Burada, artefaktların donmasını önlemek için kas biyopsilerinin dondurulması, gömülmesi, kriyoseksiyonu ve boyanması için en etkili yöntemleri gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kas biyopsi histolojik değerlendirilmesi nöromüsküler bozuklukların patoloji gelişimi ve ilerlemesinde anlamada vazgeçilmez bir araç olarak hizmet vermiştir. Ancak, bunu yapmak için, uygun bakım eksize ve optimum boyama elde etmek için dokular korunması sırasında alınması gerekir. Doku koruma yöntemlerinden biri parafin mumu ile gömerek sonra formaldehit dokuları tamir ve kapsar. Bu yöntem de morfoloji koruyan ve oda sıcaklığında uzun süreli depolama için izin verir, ancak hantal ve toksik kimyasalların kullanımını gerektirir. Bundan başka, etkili bir immün için antijen alma protokolleri gerektiren antijeni çapraz bağlayabilen, formaldehit tespit sonuçları. Aksine, dondurulmuş kesit tespiti gerektiren ve bu nedenle, biyolojik antijen yapısını muhafaza etmez. Bu yöntem aynı zamanda intraopera gibi hızlı histolojik değerlendirme gerektiren durumlarda özellikle yararlıdır hale sefer hızlı sırayla ayrı bir avantaj sağlarCerrahi biyopsi tive. Burada farklı histolojik ve immünolojik lekeleri ile görselleştirme için kas biyopsisi hazırlamak en etkili yöntem tarif.
Giriş
Kas histoloji incelenmesi nöromüsküler bozuklukların 1-4 farklı anlamada kritik bir rol oynamaktadır. Diğer tekniklerle birlikte, bu araştırmacıların patoloji tezahürü ve ilerlemesinin daha iyi bir fikir almak için ve aynı zamanda bir terapötik müdahale 5-10 etkinliğini değerlendirmek için gerekli olabilir izin verir. Eksizyon hemen önce fizyolojik durumunu korumak amacıyla Ancak, doğru olması için, dokular uygun şekilde korunması gerekir. Bu kaldırma, koruma, kesit ve boyama esnasında büyük dikkat gerektirir.
Dokular, ışık mikroskobu çalışma için iki farklı yolla hazırlanabilirler. (FFPE) bölümleri, gömülü ilk yöntem, formalin sabit parafin dokularının parafin mumu 11,12 ile gömülü önce% 10 doğal tamponlu formaldehit sabit gerektirir. tespit aşaması aynı zamanda çapraz bağlantılar endojen pr daha iyi morfolojisi korumak için yardımcı oluroteins böylece immün için karmaşık antijen alma prosedürleri gerektiren ve bu bölümlerde 12 enzimatik boyama olasılığını ortadan kaldırır. Dondurulmuş kesitler, diğer taraftan, önceden sabit veya işlenmesine gerek yoktur; Bu nedenle, proteinler doğal biyolojik konformasyonlar 13,14 muhafaza edebiliyoruz. Bundan başka, dondurulmuş kesitler de bazen sarkomlar ve diğer cerrahi biyopsi 15, ameliyat tanısında, örneğin gerekli olan hızlı gerçekleştirme süresi, izin verir. Düzgün yapılmazsa Ancak, bu yöntem histolojik inceleme için bölümler elverişsiz hale kas mimarisi değişiklikleri tanıtır zararı, don eğilimli. Bu kağıt düzgün muayene için en uygun boyama elde etmek için kas biyopsi hazırlamak için en etkili yöntem açıklayacağım.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Doku Hasat ve kas Dokuların Donma
- Izofluran (2-kloro-2- (diflorometoksi) -1,1,1-trifloro-etan) aşırı dozda fare öldürülür. Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin ve böyle bir kurutucuda veya izofluran batırılmış bir pamuklu çubuk içeren bir fanus gibi bir ikincil çevreleme yöntemini kullanın.
- Sıkıca Kapkaççı sıkarak ölümü onaylayın. Böyle servikal dislokasyon olarak ötenazi ikincil yöntemi kullanın.
- Kaslar gevşek saç tellerinin yapışmasını azaltmak için% 70 alkol ile kürk ıslatın. Böyle 5. olarak ince bir forseps kullanarak uzuv kapalı cilt soyma.
- Dikkatle, altından kemiklerden (bu durumda tibialis anterior (TA)) ilgi kas ayrı tendonu başlayarak çıkarın.
- , Kas tüketim OCT (Optimum Kesme Sıcaklığı bileşik) onu karşılamak ve etiketli atılabilir dondurma kalıp üzerinde düz yatıyordu. Kas tai için normal fizyolojik oryantasyon (başında olduğundan emin olungermeden l). Alternatif olarak, küçük strafor karelere kas dondurmak ve kasların doğru uzunluğunu sağlamak için böcek işaretçilerine kullanarak pin.
- Sıvı azot kullanılarak çelik beherglasta 2-metilbütan (izopentan) soğutun. 5 dakika - Bu ortalama 3 alır. Beyaz çökeltiler beher alt ve duvarlarında oluşturmak başlayana kadar aralıklı karıştırarak tutun.
NOT: Bu durumda, izopentan uygun donma sıcaklığına ulaşmıştır (-150 ° C) - Soğutulmuş 2-metilbütana kasları içeren kalıpları batırın. 20 sn - 15 gastroknemius soleus (GS) ve triceps gibi 12 sn ve daha büyük kaslar - Böyle diyafram ve ekstansör digitorum longus 6 (EDL) gibi küçük kasları dondurun. Çok uzun bu çatlama neden olabileceğinden için kasları donma yok.
- Kuru buz üzerinde donmuş dokuları aktarın ve izopentan buharlaşması (bu işlem etrafında ortalama 15 alır unutmayın - 20 dakika) izin verin. Alüminyum folyo dokuları sarın ve u saklayınlökotrien antagonistlerinin düşük sıcaklık kesit kadar (-70 ° C ila -80 ° C).
2. Doku Blok Hazırlanır OCT Dokuları katıştırma
- Kuru buz üzerinde Taşımacılık dokuları çözülme önlemek için cyrostat için. Doku transferi ve bunları, 30 dakika için dengelenmeye bırakın (doku tam çözülme önlemek için -20 -24 ° C'ye ayarlanmış) bölme kriostada.
- Peltier defne soğutma açın. Kriyostat bu soğutma yoksa, hızlı OCT dondurmak için aerosol soğutma sprey kullanın. Bu donma hasara yol açabilir olarak gömme sırasında herhangi bir noktada kas çözülme izin vermeyin.
- Örnek diskte Ekim düzgün bir ince katman ekleyin ve soğumaya bırakın. OCT en durumdayken sıvı üst alt donmuş zaman, (boyuna kesitler için OCT enine kesitler ve paralel için OCT dik) doğru yönde de doku yerleştirin. Hızlı OCT dondurmak için aerosol soğutma sprey kullanın. Isı ext ile doku unembeded bölümünü dokununreaktöre verilmiş ve 45 saniye bekleyin.
- , Kas çevresinde Ekim başka ince bir tabaka ekleyin aerosol soğutma sprey ile sprey ve bir önceki adımda olduğu gibi ısı ayıklayın.
- Bütün kas kaplıdır kadar sprey ve ısı çıkarıcı soğutma aerosol bir arada kullanarak Ekim dondurmak hızla küçük artışlarla Ekim ekleyerek tutun.
- Doku bloğun üstünde ısı çıkarıcı koyun ve 5 dakika bekleyin.
3. Bölüm hazırlanması ve Kasların Orta göbek Bölgesi'nden Bölümler belirlenmesi
- Numune kafasına örnek monte edin. Diski sabitlemek için topuzu sıkın. Numune disk numune kafası ile iyi temas halinde olduğundan emin olun.
- ° -21 ila -24 ° C'ye odası sıcaklığını ayarlamak ve ayarlanan sıcaklık elde edilene kadar bekleyin.
- Kalınlık ayarlarını (7 mikron) ayarlayın; ilerleyen ya da kaba ve ince ayarlarını kullanarak bloğu geri çekilmeden tarafından blok kırpın.
- Bölümleri toplayınüzerinde slayt kesme bölümlerinin yapışmasını kolaylaştırmak için zıt ücretleri arasındaki cazibe kullanarak bölümleri üzerine slayt üst basarak pozitif yüklü mikroskop slaytlar önceden ısıtılmış.
- Bölümlerin enine kesit alanı (CSA) ölçerek orta göbek bölümleri tanımlamak. Mikroskop bağlı olduğu bilgisayarda bu kullanarak görüntüleme yazılımı yapın.
NOT: Faz kontrastlı görüntüler alınır ve tüm kas çevresi yazılım programına bir izleme fonksiyonu üzerinden ölçülür. Bu, her iki CSA ve asgari gelincik çapı ölçümleri (bir tanecik karşıt taraflarında iki paralel teğet arasındaki en küçük mesafe olarak ifade edilir lif enine kesit boyutunun ölçü) ürün elde edilir. Not: CSA ve minimum gelincik çap ölçümleri plato başladığınızda, orta göbek ulaşıldı. - Envanter gelecekteki boyama -80 ° C'de slaytlar arşivlemek ve.
NOT: lekelenme için Ekim öncesinde kaldırılması gerekmezg işlemleri. Slaytlar kaplandı sonra, hemen boyanabilir hazırız.
4. Boyama
NOT: Ayrıntılı adım adım prosedürleri ürün veri sayfasında bulunabilir ve boyama işlemleri için takip edilmesi gerekirken, kişisel optimizasyon optimum boyama elde etmek için gerekli olabilir.
- Ortam (tabloya bakınız), montaj, su ile karışmayan olduğu için, (% 70,% 95 ve% 100 etanol içinde 2 dk) alkol artan sınıflar üzerinde kaydığı dihidrat ve ksilen (5 dakika için% 100) sağlamak için bunları temizlemek slaytlar zamanla opak olmazlar.
- Bölümleri lamel ve kurumaya bırakın. Mikroskop ile görüntü görüntüleme yazılımı ile donatılmış.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
hasat ve dokuların dondurulması için set-up Şekil 1'de görülebilir. Kesilen dokular kurutma (Şekil 1A) önlemek için PBS batırılmış bir gazlı bez üzerine saklanmalıdır. Dokular da doğru morfolojisi (Şekil 1B) sağlamak için Ekim batırılmış ve cryo kalıp düzenlendiği doğru yönde ve mümkün olduğunca fizyolojik uzunluğuna yakın olmalıdır histolojik analiz için kullanılmak üzere seçildiğinde. Bir doku dondurma için müsait izopentan Çamur daha sonra sıvı azot içinde izopen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Histoloji ve immünohistokimya çeşitli nöromüsküler bozukluklar tezahürü ve patoloji ilerlemesini anlamada anahtar bir araç olarak kullanılmıştır. Klasik kas biyopsileri ilk formaldehit sabit ve daha sonra parafin mumu ile gömüldü. Formaldehit tespit mimari dokusu koruyan ve oda sıcaklığında doku depolama ve taşıma izin verirken, aynı zamanda doğru immün elde etmek için daha ileri adımlar gerektiren enzimler ve çapraz bağlarının proteinleri inaktive eder. Bu sorun donmuş kesitlerin kullanımı ile elimine edilir ancak bu y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
El yazması revizyonları için Alex Miller'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cure CMD, Muscular Dystrophy ile Mücadele (SAM) ve Muscular Dystrophy Association'dan (218938) M.G.'ye verilen araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kriyostat | Leica CM 1850 | Leica Mikrosistemler A.Ş. | Buffalo Grove, IL 60089 ABD, ofis telefonu 1-800-248-0123 Alternatif: Richard Allen Scientific |
| Mikroskop | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 ABD, Telefon: 1-631-547-8500 Alternatif: Olympus |
| Görüntü analiz yazılımı | Nikon Görüntüleme Yazılımı Temel Araştırma | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Yolu, Melville, NY 11747-3064, ABD, Telefon: 1-631-547-8500 Alternatifler: Görüntü J, Metamorf |
| İzofluran | 14043-220-05 | JD Tıbbi Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Bulvarı, Phoenix, AZ 85029 ABD |
| EKİM | 4583 | Sakura A.Ş. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternatif kaynak: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Tek kullanımlık doku kalıbı | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slaytlar | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Aseton | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Ladin Caddesi, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Etil alkol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| 2-metil bütan | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Ladin Caddesi, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific |
Kaynaklar
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
