GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve CGE) türetilen GABAerjik kortikal internöron, işlevsel ve morfolojik çeşitlidir. Yayılmakta farklı kortikal interneuron alt rollerini anlamada yapılmış, ancak, GABA farklı hücre tiplerinin gelişmesi ve olgunlaşması için katkıda bulunabilir çalışılması gerektiğini hala birçok mekanizma vardır. Ayrıca, değiştirilmiş GABA sinyal, otizm, şizofreni ve epilepsi fenotipleri katkıda bulunabilir. Spesifik Kre-sürücü hatları eşsiz interneuron alt fonksiyonlarını dışarı parsel başladı. Fare modellerinde ilerlemelere rağmen, verimli in vivo moleküler yaklaşımlar GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır çalışma genellikle zordur. Bu hücrelerin hücre özerk programlama incelemek için kullanılan önemli bir tekniktir konak korteks içine MGE hücrelerinin nakli olduğunu. Bu nakledilen hücrelerin ayırt, yoğun göç, birnd işlevsel entegre. Buna ek olarak, MGE hücreleri verimli bir şekilde moleküler yaklaşımlar çok sayıda imkan veren, transplantasyondan hemen önce lentivirüs ile transduse edilebilir. Burada mevcut Kre-sürücü hatları ve Kre-bağımlı ifade vektörleri kullanılarak, detay verimli in vivo analiz için transplantasyon öncesi MGE hücreleri nakletmek için bir protokol biz. Bu, in vivo olarak daha büyük bir hücre türüne özgü çözünürlüğe izin verecek şekilde nakli sonrası dağıtmak için bu hücrelerin yeteneği ile kesin genetik işleme birleştirir, bu yaklaşım, avantaj sağlamaktadır.
Giriş
Dinlenme, glutamaterjik temel nöronlar uyarıcı karşılık ise GABAerjik kortikal internöron, memeli neokorteks nöronların ~% 20-30 içermektedir. Internöron elektrofizyolojik özellikleri, akson ve dendrit morfolojisi ve 1 hedefleme sinaptik oldukça çeşitlidir, ve uyarıcı / inhibitör tonda dengesizlikler otizm, şizofreni ve epilepsi gibi nörolojik 2 / nöropsikiyatrik bozuklukların bazı fenotipleri altında yatan varsayılmaktadır. Burada açıklanan protokol genel amacı verimli genetik in vivo analizler için transplantasyon öncesi GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır değiştirmek için bir araç sağlamaktır.
Korti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik deyimi: Aşağıdaki prosedürleri kurum ve hayvan protokolü tarafından onaylanmıştır. Deneyler başlamadan önce hayatta kalma ameliyatları ile ilgili tüm işlemler için onay almak için emin olun ve tüm protokolleri güncel olduğunu doğrulamak.
1. lentivirüs Hazırlık (İsteğe bağlı Adım)
- 10 ml DMEM /% 10 FBS varlığında yapılabilir her lentivirüs için HEK293T hücrelerinin üç adet 10 cm'lik tabak bölünmüş, ve •% 60-70 ortak akışa kadar büyümeye. % 5 CO2 ile 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde hücreler büyür.
- 1.2 ug pMD2.G (VSV-G kodlayan) 1,2 (Tablo 1 'de verilen DNA vektörü sekansı), 6.4 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MGE hücreleri göç ve bir konak neokorteks 16 nakledilen zaman entegre benzersiz yeteneği olduğundan, onlar vivo çalışmalar öncesi genetik manipülasyon için mükemmel bir model sistemi sağlar. Burada, tek bir E 13.5 embriyolardan MGE doku izole nasıl kullanılabileceğini gösterir (Şekil 1 ve 2), daha sonra in vitro veya in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce hızlı bir şekilde ya da lentivirüs ile transduse edilebilir. Lentivirüsler üzerinden Etiketleme MGE G.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre bazlı tedaviler için embriyonik ganglion eminences (GEs) den GABAerjik kortikal interneuron öncülerinin kullanımı birçok koşulları 12 -1 4 için umut gösteriyor. Hassas moleküler teknikler etiket ve belirli interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için ihtiyaç vardır. Burada transplantasyonundan önce lentivirüsler embriyonik MGE hücrelerin etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar ve bu yöntem, in vivo analiz için özel kortikal interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için nasıl kullanıla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma dan JLRR hibe ile desteklenmiştir: Otizm Konuşuyor, Nina İrlanda, Weston Havens Vakfı, NIMH R01 MH081880 ve NIMH R37 MH049428. Prw Tayvan Ulusal Bilim Konseyi bir burs ile desteklenmiştir. SFS F32 (MH103003) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MGE hücre nakli için reaktifler ve ekipman | |||
| 1 ml şırınga | REF 309602 | BD, Becton Dickinson ve şirket | |
| 30 1/2 G iğne | 305106 | BD, Becton Dickinson ve şirket | |
| 5 & mikro teslim etmek için hassas delik; l (piston ile birlikte gelir) | 5-000-1005 | Drummond bilim şirketi | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. | |
| Boomstandlı stereo mikroskop ** | MZ6 | Leica | |
| Digital sadece fareler için stereotaksik alet ** | 51725D | Hırsızlık şirketi | |
| Tek eksenli yağ hidrolik ince mikromanipülatör ** | MO-10 | Narishige | |
| yapılan | elmas kaplı döner beveler | ||
| İğne pipet çektirmesi | 730 | Kopf aletler | |
| Mineral yağ | Herhangi bir eczane veya eczane | ||
| 1 ve mikro ölçebilecek herhangi bir pipet ve uç; l of volume | |||
| ** Bunlar kullandığımız belirli modellerdir, ancak diğer birçok kurulumun çalışması | |||
| Opsiyonel Reaktifler (Lentivirus yapmak için) | |||
| 25 mm, 0.45 &mikro; m filter | 09-719B | Fisher Scientific | |
| Ultra şeffaf santrifüj tüpleri (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® | |
| Lipofektamin 2000 (1.5 ml boyut) | 11668019 | Invitrogen | |
| Ticari olarak temin edilebilen diğer sarf malzemeleri | |||
| pMDLg/pRRE plazmit kodlaması gag/pol | 12251 | Addgene | |
| pRSV-Rev plazmit kodlaması Rev | 12253 | Addgene | |
| pMD2.G plazmit kodlaması VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Ekle | |
Kaynaklar
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
