Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

Summary

Zebra balığı safra güdümlü karaciğer rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları değerlendirmeye yardımcı olmak için, nitroredüktaz eksprese eden hepatositlerin metronidazol tedavisi üzerine genetik olarak ablasyon edildiği bir karaciğer hasarı modeli oluşturduk. Bu protokolde, hepatosit ablasyonunun ve biliyer güdümlü karaciğer rejenerasyonunun nasıl ustaca manipüle edileceğini, izleneceğini ve analiz edileceğini açıklıyoruz.

Abstract

Karaciğer yenilemek için büyük bir kapasiteye sahiptir. Hepatocyte- veya safra odaklı karaciğer rejenerasyonu: Hepatositler, karaciğer parankim hücreleri, iki yoldan biriyle yeniden olabilir. Safra odaklı rejenerasyonunda, rejenere hepatositler safra epitel hücreleri (BECS) elde edilir, buna karşın, hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyon olarak, rejenere hepatositler, önceden var olan hepatositler elde edilir. Hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyonu için, önemli ölçüde karaciğer rejenerasyonu güncel anlayışa katkıda bulunan mükemmel kemirgen modelleri vardır. Ancak, bu tür kemirgen modeli safra odaklı karaciğer rejenerasyonu için var. Biz son zamanlarda BECS yoğun şiddetli hepatosit kaybı üzerine hepatositlere doğuran hangi bir zebrabalıkları karaciğer yaralanması modelinde bildirdi. Bu modelde, hepatositler, özellikle bir farmakogenetik ile hassa bir şekilde çıkartılır. Burada hepatositlerini aşındırılması için ve BEC odaklı karaciğer rejenerasyon süreci analiz etme yöntemlerini detaylı olarak sunuyoruz.Bu hepatosit özgü ablasyon modeli daha safra odaklı karaciğer rejenerasyon altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar keşfetmek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemler, arttırmak ya da karaciğer rejenerasyonu bastırmak küçük molekülleri tanımlamak için kimyasal ekranlar uygulanabilir.

Introduction

Karaciğer oldukça rejeneratif organdır. Karaciğer rejenerasyon sırasında, hepatositler yenileyici, karaciğer parenşimal hücrelerinin, önceden mevcut olan hepatositler (hepatosit güdümlü karaciğer rejenerasyonu) ya da becs (safra güdümlü karaciğer rejenerasyonu) ^1,2 elde edilir. Karaciğer hasarı genellikle önceden varolan hepatositlerin çoğalmasını ortaya çıkarır; hepatosit çoğalması tehlikeye ancak, BECS ^2-4, hepatositlerin katkıda bulunabilir. Karaciğer rejenerasyon bu iki mod klinik olarak anlamlı olan. (Nedeniyle karaciğer tümörü veya canlı donörlerde örneğin,), insan karaciğer bir kısmının cerrahi olarak çıkarılmasından sonra, geri ....

Protocol

Zebra balığı, standart prosedüre göre kaldırdı ve yetiştirilen; Deneyler Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Embriyolar / larva hazırlanması 1.

1. Zamanlanmış çiftleşmelerin kurmak yetişkin erkek ve bayan Tg (fabp10a: CFP-NTR) yürütmek için ^s931 hemizigot veya homozigot balıklar O / N ve aralarında bir bölücü yerleştirin. Çiftleşme istendiğinde bu bölücü ertesi sabah çıkarın. Ince plastik örgü süzgeç kullanarak suyun süzme ile embriyolar toplayın.
2. Baş aşağı süzgeci çevirin ve bir sıkmak şişe dağıtılan yumurta su ince bir dere ile örgü yüz....

Results

3.5 dpf 5 dramatik azalma karaciğer boyutu (Şekil 1B) 36 saat (A36h, A ablasyon anlamına gelmektedir) için Mtz tedavisi. CFP-NTR ve fabp10a: Mtz arınma sonra, karaciğer rejenerasyonu (R), güçlü fabp10a başlangıcı olarak kabul DsRed ifadesi 30 saat (Şekil 1B) içinde göründü. intrahepatik safra ağı BECS ²² zarda mevcut olan ALCAM ifadesi ile değerlendirildiği gibi, başlangıçta çöktü, ancak 54 saat sonra-arınma (R54h) (Şekil 1C) yeniden kurulmu.......

Discussion

Şiddetli, ama hafif değil, hepatosit ablasyon safra odaklı karaciğer rejenerasyonu ortaya çıkarır. CFP-NTR transgen: Bu nedenle, Mtz tedavi ve annma süresini takiben, bu fabp10a gelen iç CFP floresan tespit edilebilir Mtz-, muamele edilmiş larvalarda, karaciğer boyutu incelenmesi önemlidir. Olmayan ablasyon (% 0-5) ya da kısmen (% 10-20) karaciğerler kesilip gösterecektir Mtz ile tedavi edilen larvalar küçük bir yüzdesi için, bu sıralamak ve sadece çok küçük bir karaciğer ile larvaları analiz için gere.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoik asit etil ester (Trikain) tozu	Sigma-Aldrich	A5040	0.4 (15 mM) trikain stoğu yapın: Yumurta suyu ile 100 mL'ye 0.4 g trikama getirin. pH 7'ye ayarlayın.
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazol	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehit	Sigma-Aldrich	252549
Kalsiyum sülfat dihidrat	Sigma-Aldrich	C3771
N-Feniltiüre (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Montaj ortamı (Vectashield)	Vektör Laboratuvarları	H-1000
100 x 15 mm petri kabı	Denville Bilimsel A.Ş.	M5300
şeffaf oje	Fisher Scientific	50949071
ince forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-20	Dumont #5
cam slayt	Fisher Scientific	12-544-1
cam lamel	Fisher Scientific	12-540-A ve 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (fare anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 seyreltme
keçi anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 seyreltme
sıçan anti-RFP	Alel Biyoteknoloji	ACT-CM-MRRFP10	1:300 seyreltme
AlexaFluor 647 AffiniPure Eşek Anti-keçi IgG (H + L)	Jackson laboratuvarları	705-605-147	1:500 seyreltme
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-fare IgG (H + L)	Invitrogen	A21240	1:500 seyreltme
Cy3 eşek anti-sıçan IgG	Jackson laboratuvarları	712-165-150	1:500 seyreltme
diseksiyon mikroskobu	Leica Microsystems	S6F
epifloresan mikroskobu	Leica Microsystems	M205FA
konfokal mikroskop	Carl Zeiss	LSM700
yumurta suyu			0.3 g/L deniz tuzu ' Anında Okyanus' ve 0,5 mM CaSO4 damıtılmış su.
[başlık]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4&orta nokta; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  Damıtılmış su ile 1 L'ye getirin. PH değerini ayarlayın 7.  121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav
1 x PBS'de 1X PBSDT			, %0.2 Triton X-100 ve %0.2 DMSO.
PEM tamponu			30.2 g BORULAR, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Damıtılmış su ile 1 L'ye getirin. PH 7'yi ayarlayın.
Bloke edici çözelti			: 1 ml ısıyla inaktive edilmiş at serumunu 9 ml 1X PBSDT ile karıştırın.