Yöntem makalesi

Fare Naif CD4 + T Hücre İzolasyonu ve In vitro T hücre alt içine Farklılaşma

DOI:

10.3791/52739

⸱

16 Nisan 2015

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur. Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antijen deneyimsiz (naif) CD4+ T hücreleri, MHC sınıf II'de sunulan akraba antijenin T hücresi reseptörü (TCR) tanınması sırasında efektör alt kümelerine genişleme ve farklılaşma geçirir. TCR aktivasyonu sırasında çevrede bulunan sitokin sinyalleri, saf bir CD4 + T hücresinin efektör kaderini belirlemede önemli bir faktördür. Naif T hücresi aktivasyonu sırasında sitokin ortamı karmaşık olabilse ve in vivo olarak hem gereksiz hem de karşıt sinyaller içerebilse de, naif CD4 + T hücresi aktivasyonu sırasında in vitro olarak çeşitli sitokin kombinasyonlarının eklenmesi, ayırt edici sitokin ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu ile efektör T yardımcı soylarının kurulmasını kolayca teşvik edebilir. Bu tür farklılaşma deneyleri, belirli CD4 + T yardımcı alt kümelerinin gelişimini teşvik ettiğine veya engellediğine inanılan hedeflerin değerlendirilmesi için yaygın olarak ilk adım olarak kullanılır. Farklılaşma işlemi sırasında sinyal agonistleri, antagonistler veya diğer sitokinler gibi aracıların eklenmesi, belirli bir hedefin T hücresi farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir. Burada, saf T hücrelerinin fareden izolasyonu için temel bir protokolü ve saf hücreleri in vitro olarak çeşitli T yardımcı efektör soylarına polarize etmek için gerekli sonraki adımları açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

farklı soy veya CD4 + T helper altkümelerinden kavramı (Th) hücreleri 20. yüzyılın ikinci yarısında 1 beri civarında olmuştur. Hücre çoğalması ve efektör Th hücreleri içinde nihai farklılaşmasının birkaç tur birlikte uyaran sinyallerin sonuçlar mevcudiyetinde aynı kökenli antijenin tanınması. Bu işlem sırasında oluşan Th hücre tipi aktivasyonu 2 sırasında, bu sitokin ortama bağlıdır. Başlangıçta, naif Th hücreleri T hücre reseptörü (TCR) aktivasyonu, birlikte uyaran CD28 ligasyonu ve sitokin sinyalizasyon aşağıdaki 2 farklı soy içine polarize düşünüldü. Tip 1 yardımcı hücreleri (TH1) olan IFNy sitokin, bunların etki edici üretiminin yanı sıra farklılaştırma işlemi 3,4; IL-12 sinyalleme duyulan gereksinimi ile karakterize edilir. Sonunda farklılaşmış Th1 hücreleri en belirgin b karakterize bir genetik profile sahip olduğu keşfedildiy Th1 genetik programın 5 ana regülatörü olarak kabul edilir T kutusu aile transkripsiyon faktörü ifadesi, Tbx21 (T-bahis). Bundan başka, IL-12, hem IFNy gibi T bahis ifade 6,7 teşvik edebilir. Immün yanıt olarak, Th1 hücreleri, hücre içi patojenler hem de oto-bağışıklık iltihap kuvvetli promotörler karşı konakçı savunması için önemlidir. Bunun aksine, tip 2 yardımcı hücreleri (Th2) kendi gelişimi için IL-4 ve IL-4, IL-5 de dahil olmak üzere, bunların etki edici sitokinler ve IL-13 gerektiren, B hücre yanıtları tahrik etmek için önemlidir ve alerji 8-patojen, 9. Th1 hücrelerinin benzer, Th2 hücreleri kendi ana transkripsiyonel regülatör ifade etmek bulundu, GATA'nın-3 10,11 olarak adlandırılan. İlginçtir, polarize sitokinlerin varlığı ve belirli bir Th soyun nesil sadece belirli bir alt kümesi Th bir bağışıklık yeniden sırasında baskın hale gelebilir düşündüren, başkalarının 2,12 gelişimine antagonistiktiryanıtlarının yokluğu.

Th1 ve Th2 soylarının belirlenmesi için, daha fazla çalışma son folikül yardımcı (TFH), (Th9), IL-9-üreten ve IL-22 üreten (Th22) dahil (T yardımcı hücrelerinin daha bile eşsiz bir alt küme, gösterdi ), 13 gözden. In vitro olarak farklılaşma deneylerin amaçları doğrultusunda, bu protokol regülatör T hücreleri (regülatör) ve IL-17 üreten CD4 + T hücreleri (Th17) olarak adlandırılan, yalnızca iki ek Th alt kümelerini odaklanacaktır. CD25 + regülatör T hücrelerinin timüsteki doğal (nTreg) oluşabilir; naif Th hücreleri de (14,15 gözden) çevre düzenleyici olmak üzere (iTreg) bağlı olabilir. Tregs Her iki tür karakteristik transkripsiyon faktörü, çözünür anti-inflamatuar aracıların üretimini, IL-2, tüketimi ve hücre temas yoluyla mekanizmaları 14,15 içerir, bunların etki edici bastırma mekanizmaları için kritik öneme sahiptir forkhead kutu P3 (Foxp3) olarak adlandırılan ifade eder. FoxP eksikliğiCiddi, çoklu organ otoimün bozukluğunun 3 ekspresyonu, bağışıklık düzensizliği, poliendokrinopati, enteropati olarak adlandırılan, enflamasyon çözme ve kendi çevresel tolerans düzenlemede, bu Th alt-grubun önemli bir rol gösteren X-bağlantılı sendromu (IPEX), 16 antijenleri. İn vitro olarak, saf CD4 + T yardımcı hücreleri, Foxp3 yukarı doğru regüle ve IL-2 ve 14,15, TGF-β uyarılan regülatör programına kararlı hale gelir. (17,18 gözden) sadece sitokin üretimini göz önüne alındığında, özellikle CD4 + T hücre soyları içinde önemli bir plastisite orta olabilir. Ancak, in vitro farklılaşma protokolleri amacıyla, benzersiz bir soy olarak her alt kümesi görüşecekler.

Son zamanlarda, IL-17 sitokin üreten, Th17 hücrelerinin bir alt kümesi, otoimmün iltihabı 19-21 sırasında özellikle patojenik pro-iltihap fonksiyonları ile benzersiz bir soy olarak tanımlanmıştır. Th17 hücreleri benzersiz bir transkripsiyon faktörü ifade, Th17 genetik programı 22 koordinatları olarak adlandırılan retinoid ilgili yetim reseptör gama t (RORγt). TGFβ RORγt indüksiyonu ile Th17 soyunun üretimi için önemlidir. Ancak, TGFβ sinyal etkisi sadece (12 gözden), IL-6 ile sinerji üzerine Th17 taahhüdünü neden olduğuna inanılmaktadır. Daha ileri çalışmalar için diğer pozitif IL-1β de dahil olmak üzere, Th17 kararlılığını düzenleyen sinyallerin, artan sodyum ve TLR çeşitli 23-26 sinyal olduğunu göstermiştir. Diğer raporlar, in vivo olarak, patojenik Th17 hücreleri aslında TGFβ sinyal bypass olanlardır ve bunun yerine farklılaşma 27, IL-1, IL-6 ve IL-23 arasında bir kombinasyonuna bağlıdır olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu nedenle, Th17 hücre sinyal yollarının çeşitli türetilebilir; Th17 soy bağlılığı için bu protokolün amaçları için, yaygın olarak kullanılan (TGFβ ve IL-6) yolusunulacaktır.

Tüm efektör soyları için aşağıda tarif edilen farklılaşma protokolleri tüm deney süresi boyunca TCR ve CD28 için uyaranı sabit antikor dayanır. Bununla birlikte, diğer göstermiştir ki antijen sunan hücreler 28 veya çapraz bağlama, anti-CD3 ve Hamster antikoru anti-CD28 antikorları, 2 gün 29 aynı zamanda çeşitli Th alt-üretilmesini indükleme son derece etkili araçlardır ile TCR aktivasyonu. Burada sunulan protokol Th17 hücreleri 31 ikincil lenfoid organlara 30 kemirgen CD4 + T hücreleri izole ve üretmek için daha önce bildirilen yöntemler üzerine inşa. Önemli bir farklılık, bu protokol, lenfoid dokulardan naif CD4 + T hücreleri izole etmek için bir hücre ayıklayıcısıyla kullanımına dayanır olmasıdır. Ancak, birçok şirket artık gereksinimi f atlamak mümkün olabilir ki, naif CD4 + T hücreleri için zenginleştirebilirsiniz hızlı ayırma kitleri teklifveya sıralama deneye bağlı olarak. yöntemler ve bu protokolde sunulan reaktifler rutin kullanımı ve en etkili bulmak ne. Ancak, alternatif reaktifler ve metodolojiler aşağıda sunulan adımları birçok mevcut olduğunu akılda tutmak ve onların amaçları için en iyi çalışacaktır belirlemek için bireysel laboratuvara kadar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği dairesince onaylı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol için kullanılan (NCI satın alınmıştır), C57BL / 6 fareleri, spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi ve her hayvan deneyleri Tıp Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak testi gerçekleştirildi ve Bilim.

Araçların, Sarf Malzemeleri, ve Reaktifler 1. Hazırlık

  1. Anti-CD3 ve anti-CD28 ile kaplayın 48 kuyucuklu veya 24-yuvalı plakalar (Tablo 1) steril PBS, kapak ve parafilm sarın buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için, ve daha sonra, T bir gün önce cı 4 ° C'de O / N kuluçkalanması hücre izolasyonu. 37 o C de Alternatif, kat kuyular 1 saat 0.5-1 ml 1 ug / ml anti-CD3 ve anti-CD28 hem de kaplanarak Th0 Th1, Th2 ve iTreg şartları yerinetal hacmi (48 çukurlu plaka) eritin. Th17 için, tipik haliyle kaplama, anti-CD3 1 ug / ml'de ml anti-CD28 2 ug / ml'de.
    NOT: Bu daha yüksek bir anti-CD3 konsantrasyonu Th17 üretimi için en uygun süre daha düşük bir anti-CD3 konsantrasyonu, Th1, Th2 ve iTreg üretimi için uygun olduğunu bulduk. Bu nedenle, anti-CD3 ve anti-CD28 konsantrasyonları titre ve her laboratuvar (Tablo 2) için optimize edilmelidir.
  2. Otoklav veya dezenfektan çözeltisi ile diseksiyon araçları (makas ve forseps) bir dizi sterilize. Bir tüp veya% 70 etanol içeren küçük beher disseksiyonlarında arasındaki araçların hızlı sterilizasyon için gerekli olacaktır. Son olarak,% 70 etanol ihtiva eden bir sprey şişesi diseksiyon önce fare yüzey sterilize etmek için gerekli olacaktır.
  3. Alüminyum folyo düz strafor parçası veya Corkboard sararak bir diseksiyon yüzey hazırlayın. Kesme veya iğne yerine hayvan sabitlemek için kullanılır.
  4. Ti toplanması için yemekler ya da tabak hazırlayınssues. Havuzu dokular halinde, 3 ml ihtiva eden ayrı bir 60 mm tabaklar steril PBS + dalak ve lenf düğümü dokular için FBS (PBS +) yeterlidir% 1. Tek tek farelerden tutmak dokular ayrı ise, kuyulara, arzu edilen sayıda PBS + 'nın bir 24-çukurlu plaka ihtiva eden 1 ml hazırlar.
  5. Kullanmadan önce, hücre kültürü ve ön sıcak için tam RPMI ortamı hazırlanması (Tablo 1).
    NOT: Biz rutin RPMI kullanmak ancak IMDM'de ve DMEM gibi diğer medya eşit derecede etkilidir ya da laboratuarda deney ve bağlı üstün olabilir.
  6. Naylon kareler sterilize etmek için bir 120 um gözenek büyüklüğü ve otoklav ile örgü Kesme 2x2 sm (Tablo 1).
  7. İsteğe bağlı: CD4 + hücre zenginleştirme öncesi sıcak koşma için autoMACS olarak sisteme sıralama yüksek hızlı manyetik hücre kullanarak ve makineye zarar görmesini önlemek için 37 o C su banyosunda tamponlar durulama ise.
  8. Not: Zenginleştirme ayırma verimi artırmak ve zaman ayırma azaltmak için tavsiye edilir.
  9. Tümhazırlama aşamaları, diseksiyon için hariç olmak üzere, bir steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır.

Fareler gelen Lenf Nodu ve Dalak 2. izolasyonu

  1. Bir kurumsal onaylı tekniği kullanılarak hayvanların gerekli sayıda Euthanize. Olarak, erkek göre naiv T hücreleri ve alt vücut yağ yüksek oranda veya daha yaşlı farelerin C57BL / 6 dişi fareler, yaş, 5-10 hafta boyunca, kullanın.
    Not: erkek farelerden elde edilen hücreler in vitro olarak benzer gerçekleştirir ve protokol safhaları aynı kalır. 5-10 hft dişi fareler, genellikle fare başına 3-6 x 10 6 naif CD4 + T hücreleri verecektir. Ancak, fareler kullanılarak çeşitli tipleri verim ve performansını etkileyebilir. Örneğin, C57BL / 6 farelerinden alınan hücreler Balb.c farelerden aldıkları hücreler kullanarak, Th2 hücrelerin üretilmesi için daha iyi ise, Th1 hücrelerinin üretilmesi için daha iyidir.
  2. Hayvan uzuvları yaymak ve Şekil 1'de gösterildiği gibi yerde pin. Uzun cildi kesinDikkatli olmak itudinally çene anüs değilken derin doku delinme.
  3. Yayılması forseps ile cildi açın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi lenf düğümlerine kolay erişim sağlamak için yerinde cilt pin.
  4. Şekil 1'de gösterilen yerlerden erişilebilir lenf düğümleri Hasat. Forseps bir çift ile lenf düğümü kapma forseps başka bir çift ile doku ayıran kolay çıkarılması için izin verir ise. Toplama kabındaki doku yerleştirin.
  5. Şekil 1 'de gösterilen konumdan dalak hasat edilir. Bu durumda, periton içine dikkatli bir kesme dalak erişmek için gereklidir. Bir toplama kabına doku yerleştirin.
  6. Daha fazla dokular hasat edilecektir işlemi tekrarlayın. Aksi takdirde bir sonraki adımlara geçin. Bu noktada, sıralama sonra T hücrelerinin kaplama kadar buz üzerinde kalan tüm adımları.

3. Doku İşleme ve CD4 + Zenginleştirme

  1. Küçük lökosit ölümle sonuçlanabilir eritrosit lizis gerekmez lenf nodu hücre preparatları olarak verimi artırmak için farklı yemekler lenf düğümleri ve dalak işleyin. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar ayrıca sıralama için etiketleme önce araya getirilmesi, sonra dalak ve lenf düğümü popülasyonlarının işlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.
  2. PBS + 3 ml içeren yeni bir 60 mm çanak toplama çanak ve yerden doku (dalak veya toplanmış lenf nodları) sökün. Sterilize forseps kullanarak doku üzerinde örgü steril naylon bir kare yerleştirin.
  3. Bir şırınga pistonu başparmak tarafına (3-10 ml) alın ve yavaşça örgü karşı doku şut. Hemen hemen tüm doku süspansiyonu gitmek gerekir. Alternatif olarak, iki Otoklavlanmış buzlu slaytlar arasındaki doku yerleştirmek ve süspansiyon içine öğütülmüş.
  4. Süspansiyon yukarı Pipet ve bir kaç kez aşağı kalan çözünebilir öbekler kırmak için. Bir açılması üzerine naylon örgü yeni bir kare parça yerleştirin15 ml konik tüp ve kalan enkaz kaldırmak yoluyla süspansiyon filtre.
  5. Tekrar ek lenf nodu ve dalak dokusu için 2-4 adımları.
  6. Süspansiyon 15 ml tüp içine süzüldü sonra PBS + ile borunun kalan dolgu ve birkaç kez ters çevirin. 4 o C'de 5 dakika boyunca 475 xg'de hücreleri santrifüj
  7. Dalak hücreleri için, yüzer, aşağıdaki santrifüj aspire ve eritrositleri lizise uğratmak üzere, 1 dakika için dalak başına buzla soğutulmuş 1X ACK çözeltisi, 1 ml hücre pelletini. Daha sonra, ACK üstünde PBS + 10 ml ilave tüp ters ve santrifüj 475 x g 4 O ° C'de 5 dakika boyunca
  8. Lenf nodu hücreleri için, PBS + 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Arzu edildiği takdirde, bu da ACK liziz ve yıkama aşamasından sonra, dalak hücreleri ile birleştirilebilir.
  9. PBS + ve bir 10 ml splenositlerin santrifüj ve tekrar süspansiyon sonra süpernatan aspire. Bu noktada, lenf nodu süspansiyon birdalak süspansiyon üstünde dded doku havuzu sıralamak için gerekli ise. 4 O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar santrifüj tüpü
  10. Hücre pelet şimdi CD4 zenginleşmesi için hazırlanmış olabilir. Bu adımı gerçekleştirilmez ise, sıralama hazırlık adımlara devam edin.
  11. Yüksek hızlı manyetik hücre sıralama sistemini kullanarak CD4 zenginleştirme için, CD4 boncuklar ile hücresel pelletini. Tipik haliyle, PBS + 85 ul seyreltilmiş boncuk 15 ul 1 fare dokuları etiketlemek için kullanılır. Gerektiği gibi, boncuk karışımı sesini rampa pelletini ve 4 o C'de 15-30 dakika inkübe
  12. PBS + 10 ml hücreleri yıkayın 4 O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar artıkları ve santrifüj çıkarmak için yeni bir 15 ml tüp içine naylondan süspansiyon geçmesi
  13. Fare başına PBS + 100 ul pelet yeniden süspanse edin ve yüksek hızda manyetik hücre sınıflandırma sistemi üzerinde olumlu seçim geçin. Manuel ayırma sistemi, f kullanıyorsanızzenginleştirme için üreticinin talimatlarını ollow. Seçenek olarak ise, FACS tampon çözeltisi içinde tekrar süspansiyon örnekleri PBS, 1 mM EDTA (pH = 8) ve% 1 BSA, steril olarak filtreden geçirilmiş olan.
  14. Pozitif kısmını çıkarın ve PBS + 10ml ile tekrar yıkayın. zenginleştirilmiş CD4 + fraksiyonu şimdi sıralamak için etiketli hazırdır.

4. Ayırma Naif CD4 + T hücreleri

  1. PBS CD62L, CD44, CD25, CD4 ve karşı yöneltilmiş içeren floresan antikorlar + hücre pelet etiketleyin. Tablo 1 'de listelenen antikorlar kullanılarak, her biri için seyreltme sağlanır. Boyama için, antikor kokteylinin bir 100 ul hacim, bir fare doku başına kullanılır.
  2. Antikor kokteyli pelletini tekrar ve karanlıkta 4 o C'de 15-30 dakika inkübe.
  3. 4 O ° C'de, PBS + 10 ml santrifüj 475 x g 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın
  4. Yeniden başka bir naylon filtre veya hücre süzgeç kapağı üzerinde karışımı geçmekherhangi bir artık enkaz taşıyın. Hücre sıralayıcı ile uyumlu olan bir tüp içine etiketli hücreler Pipet. Buz üzerinde hücreleri tutun ve tür kadar ışıktan korunmalıdır.
  5. Bir hücre sıralayıcı toplama uyumlu tüplerin dibine tam RPMI ortam veya FBS 1-2ml pipetleme toplama tüpleri hazırlayın.
  6. Sıralama bir CD4 + CD25 gibi naif CD4 + T hücreleri - CD62L + CD44 - nüfusun (Şekil 2). Tam RPMI ortamı ile toplanan hücreler yıkanır ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
  7. Tam RPMI içinde pelletini saf hücrelerin sayısı ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır.

5. in vitro Farklılaşma Kurma

  1. Anti-CD3 ve anti-CD28 kaplı plakalara çukurlarına aspire ve steril PBS (hiç FBS) ve 1 ml her bir yıkayın. 48 oyuklu plakalar için, RP 0.5 x 10 6 hücre / oyuk olarak 0.5 ml plakaMI. 24 oyuklu plakalar, kültür 1 x 10 6 hücre RPMI / oyuk içinde 1.0 ml.
  2. Bu tür bir ilaç olarak, bir faktör etkisi test sırasında ya da daha önce, uygun oyuklara madde ekleme veya deneye bağlı olarak farklılaşma sonra ise. Sonraki, buna göre sitokinler ve engelleme antikorlar ile kültür ortamı tamamlamaktadır. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 ve 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2.000 ng 37,51 çözünür / ml, 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5.000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11.
    Not: Yukarıda belirtilen koşullar farklılaşma deneyinde (Örnek Sonuçlar bölümü) sonunda ölçülen sitokin üretimini maksimize etmek için en uygun olduğu bulunmuştur. Ancak, her koşul her laboratuvar (Tablo 2 için optimize edilmelidir ). Ayrıca, plakaya bağlı anti-CD28 ile birlikte çözünür anti-CD28 eklenmesi laboratuvarımızda Th2 sitokin üretimini arttırdığı bulunmuştur, fakat diğer T hücresi alt kümelerinin herhangi bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur:
  3. Önceden gen ifadesi ve sitokin üretimi analizine d 4-5 için% 5 CO2 ile 37 C 'de plaka inkübe edin. Seçenek olarak ise, hücre proliferasyonunu ve son verimi artırmak için, taze ortam ile 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı, 2 gün sonra, TCR uyaranlara hücreleri çıkarmak ve yeni bir kuyu (kaplamasız) plaka. Bu durumda, taze polarize sitokinler ve antikorlar gerekli değildir, ancak, IL-2, 10 U / ml Th0, Th1, Th2 ve iTreg kültürleri için yeni ortama ilave edilmelidir.

Farklılaşma 6. Analizi

  1. Akış sitometrisi ile sitokin analizi için, / ml iyonomisin veya 1 ug (örneğin, bir Brefeldin bir Golgi inhibitörünün varlığında 4-6 saat süre ile, anti-CD3 / ml Tablo ng 10ng / ml PMA ve 1000 ile her bir yeniden uyarmak1). Hücre içi sitokin boyama deney bağlı (Şekil 3) gerçekleştirin.
    Not: Leke olmayan soy spesifik sitokinler ya da (gösterilmemiştir), IL-4 ve IFNy gibi transkripsiyon faktörleri, negatif kontroller olarak ve farklılaşma verimliliği bir göstergesi olarak her bir durum için, Th17 kültürler için (Şekil 3). Ayrıca, Tregs karşılıklı bir gelişme olarak, Th17 kültürleri için leke Foxp3 TGFβ eklenmesi ile meydana gelebilir.
  2. Protein ölçümü için, sitokine spesifik ELISA (Şekil 3), her bir sıra ve testte süpernatantlar toplamak. Test edilen faktör kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu etkilediğini endişe varsa, hücreler, yıkanabilir, normalize sayılır ve ELISA tahlilleri için süpernatanların toplanması önce 24 saat boyunca anti CD3 1 ug / ml ile yeniden uyarılan. L kadar olabilecektir, IL-4 koşulları, yıkama ve tekrar uyarılmasından gereklidir Th2'den IL-4 kaldırmak için tahlil halindeİlk türev kültüründen eftover.
  3. Gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyon analizi için hasat hücreleri kuluçka döneminden sonra, yıkama, normalize, ve anti-CD3 ve 1 ug / ml hasat mRNA önce (Şekil 3) ile 2-6 saat boyunca tekrar harekete geçirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnci durumuna bağlı olarak değişebilir farklılaşma analizi için zaman noktası T hücresi reseptör aktivasyonunun gücü gibi test edilir. Farklılaşma 2-3 gün sonra hücreler, T-hücresi çoğalması derecesini tespit etmek için ışık mikroskobu ile görselleştirilebilir. Hücrelerin çoğalmasını ve geniş topaklanma sergileyen Wells muhtemelen büyük olasılıkla kültüründe 4 gün sonra ortam tüketecektir, eksojen IL-2, örneğin, Th1 ve Th2 olarak ilave dayanarak günde 4 Farklılaşma koşullarında analiz için hazır olacaktır. Sitokin üreti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalak saf Th hücreleri içerir, lenf düğümleri, bu nüfus oranı çok daha yüksektir. Düzgün, bu protokolde lenf düğümleri tespit ve kaldırmak için Başarısızlık saf hücrelerin kötü verim neden olacaktır. Bu daha çok yağ dokusu olması yaşlı farelerin ya da erkek farelerde özellikle zor olabilir. Hayvan bacaklarda ve cilt Şekil 1, uygun bir sabitleme ve çivileme gösterildiği gibi erişilebilir dış lenf nodu kolay görselleştirme için izin verir. Lenf düğümleri ve dalak işlenir sonra hücre sıralama son derece sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu protokolün optimizasyonu için Texas MD Anderson Kanser Merkezi'nde Üniversitesi Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Reynolds laboratuarında tüm üyelerini ve Chen Dong laboratuar teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K22AI104941) den JMR bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tam RPMİ:Kullanmadan önce 37 oC su banyosunda ısıtın
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
%10 FBSYaşam Teknolojileri26140-079
1000X 2-merkaptoetanolYaşam Teknolojileri21985023
100X Pen/StrepYaşam Teknolojileri15140122
100X L-glutaminYaşam Teknolojileri25030081
120 mikron naylon örgüAmazonCMN-0120-10YD2 cm2 kareler ve otoklav halinde kesin
Alternatif: 100 mikron hücreli süzgeçlerFisher08-771-19Naylon örgü kesmeye alternatif
autoMACS çalışan tamponMiltenyi130-091-221Kullanmadan önce 37 oC su banyosunda ısıtın
autoMACS durulama solüsyonuMiltenyi130-091-222Kullanmadan önce 37 oC su banyosunda ısıtın
CD4 boncuklarıMiltenyi130-049-201
ACK lizis tamponuYaşam TeknolojileriA10492-01
Sitokinler:
İnsan (h) IL-2Peprotech200-02
Rekombinant fare (rm) IL-4Peprotech214-14
rmIL-6R & D Sistemleri406-ML-025
rmIL-12Peprotech210-12
hTGFbAr-Ge D Sistemleri240-B-010
Antikorlar:
2C11 (anti-CD3)BioXcellBE0001-1
37.51 (anti-CD28)BioXcellBE0015-1
11B11 (anti-IL-4)BioXcellBE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)BioXcellBE0055
anti-CD62L-FITCBioLegend1044061:100
anti-CD25-PEBioLegend'da102008 1:400
anti-CD4-PerCP'deBioLegend1004341:1000
anti-CD44-APC'deBioLegend1030121:500'de kullanın
  12-miristat 13 asetat (PMA)Sigma-AldrichP-8139DMSO'da 0.1 mg / ml'de bir stok hazırlayın ve alikotları -20 o'da dondurunC
İyonomisinSigma-AldrichI-0634DMSO'da 0,5 mg / ml'de bir stok hazırlayın ve alikotları -20 oC'de dondurun
Brefeldin AeBioscience00-4506-511:1000'de kullanın
kullanın kullanın kullanın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  2. Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
  3. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  4. Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
  5. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  6. Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
  7. Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
  8. Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
  9. Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
  10. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  11. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  12. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  13. Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
  14. Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
  15. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  16. Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211(2012).
  17. Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  18. Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
  19. Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
  20. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
  21. Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
  22. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  23. Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
  24. Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
  25. Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
  26. Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
  27. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  28. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  29. Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
  30. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
  31. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Naive CD4 T H cresi zolasyonuManyetik Boncukla Ay rmaT H cresi Alt K me DiferansiyasyonuAk Sitometrisi AnaliziGer ek Zamanl PCR De erlendirmesiLenf D m lemeDalak H cresi Haz rlamaSitokin PolarizasyonuTCR AktivasyonuYard mc T H cresi Soylar

İlgili makaleler