Yüksek Çözünürlüklü EEG Kayıtlar kullanarak Odak Epilepsi Preklinik Rat Modelleri Beyin Kaynak Görüntüleme

Fokal epilepsili hastalarda EEG'den gözlenen interiktal epileptiform deşarjların (IED'ler) epileptogenezin yararlı belirteçlerini oluşturduğu gösterilmiştir³. Bu IED'lerin kaynaklandığı beynin içindeki bölgeler, tahriş edici bölgeler olarak adlandırılır ve pratikte EEG kayıtlarına dayanarak lokalize edilebilir⁴. Klinik öncesi modeller, bu tahriş edici bölgeler ile nöbet başlangıcının altında yatan gerçek bölgeler arasındaki korelasyonları bulmak için gereklidir. Bununla birlikte, insan kafa derisine kıyasla kafanın küçük yüzey alanı nedeniyle küçük hayvanlardan EEG kaydetmek zordur. Sıçanlarda kronik kayıt için invaziv yöntemler^{kullanılabilse de 5, 6, şu} anda anesteziye ihtiyaç duymadan akut koşullar altında kemirgenler üzerinde geleneksel EEG kayıtları elde etmek için teknikler mevcut değildir.

Bu sorunu çözmek için, kemirgenlerden gelen 32 kanallı EEG verilerini noninvaziv olarak kaydetmemizi sağlayan patentli bir EEG mini kapağı² uyguluyoruz. Bu çalışmada, IED sıklığını korumak için bir analjezik ihtiyacı hakkında da kanıtlar sunuyoruz. Bu nedenle, EEG mini kapağının fiksasyonu izofluran altında yapılmasına rağmen, EEG kayıtları sadece sedasyon (deksdomitor) altında sıçanlarla elde ^edildi7. Bu çalışmada önerilen yöntem, fokal epilepsinin herhangi bir preklinik sıçan modelinde kullanılabilir. Bu metodolojinin yeteneklerini göstermek için, fokal kortikal displazide (FCD) irritatif ve nöbet başlangıçlı bölgeler arasındaki korelasyonları anlamak için uyguluyoruz. Bu amaçla, Wistar sıçanlarında FCD^8'in "çift vuruşlu" bir modelini kullanıyoruz.

Beyin kaynağı analizi yapmak için: a) EEG ham verilerinden IED'leri doğru bir şekilde çıkarmak ve b) bireysel hayvan kafası için bir hacim iletken modeli elde etmek gerekir. Pratik bir hacim iletkeni modeli oluşturmak için, 31 Wistar sıçanının⁹ T2 görüntülerinin doğrusal olmayan kaydı yoluyla elde edilen ve ortalama yoğunluk/şekil görüntülerini içeren bir in vivo sıçan MRI atlası kullanıyoruz. Oluşturulan hacim iletkeni için ileri model, sınır eleman yöntemi (BEM)¹⁰ ile hesaplandı. İnsanlarda olduğu gibi, iki tipik IED modeli (keskin dalgalar ve sivri uçlar) tespit edildi ve akıllı bir özellik çıkarma, özellik seçimi ve sınıflandırma süreci yoluyla farklı kümelere ayrıldı¹¹. Bu alt sınıflandırılmış sinyaller, farklı tahriş edici bölge türleriyle ilişkili beyin kaynağı lokalizasyonlarını tahmin etmek için kullanılır. Kaynak analizi adımlarını, Brainstorm¹² adlı iyi bilinen bir kamu yazılımı kullanarak sunuyoruz. Her bir IED alt tipi için EEG kaynak lokalizasyonları ve nöbet başlangıç zaman dilimleri, Beyin Fırtınası'nda bulunan standartlaştırılmış düşük çözünürlüklü beyin elektromanyetik tomografisi (sLORETA)¹³ kullanılarak gerçekleştirildi.

Etik bildirimi: Bütün deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Florida Uluslararası Üniversitesi (IACUC) (IACUC 13-004) tarafından kurulan politikalar takip gerçekleştirilir.

1. EEG Kayıtlar

1. EEG mini kapağın hazırlanması
   1. EEG mini kap% 0.2 klorid ile damıtılmış su içinde en az 12 saat bir elektrot uçları bırakın. Damıtılmış su içinde hafifçe EEG mini kapağı durulayın. Kapağı ve hava elektrotlar kurutun.
   2. 2 hacim oranında% 0.9 NaCl çözeltisi ile karıştırın EEG elektrot macunu: 1. elektrot içinde ve cilt üzerinde elektrot macunu görselleştirmek için yardımcı olacaktır metilen mavisinin bir damla ekleyin. Bir şırınga karışık macunu alın. Şırınga içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıklarını tanıtan olmadan onları doldurarak, 32 elektrotların her birine jel enjekte edilir. Bu alt yerine üstten enjekte etmek önerilir. Bu iyi bir ACCE sağlarHer elektrot ss ve taşan jel olasılığını azaltır.
   3. EEG ve fizyolojik kayıt sistemi açın ve kullanımda bilgisayara gelen kayıt yazılımı açın.
2. Hayvan hazırlama ve anestezi
   NOT: Kronik epilepsi Wistar sıçanlarda FCD ⁸ için bir protokol kullanılarak hazırlandı. (- 400 gr 8 haftalık, 300) EEG kayıt Wistar sıçan yürütülmüştür.
   1. Bir deney sayfasında sıçan ağırlığını kaydedin. Sedatif doz (dexdomitor 0.25 mg / kg) hesaplamak için bu bilgileri kullanın. % 5 izofluran ve% 100 oksijen (14.7 psi / dakika 1 L) ile farede anestezi neden.
   2. Sonra% 2 izofluran azaltmak ve EEG mini kapağın tamamı ayarı sırasında korumak, sıçan başını kırpın. Sıçan refleksleri (ayak-tutam) olup olmadığını kontrol edin. Kulak çubukları kullanarak kulak kanalları sabitleyerek stereotaksik aparat bir ısıtma yastığı sıçan yerleştirin. Emin anestezi burun konisi güvenli olduğundan emin olun.
   3. ApHer göze yağ oftalmik merhem kat.
   4. Bir jilet kullanarak sıçan kafası ve kulakları ekstra saç tıraş. Tıraş sırasında herhangi bir kanama kaçının.
      NOT: EEG kayıtları gürültü üretecek cilt üzerinde sola herhangi bir saç. Kan damarları uyarmak ve cildi yağdan arındırmak için% 90 izopropil alkol ile sıçan cildi ovmak.
   5. Kafa derisi üzerinde bir tuzlu çubukla yerleştirin ve EEG mini kapak yerleştirilmesi için hazır olana kadar iyi bir cilt iletkenliği tutmak için tamamen örtün.
   6. Sıcaklık, solunum ve üç kurşun elektrokardiyogram probları bağlayın. Sıcaklığı bir rektal prob ile ölçülen dikkat ediniz. Sürekli kayıt işlemleri sırasında sıçan fizyolojisini izlemek. Dakikada 60 nefes ve kalp hızı yaklaşık 350 olduğunu - - normal sıcaklık 37 ° C olduğundan emin olun, solunum aralığı 30'dur dakikada 450 atım.
3. Kayıt prosedürleri
   1. Sıçan kafa derisi üzerinde tuzlu bezi çıkarın ve hazırlanan EEG mini c yerleştirinkendi cilt üzerinde ap. Lastik bantlar ile mini kapağı sabitleyin. Kulaklar ve boyun arasındaki kafa derisinin arka kısmında bir lastik genellikle gözler önüne kafa derisi ön tarafında bant ve başka grup yerleştirin. Normal solunumu kolaylaştırmak için boyun altında plastik koruyucusu kullanın.
   2. Hem zemin ve referans elektrotlar yüksek iletkenlik elektrot macun tabakası koyun. İlgili kulak yerleştirin.
      NOT: referans elektrotu muhtemelen diğer konumlarda yerleştirilebilir.
   3. Kuvvetlendiricilere EEG mini kapağı takın ve elektrot empedansı tezgah önizlemesini gözlemlemek. Tüm elektrotların performansını kontrol edin. 30 kohm - yüksek kaliteli kayıt için, empedans değeri 5 aralığında olduğundan emin olun. Her türlü gürültülü elektrotlar varsa, elektrodun üstünden daha jel enjekte hafifçe kafa derisi doğru iskele içine taşıyarak veya biri tarafından kafa derisi daha iyi temas sağlamak.
   4. Dexdomitor yönetme (0.25 mg / kg) intraperitoneally ve hemen% 0 izofluran oranını azaltmak. Solunum hızı 30 içinde değilse - dakika aralığında başına 60 nefesler nazikçe izofluran hızını artırarak başlayabilirsiniz. % 1 izofluran değerini aşmayın. Izofluran ve dexdomitor karışımı bir durumu kritik hayvanları istemi çünkü dikkatle bu adımı izleyin.
      NOT: dexdomitor bunu yapmaz fokal epilepsi klinik öncesi modelde, izofluran, IED etkiler. Izofluran altında Konular yani zayıf epileptojenik özelliği var, nispeten daha az IED diğer koşullara ^7,14 oranla tespit edilebilir. dexdomitor doz yaklaşık 2 saat süre ile etkilidir. Bu nedenle, bunun etkisi için zaman kazanmak için, preparat izofluran altında gerçekleştirilmiştir.
   5. EEG kayıtları yürütün. Kayıttan sonra, kaldırılır EEG mini kap önce içlerinde bir renk kalem sokarak cildin üstünde EEG mini kap üç uzanan çevrelerinin pozisyonlarını işaretleyin. MRG işbirliği için önemli noktalara olarak bunları kullanın-Kayıt. Yerler ile sıçan kafasının fotoğrafını çekin. Geri kafes içinde sıçan yerleştirin ve dexdomitor en etkisinden tam iyileşme kadar izler.
      NOT: Bu deneyde, kırmızı renk (yeşil rakibin renk) elektrot pozisyonları (yeşil) ayırt etmek için kullanılmıştır. Ancak, küçük kanama noktalar deride gözlenir, diğer renkler (mor / yeşil) kullanılması tavsiye edilir.

Şekil 1. Belirli bir sıçan yerleştirilen EEG mini kap bir resmi.

Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Beyin Kaynak Görüntüleme

1. IED sınıflandırma
   NOT: IED tespiti ve sınıflandırma dayalı MATLAB kendi geliştirdiği kodları kullanarak yapılırBir önceki çalışmada ^15. Bu yazılım istek satışa sunulacak.
   1. Görsel EEG izleyiciler inceleyerek gürültülü kanallar atın. Bir şablon ve korelasyon analizine dayalı periyodik dalga çıkarma, otomatik bir yöntem kullanılarak EKG eserler kaldırın.
      NOT: Genellikle, EEG kaydedilen deneyci empedans değerlerine dayalı gözlenen kötü kanal yazılı bilgi deneysel sayfasını paylaşır. EKG eserler çıkarmak için Yazılım isteği ile de satışa sunulacak.
      
      Şekil 2. IED'lerin farklı gösteren EEG iz bir örnek. Kırmızı kutu IED'lerin bir türünü gösterir.
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
      
   2. 150 Hz ve bir çentik - 3 kesim frekansları ile bir bant geçiren filtre uygulahat frekansı (genel olarak 60 Hz ve bazı ülkelerde 50 Hz) bileşeni çevrimdışı kaldırmak için filtre.
   3. IED (sivri ve keskin dalgalar) iki tür algılar. 70 ms ve 70 - - sırasıyla süresi 200 ms kramponları ve keskin dalgalar 20 büyük elektrik olayları oluşturmaktadır. Bu nedenle, ilgili bir bant geçiren filtre (15 kesim frekansları - sivri için 50 Hz ve 5 - keskin dalgalar için 15 Hz) uygulandıktan sonra, IED genlik ¹⁵ eşik dayalı tespit edilir.
      NOT: eşikleri otomatik multiunit aktivite ¹⁵ önceki çalışmada önerildiği gibi 4σ ayarlanır. {| Süzüldü sinyal | / 0,6745} Burada σ σ = medyan, bant geçiş filtreli sinyalin bir tahmini standart sapmadır.
   4. Farklı kümeler halinde sivri ve keskin dalgalar Alt sınıflandırır. Farklı sivri ve keskin dalgalar ayırt edici özellikleri ¹⁵ dalgacık dönüşümü kullanılarak çıkartılan edilir. Onlar alt-sınıflandırılmıştır k-araçları kullanarak çoklu kümeler halinde,ve optimal küme sayısı k siluet kullanılarak belirlenir.
   5. Aynı küme içinde alt sınıflandırılmış sinyalleri ortalama. Her IED alt türü için ortalama EEG sinyalleri beyin kaynak analizi için kullanılacak.
2. Hacim iletken modeli
   NOT: Aşağıdaki bölümlerde için, açık kaynak yazılım, beyin fırtınası ^12, Wistar sıçanlar ⁹ MRG atlas ile kullanılacaktır. Ancak, bireysel sıçan MR da varsa ses iletken modeli oluşturmak için de kullanılabilir. MR atlas ⁹ indirilebilir http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/ . Bu web sitesi "Wistar Rat MR Atlası" bölümünde Nifti biçimi olarak atlas sağlar ve kayıttan sonra erişilebilir olabilir. Ön işlem için gerekli olan yazılım da bu web sitesinde bulunabilir.
   1. Yazılımın ¹² Girdi MR ve beyin yüzeyi.
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   2. Varsayılan ayarı ile kafasının yüzeyini oluşturun.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   3. Kurşun alan hesaplama ¹² MR dayalı kafa derisi ve iç / dış yüzeylerini kafatası oluşturun.
      NOT: noktaların çözünürlüğü tahmini kaynağının doğruluğunu, ancak yüksek hesaplama karmaşıklığı içinde köşeler sonuçların çok sayıda etkiler. Her katmanın köşe Tavsiye sayıda adil hesaplama karmaşıklığı ile kabul edilebilir doğruluk için 642 olduğunu. Kafatasının kalınlığı MRI ile ilgili kontrol ve MR atlas durumunda, yaklaşık olarak 1 m olabilirm. Her yüzey oluşturulur için, yazılımdaki yukarıdaki değerler ekleyerek üçgen yüz tepe gelen sonra kafesleri.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   4. Görselleştirme seçeneğini kullanarak MRI ile ilgili her yüzeyin yönünü ve konumunu kontrol edin. Herhangi yüzeyler eş kayıtlı ¹² değilse, buna göre değiştirin.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   5. 1.3.5 edinilen sıçan kafası resmi kullanma. MRG 3 yerlerinden (R1, R2 ve R3) konumlarını ko-kayıt. G referans gibi önemli noktalara ızgara noktalarını kullanınElektrotlar skafold (Şekil 3B) sabit olarak elektrot konumları enerate.
      
      Şekil 3. (A) Rat kafa resmi koordinat sistemi ile elektrot konumları ve (b) EEG mini kapak diyagramı elde etmek için kullanılır. (A) 'da kırmızı nokta 1.3.5 belirtilen işaretlerini göstermektedir. bu, (B) 'de, kırmızı numaralarına karşılık gelir. Ayrıca, yeşil işaretleri (A), 32 elektrot konumları tasvir ve (B) 'de, mavi numaralarına karşılık gelir.
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
      
   6. 3 yerlerinden dayalı N × 3 elektrot pozisyon matrisi oluşturun. Burada, N (N = 32), kanalların sayısıdır ve sütun gelen x, y ve z koordinat değerleri temsil eder.
      NOT: EEG mini kapak sert bir iskele olduğunu. 3 referans ızgaraları (R1, R2 ve R3) elde edildikten sonra, bu nedenle, elektrot konumu otomatik olarak ayarlanır. Kullanıcı yalnızca mini kapak uygun kafa derisi üzerine yansıtılır şekilde Z-değerleri yeniden tanımlamak gerekir. Şekil 3B mavi numaraları gösterildiği gibi N noktası ızgaraları ardışık numaralı edilebilir. EEG mini kap standart skafold (Malzeme Tablo) ticari olarak mevcuttur. eş-kayıt için yazılım da topluma mevcuttur.
   7. Girdi oluşturulan kanal dosyası.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   8. Ekran ve tüm elektrotların yerini onaylayın. Herhangi bir yanlış elektrotların ¹² değiştirin. elektro için son koordinat sistemide pozisyonları yukarıda belirtilen yüzeyler için kullanılan koordinat sistemi ile aynı olmalıdır.
      NOT: ". MR / yüzey kaydı kontrol MRG kaydı " oluşturulan yüzeyler görsel olarak görselleştirme seçeneği kullanarak bir MR kontrol edilebilir Ve sonra, bir seçilen yüzey MR sarı çizgi olarak görüntülenir. Buna ek olarak, 3 görülecek ve 32 elektrot konumları toolbox en seçeneğini seçerek MR görüntülenebilir "Ekran Sensörler MRG Görüntüleyici." Konumları görsel (sıçan göz ve kulak yerle ilgili dayalı dağılımları karşılaştırılarak kontrol edilebilir Şekil 4).
      
      Eş-Kayıtlı beyin yüzeyinin (sarı hat), (B) hizalanmış 32 elektrot ve 3 noktalarına (kırmızı noktalar) ile oluşturulan birim iletken modeli, ve co-kayıt ile (C) MRG atlas ile Şekil 4. (A) MR atlas ref ferans ızgara R1.
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Beyin Kaynak Görüntüleme
   1. Kurşun alan matrisi ¹³ hesaplayın. Girdi 1 olarak deri, kafatası ve beyin oranını karşılayan iletkenlik değerleri: 1/80: 1. hacim iletken modeli ve 2.2 oluşturulan elektrot pozisyonları dayalı kurşun alan matrisi edinin.
      NOT: Araç kutusu ¹² BEM ¹⁰ hesaplamak için diğer yazılımlar ile bir arayüz sunuyor. Bu nedenle, yalnızca iletkenlik değerlerinin girdi olarak gereklidir.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   2. Girdi 2.1.4 saklanan her IED alt türü için ortalama EEG sinyalleri.
      "Src =" / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg "/>
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   3. Bilgisayarlı kurşun alan matris ve giriş EEG sinyalleri dayalı sLORETA çözümünü ¹³ edinin. Kaynak tahmin yöntemi seçeneği seçerek, ters çözüm ¹² elde edilebilir.
      
      Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   4. Tahmini kaynakları çizilir.

Bir kez tüm işlemler düzgün şekilde tamamlanmasını, tahmini kaynaklar klinik öncesi model beyin yüzeyinde görülebilir. 5 çivilerin (üstte) ve IED keskin dalgaları (alt) belirli bir alt tipi tahmin kaynaklar göstermektedir. Buna ek olarak, 6 görüntüler Şekil nasıl bir nöbet kurulması sırasında ardışık zaman dilimlerinde kaynak dağılımı değişir. Bu sonuçlar fokal epilepsili fareler üzerinde yüksek çözünürlüklü EEG kayıt ve kaydedilen EEG kullanarak kaynak analizi yapmak için önerilen yöntemlerin yeteneği desteklemektedir.

Sivri farklı kümelere göre (üstte) ve keskin dalgalar (altta) ile IED Şekil 5. Tahmini beyin kaynak yerleri. (A) Zaman serisi, (B) EEG topografya ve (C) ekşi akım kortikalces. Değerlendirme kırmızı bir dikey çizgi (A) ile işaretli olan belirli bir zamanda gerçekleştirilir.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Nöbet sırasında Şekil 6. Tahmini beyin kaynakları. Zaman anları kırmızı dikey çizgiler olarak işaretlenir.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Çıkar çatışması ilan etti.