Yöntem makalesi

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

13.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52782

⸱

3 Mayıs 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

Hücre zarlarındaki taşıyıcılar, iyonların hücre zarları veya hücre katmanları boyunca diferansiyel ayrışmasına izin verir ve doku fizyolojisi, onarımı ve patolojisi sırasında çok önemli roller oynar. Tek hücrelerde ve dokularda spesifik iyon akışlarının in vivo olarak ölçülmesine izin veren iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrotu açıklıyoruz.

Özet

Hayvan, bitki ve tek hücre hücreler dışarıdan sitoplazma ayıran hücre zarı olarak adlandırılan bir bariyer ile kapatılmıştır. Örneğin epitelde gibi hücre tabakaları da dış ya da çok hücreli organizmaların farklı kompartmanların iç ayıran bir bariyer oluşturur. Bu engellerin önemli bir özelliği, hücre membranları veya hücre tabakaları iyonların ayırıcı dağılımıdır. İki özellikleri bu dağılımı sağlar: 1) membranlar ve epitel belirli iyonların seçici geçirgenliğini gösterir; 2) iyonları hücre zarları ve hücre katmanları arasında pompa aracılığıyla taşınmaktadır. Bu özellikler, doku fizyolojisini korunmasında önemli rol oynarlar ve tamir sırasında, hasar sonrası ipuçlarını sinyal olarak hareket ya da patolojik koşullarda. iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot bu tip bir tekli hücre ve doku seviyelerinde kalsiyum, potasyum veya sodyum gibi iyonların özel tozlar ölçümleri sağlar. mikroelektrot bir iyonofor kokteyl içerirBelirli bir iyon seçici olarak geçiren. İç dolgu çözüm ilgi iyon bir dizi konsantrasyonunu içerir. mikroelektrot elektrik potansiyeli iyonunun dışında konsantrasyonu ile belirlenir. Iyon konsantrasyonu değişir, mikroelektrot potansiyeli iyon aktivitesinin günlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir. (Nedeniyle iyon akı bir konsantrasyon gradyanı yani) ileri ve geri iyonu kaynağı veya lavabonun yanında taşındığında mikroelektrod potansiyeli iyon akışı / degrade orantılı bir genlikte dalgalanır. amplifikatör mikroelektrot sinyalini güçlendirir ve çıkış bilgisayarda kaydedilir. iyon akışı daha sonra spesifik iyon hareketliliği olarak elektrot potansiyel dalgalanma, mikroelektrot gezi ve diğer parametreleri kullanarak difüzyon Fick'in yasayla hesaplanabilir. Bu yazıda iyon seçici self-referencing mikroelektrod An kullanarak dışı iyon akıları ölçmek için metodoloji detaylı tarifbazı temsilcisi sonuçlarını sunmak d.

Giriş

Tüm hayvan hücreleri dış çevreden sitoplazma ayıran bir lipid iki katmanlı zar ile çevrelenmiştir. Hücre iyonlarının 1 aktif taşıma ile, içinde bir elektrik membran potansiyelini negatif tutar. membran potansiyeli hücre zarında 2 çeşitli moleküler cihazları çalıştırmak için kullanabileceği bir depolanmış enerji kaynağıdır. Nöronlar ve diğer heyecanlı hücrelerin büyük zar potansiyelleri var. Sodyum kanallarının hızlı açılış membran potansiyeli (depolarizasyon) çöker ve nöron 2 uzunluğu boyunca taşınır aksiyon potansiyeli oluşturur. Bunların yanı sıra hızlı elektrikli değişikliklerden birçok doku ve organları oluşturmak ve uzun vadede önemli elektrik potansiyellerini korumak. Örneğin, deri ve kornea epitel oluşturmak ve iyonların yönlü pompalama (özellikle, sodyum ve klorid) 3 trans-epitel potansiyelleri ve hücre dışı elektrik akımı muhafaza.

endojen hücre dışı elektrik akımı ölçümleri titreşimli prob 4-6 ve hücre zarlarının ve epitel hücre katmanlarının elektrik parametrelerinin ölçümünü sağlayan mikroelektrod sistemini 7-10 kullanarak membran veya trans-epitel potansiyellerin ölçümleri kullanırken çadır ">, onlar vermek katılan iyon türlerinin göstergesi.

Seçici iyonofor ile Mikroelektronlar çözelti içinde spesifik iyon konsantrasyonunu ölçebilirsiniz. İyon gradyanları ya da akışkan farklı konumlarda iki veya daha fazla elektrot ile ölçülebilir. Ancak, her sonda içsel gerilim sürüklenme, farklı olabilir yanlış ölçüm ya da mevcut olmayan bir degrade bile tespit sebep olacaktır. İki nokta arasındaki düşük frekansta hareket sayede "self-referans" modunda kullanılan tek bir elektrot bu sorunu çözer. Şimdi iyon akışı nispeten yavaş ve istikrarlı sinyal sürüklenme arka planı görülebilir (Şekil 3B).

iyona duyarlı bir ölçüm sistemi doku veya tek hücre yakın iyonlarının küçük bir hücre-dışı akıları tespit etmek için iyon seçici kendinden referans Mikroelektronlar kullanır. Sistem mikroelektrot hareketini kontrol etmek mikroelektrot ve mikro step motor ve sürücü sinyali işleyen bir amplifikatör oluşur. devresini kapatmak iyon seçici mikroelektrot ve ayrıca referans elektrotu bir headstage pre-amplifikatör (Şekil 1A) ile amplifikatöre bağlanır. Bilgisayar yazılımı Mikroelektrot hareketi (frekans, mesafe) parametrelerini belirler ve ayrıca amplifikatör çıkışını kaydeder. adım motoru, üç boyutlu bir micropositioner ile mikroelektrot hareketini kontrol eder. Iyon seçici mikroelektrot titreşimli düşük frekanslı ilk belirli kalsiyum akı 11 ölçmek için 1990 yılında geliştirilmiştir. Yanı sıra kalsiyum gibi, ticari erişilebilir iyonofor kokteyller şimdi MICR yapmak için kullanılabiliroelectrodes sodyum, klorür, potasyum, hidrojen, magnezyum, nitrat, amonyum, florür, lityum ya da cıva duyarlı.

Temel olarak, kendi kendine referans iyon seçici mikroelektrot tekniği, bir voltmetre ile ölçülebilir bir elektrik potansiyel bir çözelti içinde çözündürüldü, belirli bir iyon aktivitesini dönüştürür. iyonofor kokteyli karışmayan sıvı iyon-değişim özelliklerine sahip (organik, lipofilik) aşamasıdır. iyonofor seçici (bağlar) belirli bir iyonlar, tersine çevrilebilir şekilde ve mikroelektrot (elektrolit) içerdiği, sulu çözeltisi ve mikroelektrot daldırılmış olduğu bir sulu çözelti (Şekil 1D) arasındaki aktarma çalışmalarının kompleksleri. Bu, iyon aktarımı, bir elektro-kimyasal denge yol açar ve mikroelektrot ve referans elektrot arasında elektrik potansiyeli değişimi voltmetre ile ölçülür. Gerilim Nernst e göre özel iyonu aktivitesinin logaritması ile orantılı olduğuiyon konsantrasyonu (Şekil 2A ve B) hesaplanmasını sağlayan quation.

Şu anda, birkaç sistemler benzer bir kavram ya da ilke kullanarak iyon akışının ölçümü sağlar. Örneğin, Newman ve Shabala 14-16 tarafından geliştirilen tarama İyon seçici elektrot Tekniği (SIET) 12,13 veya Mikroelektrod Ion Akı Tahmini (MIFE) tekniği piyasada mevcut ve yaygın belirli iyonu belirlemek amacıyla araştırma topluluğu tarafından kullanılmaktadır hayvan, bitki ve tek canlı hücre modelleri çeşitli genelinde hücre zarı ve doku meydana gelen akıları. İyon seçici Mikroelektronlar serebral arter farede 18 ve polen tüpleri 19, paten retina hücreleri 20 hidrojen akı, fare kemik 21, çeşitli iyon kalsiyum akışının hidrojen, potasyum ve kalsiyum akısını bitki köklerine 17 arasında, klorür akının ölçülmesi için kullanılmıştır mantar hif 22 ve r akılarıTek hücreli yara sırasında kornea 23 ve son olarak kalsiyum akı ile 12,24 şifa. Ayrıca iyon seçici kendinden referanslı Mikroelektronlar 25 hakkında detaylı bilgi için aşağıdaki gözden bakın.

aşağıdaki makale hazırlamak ve tek hücre düzeyinde iyon seçici self-referencing mikroelektrod tekniği kullanılarak endojen hücre dışı iyon akıları ölçümünü nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak anlatılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Hazırlık

  1. Iyon seçici mikroelektrot hazırlanması
    1. Isı, bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak filamanın (1.5 mm dış çaplı, 1.12 mm iç çap) olmadan, ince duvarlı borosilikat kılcal çekin.
      Not: Bu, ipuçları çapı 3-4 mikron verir. Daha küçük ipuçları elektronik gürültüye Mikroelektronlar daha duyarlı hale getirir ve aynı zamanda iyon konsantrasyonunda bir değişikliğe daha yavaş bir tepki ile ilişkili yüksek dirence sahiptir. Faydalı bilgiler Smith ve ark., 26 tarafından yayınlanan yazıda bulunabilir.
    2. Lipofilik iyonofor kokteyl tutulmasını yardımcı olmak için iç yüzeyini hidrofobik hale getirmek için elektrotlar Silanize. Bunları kurutmak için> 100 ° C 'de, bir fırın içinde bir metal raf ve ısı O / N mikroelektrot yerleştirin. raf 2 mm çapında delikleri olan bir metal plaka ile yol parçası delinir. Ml gr delik elektrotlar 250 ile yukarı ucu yerleştirinbunların üzerine kız beher.
    3. Sabah, fırın kapatın ve yalıtımlı eldiven giyerek, dikkatle yerine elektrotlar ve beher metal raf çıkarın. Isıyı korumak için fırın kapağını kapatın.
    4. Lateks veya nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Plastik Pasteur pipeti ile, her elektrodun dibinde silanizasyon çözeltisinin ben bir damla koyun (yerinde beher tutmak, pipet erişimi için dökme dudak kullanın). silanizasyon çözüm sıcak plaka ile buharlaşmış ve elektrotların içini silanizes edilir. Bu aşamada bir kimyasal çıkarıcı davlumbaz kullanın. Birkaç saat kalan silanizasyon çözümü buharlaşmasına izin sıcak fırında raf / beher / elektrotların geri yerleştirin.
      Not: Güvenlik nedeniyle, tekrar fırını açmayın. Zararlı ve yanıcı buhar içerebilir gibi açık olmamalıdır gösteren fırın bir etiket yerleştirin.
    5. Soğutulduktan sonra, bir mikroelektrot kavanozlar insi mikroelektrot depolamakkurutucu 400 g cam bir desikatörde de. Mikroelektronlar haftalarca bu şekilde saklanabilir.
      Not: alternatif bir silanizasyon yöntemi Smith ve diğerleri tarafından tarif edilmektedir: 26.
    6. Ölçülecek olan iyon, 100 mM ihtiva eden bir çözelti 50-100 ul (yaklaşık 1 cm uzunluğu) (bakınız Tablo 1 ve Şekil 1B) mikroelektrot geri-dolgu. Ince bir filamanın bir Bunsen beki çekti atılabilir plastik Pasteur pipeti ısı kullanın. Tıkanmayı önlemek için daha sonra DH 2 O pipet durulayın.
      Not: Alternatif olarak, dış solüsyon 27 iyon konsantrasyonunu maç dolgu çözeltisinin iyon konsantrasyonunu ayarlayın.
    7. Hava kabarcıkları olmaması sağlamak için bir tahlil mikroskobu altında mikroelektrot dikkate alınmalıdır.
      1. Dikey elektrot tutarken kabarcıklar tırnağınızla hafifçe mikroelektrot mevcut musluk varsa (aşağı ucu) ve / veya kabarcık itinİğneyi yerine bir silikon tüp ile modifiye bir şırınga kullanarak geri basınç uygulayarak ucu dışarı s.
    8. Iyon spesifik iyonofor kokteyl 15 ila 20 nl (30-50 mikron uzunluğunda) ile mikroelektrot ucu doldurmak (bakınız Tablo 1). Bir mikroskop lamı kısa kenarında iyonofor kokteyl küçük bir damlacık yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında mikroelektrot ucu gözlemleyin ve mikroelektrod ucu sadece yaklaşık yarım saniye iyonofor kokteyl temas edene kadar mikroskop lamı doğru hareket ettirin. Kılcal basınç ile mikroelektrot içine iyonofor kokteyl çizin.
      Not: Bu elektronik parazit (gürültü) ile bu duyarlı yapabilirsiniz sondanın elektrik direncini artırır ve aynı zamanda yanıt süresini yavaşlatır olarak iyonofor kokteyl uzun bir sütun kaçının.
    9. Altın, 1 mm erkek konektör ve AgCİ (Ag +), tel (Şekil 1B) düz bir mikroelektrot tutucu mikroelektrot monte edin.
    10. Üç boyutlu bilgisayar kontrollü elektronik micropositioner (Şekil 1A) üzerine monte kafa aşamasına mikroelektrot yuvasını takın.
    11. Örnek ölçülebilir için çözelti, uygun ölçme bölgesi mikroelektrot ucu yerleştirin (fizyolojik tuzlu su, kültür ortamı, vs.) mikroelektrot bir saat ya da iki ya da gece boyunca stabilize etmek için izin vermek.
  2. Referans elektrotunun hazırlanması
    1. Referans elektrot (Şekil 1C), yukarıdaki ile aynı kılcal bulunmaktadır. 5 cm uzunluklarda bir elmas kalemle kılcal kesin ve Bunsen alev 1-2 saniye boyunca her iki ucunda yangın cilalı.
    2. NaCI, 3 M çözelti, ~ 200 ul, bu elektrotlar dolgu,% 2 agaroz ile CH3 CO2 K (potasyum asetat) ya da KCI. Iyon bağlı olarak çözelti, ölçülecek seç (referans elektrotu ölçülecek iyon içermemelidir; bakınız Tablo 1). Karıştırmakagaroz ve neredeyse bir mikrodalga kaynar çözümü ve ısı. Agaroz çözmek için karıştırın (çözelti berrak gider).
    3. Bir plastik Pasteur pipeti referans elektrodu takın ve kılcal içine sıcak çözüm çizin.
    4. Kullanmadan önce mühürlü tüplerde bu 3 M çözelti soğuk 3 M NaCI, CH 3 CO 2 K veya KCl çözeltisi ve mağaza içine elektrod bırakın. Hava kabarcıkları ile herhangi bir referans elektrotlar atın.
    5. Düz bir mikroelektrot tutucu bir referans elektrot içindeki (önceden doldurulmuş 3 M çözelti) ile bir AgCI (Ag +) ile pelet ve altın 2 mm erkek konektör (Şekil 1C) monte edin ve bir manuel mikro konumlayıcı üzerine elektrotu ve tutucuyu manyetik bir stand üzerine monte edilmiş.

2. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Kalibrasyon

  1. Referans çözelti olarak ilgi iyonu içeren kalibre çözümleri hazırlanması; Tablo 1 bakınız ong. Çözelti örnek olacak (örneğin kültür ortamı, serum fizyolojik) olan konsantrasyonu ayraç. Yani, bir kalibrasyon çözeltisi ölçüm çözeltisi içinde daha iyonunun daha düşük bir konsantrasyonda içerir ve daha yüksek bir zorunluluktur.
    1. Örneğin, K + 1 mM içeren tuzlu su kullanın. Bu konsantrasyon braketine, seri seyreltiler halinde 10, 1 ve 0.1 mM bir konsantrasyona kadar iyonu giderilmiş su içinde KCI toz çözülür. Bu kalibrasyon çözümlerini kullanın. Seçenek olarak ise, bu çözümlerin en az iki kullanın.
  2. Iyon seçici mikroelektrot ve her kalibrasyon çözeltisi içinde referans elektrot daldırın ve voltaj değeri özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize izin (Tablo 1).
  3. Yazılım bir txt dosyası olarak veri (amplifikatör çıkışı) olarak kaydeder, bir elektronik tablo dosyasına veri kopyalama. Logaritması karşı Mikroelektrot çıkışı (mV) Plotmol iyon konsantrasyonu (Şekil 2A).
  4. Doğrusal regresyon uygulayın ve Nernst eğim, kesişme ve R2 değerini hesaplamak. Nernst eğim tek değerli iyonlar için 58 ± 11 mV / on ve iki değerlikli iyonlar için 29 ± 11 mV / on ise mikroelektrot Kabul (katyonlar için, Nernst eğim anyonlar için negatiftir, pozitiftir). Ayrıca, iyi Mikroelektronlar güçlü bir doğrusal ilişki (Şekil 2B R 2> 0.9) olması gerekir.
    Not: Burada kullanılan amplifikatörün mV çıkış mV on kat kazanç okuma verir. Değerler on kat bölünmesi gerekir.
  5. Gerçek iyon konsantrasyonu (Şekil 2B) içine mikroelektrot ham mV çıkış dönüştürmek için lineer regresyon formülü kullanın.

İyon seçici Mikroelektrod Tekniği 3. Doğrulama

  1. Yapay kaynak hazırlanması
    1. Yapay kaynak kılcal aynı kılcal damarlar gibidirYukarıda. Isı adım 1.1.1 deki gibi bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak kılcal çekin.
    2. NaCI, KCI, 1 M çözelti, 200 ul, CaCI2 2H 2, O ya da pH 4 tamponu, bu kılcal Dolgu. Seçin iyon bağlı yapay kaynak çözüm (Tablo 1) ölçülecek.
      Not: Alternatif olarak, büyük uç çapı (~ 20 mm) ile elektrotlar çekin aynı çözümleri ile ucu doldurun ama% 0.5-1 agaroz içeren (agaroz çözüm herhangi bir toplu akışını önleyecektir).
    3. Bir mikromanipülatör yapay kaynaklı kapiler monte edin ve örneklerde iyon akışını ölçmek için kullanılan çözelti içinde bırakın. Gradyan stabilizasyonunu sağlamak için 1 saat kadar 30 dakika boyunca çözelti içinde yapay kaynak bırakın.
  2. Iyon seçici mikroelektrot Doğrulama
    1. İki ölçme işlemi için kullanılan çözeltide yapay kaynaklı kılcal ila yaklaşık bir santimetre uzaklıkta iyon seçici mikroelektrot daldırınörnekler üzerinde iyon akı yeniden ve daha önce olduğu gibi referans elektrodu ile devreyi kapatın. Gerilim değeri 1 ila 2 dakika süreyle özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize edelim. Bu değer, (aynı zamanda bir referans, arka plan veya boş değer olarak ifade literatürde) tamponu değerine karşılık gelir.
    2. Yapay kaynaktan yaklaşık 5 um iyon seçici mikroelektrot getirin ve 1-2 dakika için bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kayıt işleminden önce voltaj değeri 1 dakika ila 3 için stabilize sağlar.
    3. Yapay kaynak kılcal uzak 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ve 1280 mikron de iyon seçici mikroelektrot koyarak yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
    4. Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
  3. Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
    Hayırte: bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder. Yapay kaynaklı çözeltisi daha ölçülen türlerin daha fazla iyon içeriyorsa, konsantrasyon doğru (bu durumda, bir iyon akışının yönünü tespit etmek için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulamak uzakta, daha kaynağına daha yakın olmalıdır akış; yapay lavabo için, orta ölçme daha düşük spesifik iyon konsantrasyonu ile bu) akını olması gerekir.
    1. Difüzyon Fick yasasını kullanarak iyon akışını hesaplayın: J = c μ c çözeltide iyon konsantrasyonunu (mol cm -3) ise, μ iyon hareketlilik olduğunu (DC / dx) (mol cm N -1 sn -1) ve DC mesafesi dx (cm) (Şekil 2C) üzerine konsantrasyonu farktır. İyon akı veriler genellikle pmol cm -2 s sunulmuştur-1 Veya nmol cm -2 sn -1.
      Not:.. Smith ve arkadaşları 26 tarafından tarif edilen iyon akışı hesaplama için alternatif bir yöntem de kullanılabilir. Ana farklılıklar difüzyon katsayısı kullanımı yerine iyon hareketlilik ve numune olmadan tuzlu su çözeltisi içinde iyon akışının ölçümü hesaplanan arka plan iyon akı (ayrıca sürüklenme veya düzeltme faktörü voltaj) çıkarma sayılabilir.
    2. Kaynak (Şekil 2D) uzaklaştıkça karşı her bir aşama, iyon tozlar ortalamasını çizilir. Kaynağından uzaklaşan, iyon akı farklı büyüklüğünü algılamak için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulama akı değeri üstel azalma gözlemlemek.
    3. Büyük bir sinyal-n onun doğru yönü ve büyüklüğü ölçümleri doğrulamak için kaydedilen amaçlanan her bir spesifik iyon kez yapay kaynak doğrulama yapınOise oranı.
      Not: numune olmadan tampon iyon akışı ölçümü arka plan düzeyi veya gürültü gösterir. Tipik olarak, tampon ölçümü değişken yön gösterir çok küçük akı giden iyon konsantrasyonunun net dalgalanma gösterir.

Odası'nı Ölçme 4. hazırlanması

Not: deneyler öncesinde, örnek ölçülecek düşünün ve örnek nasıl monte edilir ve mikroelektrot ölçümleri için hareketsiz hale getirilecek.

  1. Xenopus oosit ölçümleri 800 um naylon örgü (Nitex örgü) içindeki bir 1 cm'lik bir karenin kesilmiş ve plastik Petri kabı (Şekil 1E) içine tutkal laevis için.

5. iyon akışı ölçüm

  1. Kalibrasyon çözeltisi ile aynı şekilde örnek ölçümler yapmak için kullanılan tampon içinde mevcut iyon konsantrasyonu ölçümü. X. laevis oositleri Mark'ın Modifiye Zil (MMR) gerektirir. D100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCl ve 5 HEPES: issolve NaCI, KCI, CaC, MgCİ ve deiyonize su içine HEPES (mM) bir son konsantrasyon elde etmek. NaOH kullanılarak 7.5'e tampon pH ayarlayın.
  2. Ölçüm odasına örnek yerleştirin ve mikroelektrot (Şekil 3A) yakın konumunu tanımlamak için micropositioner kullanarak (yaklaşık 10 mikron uzaklıkta) numune yakın iyon seçici mikroelektrot getir.
  3. Özel yazılımı kullanarak yakın pozisyonda ve uzak (uzak) örnek bir pozisyon arasında mikroelektrot düşük frekanslı (0.3 Hz) gezi (100 mikron) başlatın. Mikroelektrot hareketi örneğinin yüzeyine dik olduğundan emin olun.
    Not: mikroelektrot gezi yazılımına ayarlanabilir. Büyük gezi ölçüm süre boyunca küçük tozlar daha kolay bir algılama sağlayan okuma degrade örnekleme aralığı uzatır ve zamansal çözünürlüğe azalır artar. Görmek bir örnek için Şekil 3A.
  4. Yazılımını kullanarak kayıt başlatın. mikroelektrot her pozisyonda duraklar ve mV elektrik potansiyeli bilgisayarda kaydedilir. Sinyal stabilizasyon sağlayan, en az 2 dakika süreyle ölçümleri elde edilir. Kısa zaman atlamalı deneyler, bütün zaman elbette ilgi pozisyonunda rekor potansiyel varyasyonlar için.
  5. Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
  6. Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
    Not: Bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder.
  7. (Adım 3.3.1) daha önce olduğu gibi difüzyon Fick'in yasasını kullanarak iyon akı hesaplayın.
  8. Yeni bir örnek ölçümünden önce tampon ölçümü tekrarlayın ve her yeni için akı ölçüm ve hesaplama prosedürü tekrarlayınörneği.

6. İstatistiksel Analiz ve Veri Sunumu

  1. Ve / veya karışık etkileri 28 ile ANCOVA modelini kullanarak kontrol koşulu altında iyon akıları zaman konumunun bağımsız etkilerini test edin.
    Not: kovaryans analizi (ANCOVA) kategorik ve sürekli hem tedbirlerin bağımsız değişkenler olarak kullanılmasına izin düzenli ANOVA ve regresyon karıştırır genel lineer model. Buna ek olarak, bireysel ve nihai iç içe etkilerine göre tekrarlanan tedbirlerle uyarılan ilişkili hataların varlığında, karma etki modelleri hem sabit hem de rastgele etkilerin doğru tahminler modellemek için kullanılır.
  2. Çoklu test 28 için Bonferroni düzeltmesi ile grup düzeyleri arasında Student t-testi kullanılarak ikili karşılaştırmalar hesaplayın.
  3. Kutudiyagramlar pozisyonu ve zamana göre iyon akı ölçümlerini özetlemek oluşturun. Açıklanan ikili Öğrenci t p değerleri içerir(Şekil 3D), yukarıda ve aşağıda p değerleri anlamlılık düzeyini göstermektedir: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 29

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz daha önce kalsiyum akını tek hücre 24 yaralama sonra görünür olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, diğer iyon akıları tek hücre yaralama üzerine ortaya olup olmadığını sordu. Biz X'i kullanılan oosit, tek bir hücre yara iyileşmesi 30-34 ve elektrofizyolojik kayıt 24,35-39 için köklü bir model laevis. İlginçtir, potasyum iyonları X içinde daha konsantre olan laevis oosit (yaklaşık 110 mM) (MMR 1x: 1 mM) kullanılan hücre dışı çözelti içinde 40<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

in vivo olarak, hücre dışı, iyon akıları başarılı ölçümü için en kritik adımlar şunlardır: gürültüsünün azaltılması, iyon seçici Mikroelektronlar ve referans elektrotunun doğru imalatı, ve örnek ve her iki elektrot arasında konumlandırılması.

Gürültüyü en aza indirmek için, kayıt sistemi, tercihen de topraklı bir metal tepesinde (titreşim izolasyon) tablosu ile topraklı (topraklı) Faraday kafesi olmalıdır. Buna ek olarak, mikroskop şasi de topraklanmalıdır. Elektrik gürültü kaynakla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibesi MCB-0951199 ve kısmen NIH hibe EY01910, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü hibeleri RB1-01417 ve Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) hibesi SFRH/BD/87256/2012 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İyon Amp   BioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABDBioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABD tarafından oluşturulan amplifikatör yok; Benzer bir sistem şu adresten satın alınabilir: " XBL işlevi önemlidir" (http://www.xuyue.org/) veya " Daha Genç ABD" (http://www.youngerusa.com/) veya Uygulanabilir Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, ABD BioCurrentsResearch Center, Woods Hole, MA, ABD tarafından oluşturulan hiçbir yazılım; Benzer bir sistem şu adresten satın alınabilir: " XBL işlevi önemlidir" (http://www.xuyue.org/) veya " Daha Genç ABD" (http://www.youngerusa.com/) veya Uygulanabilir Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage ön amplifikatörü  BioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABDINA116BSR Voltaj İzleyici INA116, BioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABD tarafından tasarlanmıştır; Benzer bir sistem şu adresten satın alınabilir: " XBL işlevi önemlidir" (http://www.xuyue.org/) veya " Daha Genç ABD" (http://www.youngerusa.com/) veya Uygulanabilir Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABDX, Y ve Z konumlandırma için üç MicroStep sürücüsü gerekmez; BioCurrents Araştırma Merkezi, Woods Hole, MA, ABD tarafından oluşturulmuştur; Benzer bir sistem şu adresten satın alınabilir: " XBL işlevi önemlidir" (http://www.xuyue.org/) veya " Daha Genç ABD" (http://www.youngerusa.com/) veya Uygulanabilir Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
Manuel mikro konumlandırıcı ve nbsp;  Dünya Hassas Aletler Model KITE-RBenzer sistem şu adresten satın alınabilir: Uygulanabilir Elektronik (http://www.applicableelectronics.com/)
Manyetik stand     Dünya Hassas AletlerModel M10Benzer sistem Uygulanabilir Elektronik(http://www.applicableelectronics.com/)
Titreşim izolasyon tablosu   Newport Inc.         Model VW-3036-OPT-023040Benzer sistem Uygulanabilir Elektronikten satın alınabilir (http://www.applicableelectronics.com/)
Üç boyutlu mikro konumlandırıcının bir parçası: açılı braket, 90 derece;, oluklu yüzlerNewport Inc.         Model 360-90Üç farklı mikro konumlandırıcının montajı ayrıca X, Y, Z kontrolü için üç elektrikli döner motor, MCA-2 ayarlanabilir açılı direkli MPH-1 montaj kolu ve titreşim tablasına cıvatalamak için çeşitli Newport konektörleri ve vidaları gerektirir
Üç boyutlu mikro konumlandırıcının bir parçası: Peg Birleştirme Kırlangıç Kuyruğu Aşaması 0.5 inç X TravelNewport Inc.         460PD-Xyok
Üç boyutlu mikro konumlandırıcının bir parçası: Hızlı Montajlı Doğrusal Aşama, 0,5 inç XY TravelNewport Inc.460A-XYhiçbiri
Kwik-Fil ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlar filamentsiz Dünya Hassas Aletler TW150-4yok
Elektrot çektirmesi Narishige  PC-10yok
Metal rafEvde üretilmiştiryok10 cm'ye 15 cm'lik dikdörtgen çelik tabanda yarım santimetre aralıklı 2 mm genişliğinde delikler açılarak şirket içinde yapılan metal elektrot tutucu
FırınQLModel 10 Lab Fırınyok
Silanizasyon çözeltisi I Sigma-Aldrich85126Tehlikeli, sağlayıcı tarafından tavsiye edildiği şekilde kullanın 
Cam Petri kabı; PyrexFisher Scientific316060yok Elektrot
/mikropipet saklama kavanozuWorld Precision Instruments E215yok
Cam kurutucuFisher Scientific08-595EDrierite kurutucu içerir (WA Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, ABD). Hava geçirmez hale getirmek için vazelini contanın üzerine yerleştirin.
Plastik Pastör pipeti Fisher Scientific11597722yok
Bunsen brülörFisher ScientificS97329yok
Mikroskop lamıSigma-AldrichS8902yok
Düz mikroelektrot tutucuWarner InstrumentsQSW-A15P, altın 1 mm erkek konnektör ve Ag/AgCl tel ile
Düz mikroelektrot tutucu İçindeAgCl (Ag < sup> + < / sup >) pelet bulunan World Precision Instruments MEH2S ve altın 2 mm erkek konektör 
6 cm Petri kabıVWR60872-306yok
Nitex örgüDinamik Aqua-Supply Ltd.NTX750yok
Tutkal; Loctite epoksiVWR500043-451Tutkal ve sertleştiriciyi plastik bir tartı teknesinde eşit parçalar halinde karıştırın ve iyice karıştırın. Hızlı bir şekilde sertleşir, ancak tam kürlenme için 24 saat RT'de bırakılır
Deiyonize su Sigma-Aldrich99053yok
Sodyum KlorürSigma-AldrichS7653yok
Potasyum KlorürSigma-AldrichP9333yok
Kalsiyum KlorürSigma-AldrichC1016yok
Magnezyum KlorürSigma-AldrichM8266yok
HepesSigma-AldrichH3375yok
Sodyum HidroksidSigma-AldrichS8045yok
Potasyum AsetatSigma-AldrichP1190yok
AgarozSigma-AldrichA9539yok

Kaynaklar

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411(2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D yon Ak l myon Ak KalibrasyonuFick Dif zyon YasasMikroelektrot TertibatVoltaj Kay t D n myonofor Kokteyl Sol syonuBiyolojik rnek Konumland rmaPotasyum yon AkYara yile mesi Analizi

İlgili makaleler