Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması

Özet

Spesifik DNA etiketi metil yeşili olan sabit biyolojik materyalin floresan boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Metil yeşili, seyreltilmiş sulu bir çözeltide kullanılır ve foto ağartmaya karşı çok dirençlidir. Uzak kırmızı emisyonu, derin örnek görüntülemeye izin verir ve bu da onu tüm embriyolar için özellikle yeterli hale getirir.

Özet

Metil yeşili, floresan özellikleri yakın zamana kadar keşfedilmemiş olmasına rağmen, uzun zamandır DNA için spesifik bir afiniteye sahip histolojik bir leke olarak bilinmektedir. Bu makalede, seyreltildiğinde sabit hücreler ve dokular için çok uygun bir floresan nükleer etiket olarak kullanılabilen bir metil yeşili sulu stok çözeltisi hazırlama yöntemini gösteriyoruz. Bütün zebra balığı ve civciv embriyolarını etiketlemek için kolay prosedürler detaylandırılmıştır ve elde edilen görüntü örnekleri gösterilmiştir. Metil yeşili, 633 nm'de kırmızı ışıkla maksimum düzeyde uyarılır ve 677 nm'de zirveye ulaşan nispeten keskin bir spektrumla yayılır. Çok ucuzdur, toksik değildir, çözelti içinde oldukça kararlıdır ve DNA'ya bağlandığında foto ağartmaya karşı çok dirençlidir. Kırmızı emisyonu, kalın örneklerde çekirdeklerin değiştirilmemiş yüksek çözünürlüklü taramalı konfokal görüntülemesine izin verir. Son olarak, bu metil yeşili boyama protokolü, antikor etiketleme veya florofor konjuge falloidin ile aktin filamentleri etiketleme gibi diğer hücre boyama prosedürleriyle uyumludur.

Giriş

DNA'nın floresan boyanması, hem biyolojik araştırmalarda hem de klinik tanıda, nükleer ve kromozomal yapının ayrıntılı çalışması, doku ve hücrelerin karşı boyanması veya hücre döngüsü parametrelerinin incelenmesi için yaygın ve rutin olarak kullanılmaktadır¹. Birkaç DNA lekesi mevcut olmasına rağmen, en yaygın olarak kullanılanlar, UV ışığı tarafından uyarılan ve mavi renkte yayanlardır, bu da yeşil ve turuncu-kırmızı yayan floroforlarla birleştirildiğinde çoğu geleneksel epifloresan mikroskopta kullanılan olağan üç filtreli sistemlere uyar, floresan proteinler veya antikorlara bağlı küçük moleküller gibi. Bu mavi yayan DNA lekeleri arasında en yaygın olanları DAPI ve Hoechst minör oluk bağlayıcı ajanlardır^2,3. Bununla birlikte, lazer tarama mikroskoplarında çok çeşitli lazer emisyon çizgilerinin ve spektral tespitin dahil edilmesi, araştırmacıların propidyum iyodür (PI) veya TO-PRO 3⁴ gibi uzak kırmızı yayan nükleer lekelerin kullanımını seçmelerine izin vermiştir. Bu lekelerin bir avantajı, birçok hücre ve dokuda, özellikle embriyolarda bulunan otofloresan sorununun üstesinden gelmeleridir⁵, ancak birçoğunun geniş emisyon profillerine sahip olması veya fotobleaching'e çok duyarlı olması^gibi farklı sorunları vardır 6.

İsviçreli araştırmacı Friedrich Miescher, DNA'yı 1869'da keşfetti ve onu irinde bulunan beyaz kan hücrelerinin çekirdeklerinden çıkardı. Ona nüklein adını verdi ve birkaç yıl sonra nispeten yeni bir leke olan metil yeşili ile çökeltiler oluşturduğunu gösterdi. Metil yeşili, farklı derecelerde metilasyona sahip üç anilin halkasından oluşur ve DNA^7,8'in ana oluğuna güçlü bir şekilde bağlanmasına izin veren iki pozitif yüke sahiptir. Metil yeşili ile DNA boyamanın çok erken bir zamanda spesifik olduğu gösterildi, bu da Unna ve Pappenheim tarafından özellikle RNA'yı etiketleyen pironun ile kombine bir lekenin geliştirilmesine yol açtı. Metil yeşil-pironun o zamandan beri rutin histolojik teknikte yaygın olarak kullanılmaktadır⁹.

Yakın zamana kadar, metil yeşilinin floresan özellikleri hakkında çok az şey biliniyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmamız, 633 nm'de uyarılması, uygun bir Stokes kayması, elektromanyetik spektrumun yakın kızılötesi kısmına yayılması, benzer spektral özelliklere sahip ticari olarak mevcut DNA lekelerinden daha yüksek fotostabilite gibi metil yeşil spektral avantajlardan⁶ bazılarını ortaya çıkardı ve çok düşük bir maliyetle. Bu nedenle, embriyonik dokularda ve tüm embriyolarda DNA için çok yüksek afiniteli ve spesifik bir floresan etiketi olarak kullanılması için test etmeye karar verdik. Ayrıca, şimdiye kadar metil yeşili nükleer boyama düşük pH'da gerçekleştirildi ve bu da antikor boyaması ile birleştirilmesini zorlaştırdı. Burada ayrıntıları verilen yöntemin amacı, boyama prosedürünü fizyolojik pH'ta gerçekleştirerek yukarıda belirtilen rahatsızlığın üstesinden gelen floresan nükleer DNA boyama protokolüne sahip olmak ve böylece onu bölümler ve tüm dokular üzerinde immünoetiketleme için uygun bir karşı boyama haline getirmektir.

Protokol

Boyar 1. Saflaştırma

1. Damıtılmış su, 10 ml leke tozu 0.4 g çözülmesiyle metil yeşili bir% 4 sulu çözelti hazırlayın. Tamamen eritilmesi gelene kadar iyice karıştırınız.
2. Bir duman-Kaputun altında, kloroform en az 2 parçaları ile karıştırarak. Bu tüpler kloroform dayanıklı olup olmadığını önceden kontrol edilmesi önemlidir.
3. İyice karıştırın ve faz ayrımını hızlandırmak için 2,000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüj.
4. Santrifüj işleminden sonra, metil yeşili bir üst sulu faz ve kloroform ile daha düşük bir organik faz ve her zamanki gibi kirletici kristal viyole elde edilir.
5. Üst fazı kurtarmak ve alt faz kristal viyole tamamen yoksun görünene kadar bu adımı tekrarlayın.
6. Sonunda, üst faz elde edilir ve% 2'lik bir metil yeşili bir nihai konsantrasyona kadar su ile seyreltilir. Bu stok çözeltisi, ay tezgahında stabil olduğu ve ışıktan korunması gerekmez.

2. Tüm Zebra balığı Embriyolar Floresan Nükleer Boyama Metil Yeşil kullanarak

1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde (paraformaldehid ile ilgili) bir karışımı,% 4 formaldehid embriyolar sabitleyin.
   NOT: Bu bir kaç saat sürebilir gecede embriyoların kalınlığına bağlı olarak. Örneğin, biz bir gecede 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) zebrafish embriyolar sabit.
2. 5 dakika boyunca PBS-T (PBS içinde% 1 Triton X-100), embriyolar üç kez yıkayın. deterjanın yüksek konsantrasyonu, kütikül permeabilizes.
3. 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. inkübasyon sırasında deterjan varlığının örneğin zebra balığı embriyolarının ve larva gibi kalın örneklerde, için kullanışlıdır.
4. Hafifçe çalkalanarak, 4 ° C de en az 6 saat boyunca çözelti içinde embriyolar inkübe edin. Yine, embriyo kalınlığı inkübasyon süresi için kalibrasyon parametredir.
5. Embriyoların 3 tim yıkayın30 dakika boyunca PBS ile ES deterjan fazlasının ayrılması için. DNA'ya bağlandığı zaman metil, yeşil floresan özelliğinin yalnızca belirgindir, bağlanmamış molekülden dolayısıyla arka ihmal edilebilir düzeydedir.
6. Bir kazı slayt veya montaj çözeltisi ile yapımı bölmesi üzerine monte (% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH 8).
   NOT: Nükleer boyanma immunolabeling sonra yapılacak ise, metil yeşil bunu yıkayacak gerek kalmadan, çalışma konsantrasyonunda montaj çözüm eklenebilir.
7. Mağaza buzdolabında ya da hemen görüntüleme başlatın. 650-750 nm yeşil emisyon 677 nm maksimum ulaşır metil dikkate alarak kayıt ayarlanmış 633 nm ve emisyon filtreleri de uyarma ile bir lazer tarama konfokal (ya da diğer floresan) mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin.
   NOT: metil yeşil emisyon profili ölçülen verileri, ek malzeme olarak, satın alma yazılımı yüklenecek sağlamak.

3. Floresan Nükleer StMetil Yeşil kullanarak Tüm Chick Embriyolar Tahliye

1. Ilgi sahneye döllenmiş tavuk yumurtaları kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de bir gece boyunca PBS (paraformaldehid ile ilgili)% 4 formaldehit embriyolar düzeltildi. 2 saat süre ile, PBS-T içinde embriyolar 3 kere yıkayın.
2. 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar inkübe edin. Embriyolar 3 kere PBS ile 1 saat, her yıkayın. % 75 gliserol, 0.1 M Tris, pH 8, oda içinde monte edin.

4. Görüntüleme Floresan Tüm monte Embriyolar Çekirdeği Etiketli

1. Dikkatli bir mikroskop lamı üzerine elektrik bandı birkaç kat yapışmasını tarafından bir görüntüleme odası hazırlayın içinde embriyolar yerleştirmek için bir neşter ile içine bir delik kesti. Bu görüntüleme sırasında ezilme embriyolar önleyecektir.
2. Dikkatli bir şekilde% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH = 8, üstüne bölmeyi görüntüleme odasına embriyo transferi ve dolgugeçersiz kabarcık oluşumu.
3. Bir # 0 lamel kaçınarak veya orta taşan ortadan ile kaplayın. Oje ile mühür.
4. Bir 633 uyarılma filtreli veya lazer hattı ile teçhiz edilmiş bir flüoresans mikroskobu, numunenin görüntüleri elde edin.
   NOT: Emisyon filtreleri metil yeşili 677 emisyon maksimum kapsamalıdır.

Sonuçlar

Kalın numunelerin Nükleer boyanma. Burada tarif edilen protokol bütün embriyolar derin yapıların homojen lekelenme başarı sağlar. Gelişmekte mercek çekirdek formu 48 hpf Zebra balığı embriyolar homojen (Şekil 1) etiketlenir.

Metil yeşil DNA boyama gibi mitoz veya apoptotik çekirdeklerin (Şekil 2A) tanımlanması gibi hücre döngüsü bağımlı morfolojik farklılıkların ayrımcılığa izin verir. Zebra balığı embriyolar (Şekil 2B) epidermal çekirdekler...

Tartışma

Son yıllarda mikroskopi tekniklerinin ilerleyici gelişimi, özellikle floresan mikroskopi varyasyonlarına odaklanarak, tüm embriyolar^10,11 dahil olmak üzere bozulmamış doku örneklerinin dinamiklerini ve yapısını keşfetme olasılığına yol açmıştır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, hücre altı yapıları doğrudan ve hızlı bir şekilde boyamak için kullanılabilecek kaliteli floroforların mevcudiyeti olmuştur.

DAPI veya Hoechst gibi en sık kullanılan floresan DNA boyaları, UV ışığı il...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516
Metil yeşili	Dr. G. Grü bler		Ayrıca kristal viyole içermeyen Sigma-Aldrich 323829'yi test etti
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127
Lazer taramalı konfokal mikroskopi Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin– Tetrametilrodamin B izotiyosiyanat	Sigma-Aldrich	P1951
kloroform	Sigma-Aldrich	372978
Santrifüj 5810 R	eppendorf	5811 000.010
mikroskop kızakları	Deltalab	D100004
kapak kızakları	Esco optik	R525025