük boşluklar gibi kusurlara neden olabilir. Bunlar kolayca SEM (Şekil 2C) altında belirlenmiştir. Çekirdeklerin üzerinde doğrudan hücre zarı kaçınmak fenestrasyon yoğunluğu ve gözeneklilik hesaplamalar (Şekil 2D) doğruluğu ile yardımcı olacaktır.

ImageJ ile LSEC analizi LSEC fenestrasyon çapı, yoğunluğu ve frekansı (Şekil 3A) ölçümü sağlar. Bu boyutlar fenestrasyonlar ampirik ölçümünü sağlar ve yaşlanma, hastalık, toksinler ya da tedavilerin (Şekil 3B) ile uyarılan değişiklikleri ölçümleri sağlar.

files / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
SEM ile karaciğer görselleştirme Şekil 1.. (B) Glisson kapsül sinüzoidler tüm ayrıntıları kapsar; (C) Karaciğerin yoğun damarsal ve (A) SEM altında ilk muayene karaciğer sinüzoidlerde ve portal yolu ve merkezi venüllerden de dahil olmak üzere geniş damarları ortaya gemiler arasında yalan hepatositlerin tek hücre plakaları;. (D) daraltılmış sinüzoidler Yoksul tespit sonuçları ve ultrastrüktürel eserlerin geliştirilmesi , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Karaciğer ultrastrüktür. (A) LSEC fenestrasyonlar kolayca görmek vardır n, iyi sabit bir dokuda (B) iyi korunmuş bir safra kanalcıklarının bir hepatosit yüzeyi (C) yüksek perfüzyon basıncının neden olduğu endotelyumda büyük boşluklar, (d) LSEC çekirdekleri oklarla yüzeyinin altında çıkıntı belirtilmedikçe İnce LSEC ve gözeneklilik analizi alanında dahil edilmemelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ImageJ ile LSEC Şekil 3. analizi. (B) Görüntü J analizinden elde edilen verilerle oluşturulan bir frekans histogramı (A) çokgen alet ölçümü ve çizgi aracı fenestrasyonu çapını ölçmek için kullanılır genel alanın ölçümünü sağlar.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1.

Yoksul numune ve görüntü kalitesi için Tablo 2. Sorun giderme ipuçları.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.