Engineered Ön Çapraz Bağ Greftlerinin Değerlendirme Atimik Rat Modeli

Özet

Hayvan modelleri, doku mühendisliği yapılmış greftlerin değerlendirilmesi için önemli araçlardır. Bu makale, ön çapraz bağ dokusu mühendisliğinde kullanılmak üzere elektroeğrilmiş biyobozunur polimer greft hazırlama protokolünün yanı sıra bir sıçan modelinde implantasyon için bir cerrahi protokol sunmaktadır.

Özet

Ön çapraz bağ (ÖÇB) yırtılması, ÖÇB'nin müdahale olmadan iyi iyileşmemesi nedeniyle sıklıkla ameliyat gerektiren yaygın bir bağ yaralanmasıdır. Mevcut tedavi stratejileri, her biri kendi ilişkili sınırlamalarına sahip olan otogreft veya allogreft ile ligament rekonstrüksiyonunu içerir. Bu nedenle, ÖÇB rekonstrüksiyonunda kullanılmak üzere doku mühendisliği yapılmış bir greft tasarlamaya ilgi vardır. ACL doku mühendisliğinde kullanılmak üzere elektrospun polimer greftin imalatını açıklıyoruz. Bu polikaprolakton greft biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir, gözeneklidir ve hizalanmış liflerden oluşur. Böyle bir grefti değerlendirmek için bir hayvan modeli gerekli olduğundan, bu makale, ksenojenik hücrelerle tohumlananlar da dahil olmak üzere tasarlanmış greftleri değerlendirmek için kullanılabilecek bir eklem içi atimik sıçan ACL rekonstrüksiyonu modelini açıklamaktadır. Ameliyat sonrası 16. haftada temsili histoloji ve biyomekanik test sonuçları sunulurken, greftler implantasyondan hemen sonra test edilir ve kontralateral doğal ÖÇB'ler kontrol görevi görür. Bu çalışma, doku mühendisliği yapılmış ÖÇB greftlerini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir hayvan modeli sunmakta ve ÖÇB rüptürünün tedavisinde rejeneratif tıp yaklaşımının potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Ön çapraz bağ (ACL) yırtılması diz ¹ en yaygın bağ yaralanmaları biridir. Rüptüre ACL'lere cerrahi müdahale olmadan iyileşmek mümkün olduğundan, günlük yaşam yanı sıra spora katılım faaliyetlerine sınırlamalar yılda bir milyar dolar ³ tahmini maliyeti, her yıl ² ameliyat 175,000 üzerinde hasta götürmek. Şu anda, otogreft veya allogreft tendon ya bağ rekonstrüksiyonu için kullanılır. Yüksek başarı oranları hem otogreft ve allogreft replasmanı ile elde edilebilir olsa da, ciddi komplikasyonlar bu rekonstrüksiyon seçenekleri ⁴ ile ilişkilidir. Otogreft dokusu, özellikle yeniden rüptür veya çok bağ yaralanma durumlarda, donör sitesi morbidite ile ilişkilidir ve arz sınırlıdır. Öte yandan, alograft doku gecikmeli aşı entegrasyonu, yan inflamatuar yanıtı, teorik enfeksiyon riski, ve sınırlı Supp ile bağlantılıdırly ^5. Sentetik olmayan parçalanabilir greftler 1970 ve 1980'lerde geliştirilen, ancak erken greft rüptürü, yabancı cisim reaksiyonu, osteoliz ve sinovit ⁶ engel edildi. Bu ciddi kaygılar sonucunda, Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik kullanıma sentetik greftler şu anda.

Nedeniyle mevcut greft seçenekleri ile ve biyoloji, mühendislik ve rejeneratif tıp son gelişmeler bu sınırlamaları, ACL aşılama için bir doku mühendisliği çözeltide büyük ilgi olmuştur. Güncel doku mühendisliği stratejileri kalıcı sentetik malzeme implantasyonu ⁷ ile ilgili sınırlamaları kaçınarak konak doku gelişimine izin vermek için parçalanabilir biyolojik ve sentetik malzemeler kullanır.

Polikaprolakton (PCL), FDA yapışma bariyer dahil olmak üzere tıbbi uygulamalarda bir dizi için onaylanmış ve ⁸ pansumanla olan biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer, bu u olmuşturvasküler, kemik, kıkırdak, sinir, deri ve özofagus doku mühendisliği ^5,9-16 olmak üzere geniş bir uygulama çeşitli sed. Uygun biyolojik uyumluluk, nispeten uzun bir in vivo yarı-ömrü, uygun bir mekanik mukavemet ve yüksek elastikiyet doku mühendisliği Bu polimerin popülerlik katkıda bulunur. Yara iyileşmesinin bir kemirgen modelinde, implante electrospun PCL olmayan immünojenik olduğu ve yan etkileri ^13, yerel doku içine entegre olduğu gösterilmiştir. Electrospun PCL bir SEM görüntüsü, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

Hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde geçerli FDA düzenleyici standartlar, etkinliği ve güvenliği ile Amerika Birleşik Devletleri'nde klinik çalışmalarda içine taşımak için PCL veya başka herhangi bir mühendislik ACL grefti için gerekli olacaktır. Ayrıca, in vivo koşullar genellikle in vitro doku mühendisliği ACL greft özelliklerini artırabilir. Fleksör digitor ile otolog Rekonstrüksiyon bir sıçan modelium longus tendonu daha önce yerel bir ACL, kesilmiş Femoral ve tibial tünel delinmiştir ve aşı geçirildi ve ameliyat dikiş ipliğinin ^17-22 ile yerine tespit edildi ki, tarif edilmiştir. Bu yazıda, mühendislik ACL değiştirmeleri değerlendirilmesi için yerine otogreft-tabanlı yeniden (Şekil 2) için bu modelin bir değişiklik anlatacağız.

Birçok hayvan modelleri bağ doku mühendisliği için mevcut olmasına rağmen, sıçan nedenlerle bir dizi için büyük modellere göre avantajlıdır. Bu avantajlar kolay hayvancılığı ve kullanım, daha az etik hususlar ve düşük maliyet ^17,23 içerir. Buna ek olarak, fare modeli kıkırdak, tendon ve kemik doku mühendisliği ²⁴ de dahil olmak üzere ortopedik doku rejenerasyonu için bir model olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Özel olarak, atimik çıplak sıçan nihai implantasyon o sağlayan, hücre-aracılı bağışıklık karşılığının ²⁵ kendi eksikliği nedeniyle seçilmiştirBu modelde f ksenogeneik donör hücreleri gelecekte daha da mühendislik greft geliştirmek için. Bu yöntemler yazıda ACL rekonstrüksiyonu bir atimik sıçan modelinde imalat ve acellular implantasyonu, biyolojik olarak parçalanabilen polimer greft tarif.

Protokol

NOT: Tüm hayvan deneyleri ameliyatları başlamadan önce yerel veteriner personeli ve hayvan kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır.

Electrospun Polikaprolakton iskelelerinin hazırlanması 1.

1. A% 10 oluşturmak için 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol içinde granül halinde tıbbi sınıf esteri sona poli (ε-kaprolakton) tartılır ve çözünmesi PCL polimer çözeltisi ağırlık /. Homojen bir çözelti sağlamak için, en az 3 saat süreyle bir karıştırma plakası kullanılarak çözelti kaynamaya bırakılır.
2. PCL çözüm Electrospin iskele imalatı için son derece uyumlu PCL liflerin bir manşet oluşturmak için.
   1. Her zaman üzerinde fan ile bir kimyasal davlumbaz elektrospinning kurulum hazırlayın. Bu, bir gerilim kaynağı, motorlu toplama mandrel ve bir vakum portu tarafından tahrik edilen bir kaynak, PCL çözeltisi için giriş noktaları elektro işlemi için izole edilmiş bir vakum ortamı olarak hizmet etmek ve var olan büyük bir akrilik bir kutudan kutudan oluşmaktadır. Akrilik temizleyinc kutusu iyice etanol ile ve electrospun ürünün kalitesini bozabilir herhangi kirleri çıkarmak için Parafilm levhalar ile tüm yüzeyleri örtün.
   2. Bir küt bir 10 ml şırınga yukardaki çözelti yük, yaklaşık 3 mi 18 g, 1 ½ inç iğne sona erdi. Şırınga yukarı iterek hava kabarcıklarını çıkarın. Programlanabilir şırınga pompası içine Kilit çözüm. Gerilim kaynağı tel takılması için akrilik kutunun dışında ½ iğne inç bırakarak akrilik kutuya küçük bir delikten iğne takın.
   3. Çok hizalanmış PCL elyaflar için toplayıcı olarak 30 mm dönen torna mandrelini kullanın; alüminyum folyodan oluşan ince bir şerit ile sıkıca mandrel kapsamaktadır. Yaklaşık 15 cm uzakta şırınga iğnesi kutusunun karşı tarafında motora mandrel kilitleyin.
   4. Vakum portuna plastik hortum takın ve davlumbaz vakum kaynağına bağlayın. Vakum kaynağı açın ve bir kapak ile akrilik kutusu kapağı.
   5. Sve 2.5 ml / saat programlanabilir şırınga pompa infüzyon hızı. 3,450 rpm'de mandrel işletmek ve bir timsah klibi kullanarak kutunun dışında iğne ucu gerilim kaynağının pozitif kurşun takmak için motorun açın.
   6. PCL çözümünün infüzyon başladıktan sonra, gerilim kaynağı açmak ve bir 20 kV çalışma gerilimi ayarlanır.
   7. PCL çözeltisi, 0.5 ml, homojen bir manşet oluşturmak için 12 dakika boyunca solüsyon infüzyonu.
      Not: Ortalama olarak, her bir kol ağzı üç ya da dört-katmanlı yapı iskeleleri bir toplam oluşturmak için kullanılabilecek iki altı şerit levha oluşturmak için yeterli electrospun malzemesine sahiptir.
3. Lazer düşük vakum ayarı, 10.0 keV iniş gerilimi, 6.4 mm çalışma mesafesi ve 3.0 prob çapında işletilen bir VersaLaser Kesici 2.3 birden fazla küçük yaprak oluşturmak için PCL manşet kesti.
   NOT: Bu örnekte, bir bilgisayar destekli tasarım x 35 mm x 150 mm iskeleleri ile 1.5 mm arasında birden fazla yaprak elde etmek için kesici talimat için kullanılaneşit% 15 gözenek alanı 150 mikron çaplı delikler dağıttı.
4. Plazma iyon ivme ile PCL yüzeyinin hidrofilikliğinin ikna etmek için bir plazma temizleyici kullanarak PCL iskeleleri etch. 450 mTor ve tedavi yüksek güç (29.6 W) 30 saniye iskeleleri vakum ayarlayın.
5. Steril bir ortamda% 70 etanol içinde iskeleleri batırın.
6. Coat kollajen ile bireysel iskeleleri in vivo hücre yapışmasını ve çoğalmasını kolaylaştırmak için.
   1. 4 ° C'de 1x PBS, 9: 1: Purecol kollajen 3 mg / mL standart solüsyon, 10x PBS ve 0.1 N NaOH 1 2.5 steril çözelti 8 seyreltilmesiyle kollajen kaplama çözeltisi oluşturur. Çözelti homojenliği sağlamak için iyice karıştırın.
   2. Kaplama tek 1,5 mm x 35 mm x, yukarıdaki kolajen çözeltisi, bir ince tabaka filmi ile 150 um iskeleleri. Steril bir ortamda 24 saat kurumasını bekleyin.
7. 5-0 Vicryl sütür kullanarak, yığın ve dört ayrı 1,5 mm x 35 mm x 150 mm iskeleler tutturmakBir Krackow implantasyon için hazır bir son 0.6 mm kalınlığında, çok katmanlı, kolajen kaplı iskele oluşturmak için dikiş kullanılmıştır.

2. Sıçan Cerrahi Protokolü

1. Inhalasyon odasında sıçan yerleştirerek ve 2 L / dk oksijen ile% 2 izofluran sunarak anestezi neden olur. Sıçan onaylayın yeterince ayak hind basınç uygulayarak ve herhangi bir yanıt değerlendirilmesi anestezi uygulandı.
2. Non-steril arka masada, deri 25 mg / kg ampisilin ve 0.03 mg / kg buprenorfin enjekte.
3. Gözleri oftalmik merhem sürün. Operatif arka bacak kürk Klip ve üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 etanol ile cerrahi siteyi hazırlık.
4. Hipotermi önlemek için ısıtılmış bir pad üzerinde, ameliyat masasına sıçan aktarın. Güvenli burun konisi ve 2 L / dk oksijen içinde% 2 izofluran ile prosedür aracılığıyla teslim burun konisi anestezi korumak. Maruz kalan ameliyat uzvu bırakarak, steril bir şekilde örter.
5. Cerrahi başlamadan önce, ilk olarak ayak basıncını hind bir yanıt eksikliği ile yeterli anesthetization onaylayın.
6. Patella düzeyinde merkezli diz 2 cm uzunluğunda dikey kesi medial, emin olun. Kesi diz üzerine merkezli kadar yanal cildi geri çekin.
7. Sadece patella medial kesme ve kuadriseps ve distal tibia tubercule üzerinde patellar tendon ekleme seviyesine Musculotendinous kavşak seviyesine proksimale uzanan bir medial parapatellar artrotomi yapmak için bir neşter kullanın. Patellar veya kuadriseps tendon kesmek için değil dikkat edin.
8. Patellar tendon sadece lateral diz kapsülü ile 1 cm dikey kesi yaparak yanal Yayın patella.
9. Diz uzatılmış olduğundan emin olun. İnce bir makas alın ve lateralden mediale doğru patella altında geçmektedir. Ekstansör mekanizması iki tarafında tercüme edilebilir, böylece makas birkaç kez yayıldı.
10. T esneme sırasındaO diz, diz ekleminin iç maruz yanal Patellayı çevirmek. Interkondiler çentik ve femur kondillerin açık görselleştirme olun. Bir neşter kullanarak, çentik ACL ve PCL transect.
11. 1.6 mm'lik K-teli ile yük güç matkap. Interkondiler çentik ACL kökeni k-tel ucunu yerleştirin. Superolaterally delmek ve bir neşter gibi gerekli her türlü yumuşak doku çıkarılması, femur lateral üzerindeki çıkış noktasını görselleştirmek. Greft için açık geçiş sağlamak için ve bir kaç kez dışarı k-teli geçirin.
12. Tibia plato ACL ayak izi k-teli yerleştirin. Anterolateralinde Matkap ve anterolateral proksimal tibia üzerindeki çıkış noktasını görselleştirmek. K-telli tibia çıkar nokta tam görüntülenmiştir böylece gerekli yumuşak doku temizlemek için neşter kullanın.
13. Femur kemik tünelden (ideal olarak en fazla 2 santim uzunluğunda) kısaltılmış Keith iğne geçirin. K gözünden greft bir ucundan iki ameliyat dikiş ipliği ucu Konueith iğne. Femoral tünelden greft bir ucunu çekin iğne kullanın.
14. Tibia tünelden greft diğer ucunu geçmek önce adımı tekrarlayın.
15. Bir figür sekiz-dikiş ile periost veya diğer yumuşak doku çevreleyen greft femur ucunu tutturmak için 4-0 Vicryl dikiş kullanın. Manuel gerginlik uzantısı diz greft. Bir figür sekiz-dikiş ile periost veya diğer yumuşak doku çevreleyen greft tibia ucunu yapıştırın.
16. Figür sekiz-dikiş geçmişte her ucunda 1-2 mm bırakarak, her iki ucunda aşırı greft kesmek için bir makas kullanın.
17. Diz uzatın ve patellanın azaltır. 4-0 vicryl kullanarak, patellanın lateral subluksasyon önlenmesi, medial eklem kapsülü kapatmak için tek bir figür sekiz-dikiş yerleştirin.
18. Altta yatan kas dikiş değil özenle, bir çalışan subkütiküler 5-0 monocryl veya Vicryl dikiş ile cilt kapatın veya deri kapatıldıktan sonra herhangi bir görünür dikiş var.
19. Injederi altından buprenorfin ile ct sıçanlar ameliyat sonrası üç günlük bir toplam için her 12 saat. Enjeksiyon sırasında herhangi bir drenaj cerrahi sitesini veya yaranın yarılması edin. Aksama ve bazı şişme ameliyat sonrası ilk birkaç gün içinde normal, ama derhal veteriner kadrosu ile birlikte herhangi bir postoperatif endişeleri gidermek. Cerrahi kesiler tamamen iyileşmiş zaman hayvan, ameliyat sonrası 2 hafta sosyal konut dönmek olabilir.

3. Veri Toplama Protokolü

1. Hayvanlar öldürüldükten hemen sonra, torakotomi ve ardından kapalı bir _CO2 odası içinde tek tek fareleri boğmak.
2. Kalça ekleminde ayırarak cerrahi yeniden ve kontralateral bacaklarda hem Hasat.
   1. Yeniden bacaklarda için, sadece femur, tibia ve greft izole ince diseksiyon ile, arka çapraz bağ ve cerrahi kesintiye yerli ACL'DEN kalıntıları da dahil olmak üzere, tüm yumuşak doku kaldırmak.
   2. kontralateral bacaklarda için, yerli ACL dışındaki tüm yumuşak doku yanı sıra ince diseksiyon ile femur ve tibia çıkarın.
   3. Femur graft kaval kemiği kompleksinin her bir ucundan kemik ¾'ünü 1 cm, ancak kaldırmak için, bu tür Dremel gibi bir döner alet kullanın.
   4. Bu süreçte ve biyomekanik test boyunca, düzenli ve sık sık yanlış sonuçlara değiştirebilir hasat diz kuruma önlemek için normal tuzlu su ile bağ bölgeleri sprey.
3. Histolojik analiz için, 48 saat süre ile 25 ° C'de ayrı ayrı% 4 paraformaldehit solüsyonunda her diz düzeltin. Daha sonra, tam yumuşatma için Immunocal reaktif bir çözelti içine daldırmak diz; Bu süreç örnek kalsifik içeriğine bağlıdır ve beş gün kadar sürebilir. Örnek kalitesini düşürebilir eksik yumuşatma gibi ilerlemeyi değerlendirmek üzere günlük bireysel örnekleri kontrol edin. İstediğiniz gibi, kesit gerçekleştirmek, slayt montaj ve boyama tamamlandıktan sonra.
4. Perform biyomekanik test doku mühendisliği bağın fonksiyonel kapasiteyi değerlendirmek için.
   1. Ayrı ayrı kemiğin epifiz yaklaşık 28 G galvanizli çelik tel sararak femur ve tibia sabitleyin. Bu kemikte ziyade ilgi bağın numunenin erken çekme hatasından yanlış biyomekanik test verileri önlemektir.
   2. Karışım polimetilmetakrilat (PMMA), kemik çimentosunun karışımı içine femur. Bunu yapmak için, iki çimento bileşenleri karıştırmak ve hemen tamamen serbestçe çıkıntılı epifiz ve ekli ligaman ile çimentolu tencerede kemik gövdesini saran, metal içine femur sabitlemek için viskoz karışımı kullanın. Spontan serbest radikal polimerizasyon yavaş yavaş bir hamur malzeme ve sonunda bir katı sertleştirilmiş matris içine karışık viskoz bileşenleri dönüştürmek için izin ver.
      NOT: Bu işlem birkaç dakika sürer ve el ile yapılan bir bolus sıcaklığının değerlendirerek izlenebilirGeri kalan çimento; Sıcaklık geçici ekzotermik polimerizasyon reaksiyonu sırasında artırmak ve malzeme katılaşır sonra RT azalır gerekir.
   3. İdeal mekanik test için 20 ° fleksiyonda diz bağı korurken dışında, tibia çimentolama yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
   4. Bir gerilme test cihazının üzerine çimentolu femur graft tibia kompleksi monte edin ve başarısızlığa gerilim başlangıcından, zamanın bir fonksiyonu olarak kayıt yükü ve yer değiştirme için hazırlar. Bu örnekte, bir 1 kN yük hücreli bir Instron Model 5564 kullanılır.
   5. Ön gerilimi, 0.5 N / dk'lık bir rampa oranında 2 N aşı ve daha sonra 0.5 mm / sn arasında bir gerilme oranında başarısızlığa greft test edin. Sürecinde, bağ orta-madde de başarısız olduğunu ve kemik femur ve tibia güvenli olduğunu ve erken yanlış test bağın biyomekanik özelliklerini değerlendirmek olabilir, başarısız değil emin olun.
   6. Oluşturulan yük deplasman kullanıneğrileri test ligament yetersizliği yükünü ve sertliği hesaplamak için.

Sonuçlar

Tek bir cerrah tarafından 92 sıçan ameliyatları bizim deneyim, yara tamamlanmasına kesiden ameliyat süresi ortalama 4.7 dakika bir standart sapma ile, 16.9 dakika idi. Hayvanlar öldürüldükten hemen sonra, fareler 356 ± 23 g ağırlığında. Tüm sıçanlar iyi cerrahi tolere, ve hiçbir komplikasyon yaşadı. Ameliyattan hemen sonra, sıçanlar operatif ekstremitede ağırlık vermeye kaydetti, ama hafif bir topallama sergilendi. Bir hafta sonrası ameliyat, tüm sıçanlar kayda değer topallayarak yürüyebilen. Bütün hayvanların beslenme,...

Tartışma

ACL yaralanmaları şu anda yeniden inşası için sınırlı seçenekler ile ortopedik spor cerrahisinde sık görülen bir durum vardır. In vivo olarak yeniden oluşturulmasına izin olacak ACL için uygun bir doku mühendisliği vekil geliştirmek amacıyla, uygun bir hayvan modeli gereklidir. Bir atimik sıçan ACL yeniden tekrarlanabilir bir modeli kullanarak, in vivo implantasyonu olduğu gibi bu çalışmada, biyolojik olarak parçalanabilir bir mühendislik aşı imalatı tarif edilmektedir. Bu model, hücresel greft ve anon...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tıbbi sınıf ester uçlu poli (ε-kaprolakton), granül form (MW = 110,000)	Lactel Absorbable Polymers		İstenen moleküler ağırlığa göre özel sentezlenmiş polimer
1,1,1,3,3,3-hekzafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	105228	PCL polimeri için çözücü
18 G x 1½" eğimli iğne	BD Medical	305196
Uzaktan İnfüzyon/Geri Çekim Programlanabilir Şırınga Pompası	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 Lazer Kazıma Makinesi	Microgeo USA	VLS2.30
Genişletilmiş Plazma Temizleyici 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	Yüzey modifikasyonu için kolajen kaplamadan hemen önce plazma aşındırma
PureCol Kolajen Standart Çözeltisi, 3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	PureCol, 10x PBS ve 0.1 N NaOH'tan oluşan 8:1:2.5 oranındaki çözeltiyi 1x PBS içinde 1:9 oranında karıştırın
Sütür, 5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
Sütür, 4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
Sivri uçlu Diseksiyon Makası (Düz; 4.5 inç)	Fisher Scientific	8940
Buprenorfin hidroklorür	Sigma-Aldrich	B9275	Ağrı kontrolü için hem intraoperatif hem de postoperatif dönemde 0.03 mg/kg kullanın
Ampisilin, enjekte edilebilir	Henry Schein	1185678	Prosedür sırasında cilt altına 25 mg/kg kullanın
K-teli, 1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith İğnesi, Düz 1½"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal Dekalsifikasyon Çözeltisi	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl Akrilik Reçine Kemik Çimentosu (PMMA) (Monomer ve polimer)	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 Çekme Test Cihazı	Instron	5564	Herhangi bir benzer çekme testi cihazı uygundur