Bu makale, yetişkin farelerde ön beyin bıçak yaralanması oluşturmak için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Bıçak yaralanması, daha sonra standart immünohistokimya yöntemleriyle incelenebilen ciddi reaktif gliozis ve glial skar oluşumuna neden olur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
CNS'nin yaralanmasını takiben, astrositler topluca reaktif astrogliozis olarak adlandırılan çok çeşitli biyokimyasal, morfolojik ve moleküler değişikliklere uğrarlar. Reaktif astrositler, sırasıyla nöral onarımı inhibe eden ve teşvik eden hem enflamatuar hem de koruyucu etkiler gösterir. Reaktif astrogliozisin çeşitli fonksiyonel özelliklerinin altında yatan mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. Bu mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yaralı CNS'yi tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Burada, bir ön beyin bıçak lezyonu kullanarak yetişkin fare ön beyninde reaktif astrogliozu tetiklemek için bir yöntem gösteriyoruz. Bu lezyon modeli basit, güvenilirdir ve yaralanmayı oluşturmak için sadece stereotaksik bir cihaz ve bir neşter bıçağı gerektirir. Bıçak lezyonlarının ön beyinde bir yaralanma modeli olarak kullanımı iyi bilinmektedir ve nöronal dejenerasyon, nöroinflamasyon ve kan beyin bariyerindeki (BBB) bozulmalar gibi çok çeşitli nöropatolojik sonuçları ele alan çalışmalara uygundur. Bu nedenle, ön beyin bıçak yaralanması modeli, CNS'nin travmaya yanıtı üzerine çok çeşitli çalışmalar için uygulanabilecek güçlü bir araç olarak hizmet eder.
Giriş
Yaralı CNS'yi tedavi etmek için başarılı tedaviler geliştirmenin en büyük zorluğu, travma tarafından tetiklenen karmaşık çok hücreli olayların tam olarak anlaşılmamasıdır. Reaktif astrositler, yeni tedaviler için umut verici bir hedef olarak giderek daha fazla kabul görmektedir1. Tarihsel olarak nöral onarıma düşman olarak kabul edilse de, reaktif astrositler artık enflamatuar süreçlerin zayıflamasını ve ikincil hasarı ve nörodejenerasyonu2-6'nın sınırlamasını içeren karmaşık, çok hücreli bir nöroprotektif yanıtın kritik bileşenleri olarak kabul edilmektedir. Reaktif gliozisin nöropatolojik özellikleri uzun zamandır iyi tanımlanmış olmasına rağmen, reaktif gliozu düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmalar ve çeşitli aşağı akış sonuçları dizisi tam olarak anlaşılamamıştır. Reaktif gliozu tetikleyen mekanizmaların yanı sıra müteakip hücresel ve moleküler olayları anlamak, zararlı etkileri azaltırken reaktif gliozisin nöroprotektif özelliklerini teşvik etmeyi amaçlayan stratejiler geliştirmeye yönelik önemli bir adımdır.
Burada, bir bıçak yaralanması kullanarak yetişkin farelerin ön beyninde ciddi reaktif astrogliozu indüklemek için bir yöntem gösteriyoruz. Kontrollü kortikal darbe (CCI) veya sıvı perküsyon yaralanması (FPI) gibi diğer travmatik beyin hasarı (TBI) modellerinin aksine, bir yaralanma oluşturmak için özel ekipman gerektiren ön beyin bıçağı, kafayı stabilize etmek için yalnızca stereotaksik bir cihaz ve 11 No'lu bir neşter bıçağı gerektirir. Bu nedenle, ön beyin bıçak lezyonu modeli, bir FPI veya CCI hasarı oluşturmak için gerekli özel cihazlara erişimi olmayan çok çeşitli laboratuvarlar için daha geniş bir şekilde erişilebilir. Burada açıklanan yöntem, araştırmacıların sonraki hücresel ve moleküler olayları araştırmak için sağlam bir gliozis yanıtını güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde tetiklemesini sağlar. Ameliyattan kurtulduktan sonra, ön beyin bıçak yaralanması geçiren hayvanlar, özel bakıma ihtiyaç duymadan uzun süre hayatta kalabilir ve akut, orta veya kronik çalışmalar için koloniye geri gönderilebilir. TBH'nin FPI veya CCI modellerinden daha az klinik olarak çevrilebilir olmasına rağmen, bir bıçak yaralanması tarafından üretilen bir ön beyin lezyonu, CNS'ye travma sonrası reaktif gliozis ve diğer nöropatolojik olayların altında yatan temel biyolojik mekanizmaları araştırmak için basit ama kullanışlı bir deneysel model olarak hizmet eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Karışık C57BL / 6 arka plan üzerine Yetişkin (3-4 aylık) erkek fareler bu protokol kullanıldı. Hayvanlar, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu ve gıda ve suya serbest olarak ulaşmalarına izin verilmiştir. Bu protokolde yapılan tüm işlemler Drexel Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir.
1. Cerrahi Alan hazırlanması
- % 70 etanol ile, cerrahi tablo dezenfekte, daha sonra, emici ped ile tüm cerrahi tezgah kapağı ve stereotaksik bitişik cerrahi aletler sağlayabilir.
- Manipülatör kolunun olmadan stereotaksik ekipman ayarlayın. Stereotaksik ısıtma yastığı yerleştirin ve 37 ° C olarak ayarlayın. Hayvan ve ısıtma yastığı arasındaki kağıt havlu veya cerrahi ped küçük bir parça koyarak hayvan aşırı ısınma kaçının.
- Otoklava makas kullanarak, Rea kadar% 0.9 steril tuzlu su çözeltisi içeren steril bir Petri kabı içine otoklava gelfoam küçük parçalarkullanım için dy.
Not: otoklavlanmış aletleri ve steril cerrahi malzemeleri kullanarak steril bir çalışma ortamı sağlayın. Gerektiğinde, 10-15 saniye boyunca bir boncuk sterilizatör içine batırarak hayvanlar arasındaki işlem sırasında ya da cerrahi aletler yeniden sterilize edin. Dezenfekte etmek, gerektiği gibi,% 70 etanol ile ellerini ovuşturarak tarafından işlem boyunca temiz eldiven koruyun.
Cerrahi 2. hazırlıyor Fare
- (G) ev kafesinden fareyi çıkarın ve tartın.
- Izofluran indüksiyon odasına ve 5 2 L / dk ve izofluran buharlaştırıcı ayarlanmış oksijen içine yerleştirin fare anestezi cerrahi uçağı, yaklaşık 3-5 dakika ikna etmek. Yavaşlaması solunum ve immobilizasyon için izleyin. Fare tam ayak tutam refleks ile sedasyon olup olmadığını kontrol edin.
- Fare tamamen uyuşturulmuş olduğunda, stereotaksik çerçeve içinde yer izofluran boru ile bağlı burun konisi, burun sabitleyin. Kafa sağlanması istikrarlı, kulak kanalı içine kulak çubukları yerleştirin ve sıkın.
- Kulaktan kulağa tıraş ve gözler arasında gelen kulakların arkasında için.
- Izopropil alkol ve betadin iyot çözeltisi, 3 kez her alternatif mendil ile cilt sterilize edin.
- Cerrahi işlem sırasında kurumasını önlemek için her iki göze yapay gözyaşları uygulayın.
3. Cerrahi Prosedür
- Ayak veya kuyruk kısma anestezi derinliği izleyin. Orada bir yanıttır ve solunum yavaş ve daha fare uygun cerrahi düzlemdedir.
- Sadece neredeyse bir No. 11 neşter bıçak kullanarak tek firma hareket kulaklar arasına gözlerin arkasında bir parasagital cilt kesi olun. Kenara cildi taşıyın ve hemostatla sağ tarafı klibi.
- No: 11 neşter ve pamuk mat tarafı kullanılarak örten zarın Temizle kafatası aplikatör uçlu. Pamuklu çubuk% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde daldırma ile isteğe bağlı olarak, kafatası silin. Tamamen kurumasını bekleyin.
- BiziKüçük bir cetvel ing, kalıcı bir kalem ile, sagital sütür (Şekil 1) yanal 1 mm koronal sütür ile kaudal ve 1 mm Kraniotomi sol kenarında Kraniotomi anterior sınırını çizecek. Sonra sagital ve koronal sütür, sırasıyla (Şekil 1) 4 mm kraniotomi hakkını ve kaudal sınırları işaretleyin.
- 0.5 mm'lik matkap ucu kullanarak, kalıcı marker anahat takip yavaş delerek kraniotomi yapmaya başlar. Tamamen kafatası yoluyla kırmak için değil emin olun. Basın hafifçe No. 5 forseps ile parietal kemiğin izole parçası üzerinde, zayıflık alanları basınca yol verecek. Inceltilmiş kemik çevre boyunca yeterince zayıf olduğunda, kemik parçası çıkarılmaya hazırdır.
NOT: Araştırmacı deneyimleri zorluk tek parça kemik çıkarmadan, bu kemik yeterince sondaj esnasında inceltilmiş olmadığını göstermektedir. Facilita sonraki hayvanlarda daha kafatası delme dikkateKemik parçasının te kolay çıkarılması. - Bir 23 G iğne ile donatılmış 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, izole edilmiş kemik ve delinmiş alanı emmek için% 0.9 tuzlu su, küçük bir miktar uygulanır.
- Stereotaksik ekipmana manipülatör kolunu takın. Rostrally bakan bıçak keskin tarafı ile prob tutucu için yeni bir No. 11 neşter bıçak takın.
NOT: rostral ve kaudal dokular bıçağın keskin ve künt kenarları tecrübe olsa da, sırasıyla, delici yaralanma ile uyarılan mekanik hasar lezyonun ölçüde boyunca karşılaştırılabilir. Biz rostral ve kaudal bölümler arasında GFAP ifade veya çoğalması artışıyla da dahil olmak üzere reaktif gliozis en önemli özelliklerinden hiçbir kayda değer farklılıklar görüyoruz. - Yolumdan manipülatör kolunu tutarak, dikkatli 5/45 açılı forseps kullanılarak izole kemik kaldırın. Ful birinde geride kemik parçasını koparmak kaldıraç kullanarak, izole kemik ve asansörün yan içine forseps ucu takınl hareketi.
NOT: Beyni bıçaklanma veya kafatası altında dura rahatsız etmemek için dikkatli olun. - Emdirilmiş jel köpük küçük bir parça alın ve kurumasını önlemek ve mevcut olabilecek herhangi bir kan emmek için çıplak beyin üzerine yerleştirin.
- Jel köpük yerleştirildikten sonra, yerine manipülatör kolu salıncak ve jel köpük üzerinde Kraniotomi merkezine bıçağı ayarlayın. Jel köpük çıkarın ve uç dura dura delinmesiyle olmadan temas edene kadar bıçak indirin. Mark dorsal / stereotaksik dikey kolunda sürmeli ölçeği kullanılarak ventral koordinatlar.
- Manipülatör kolunu kullanarak, yavaşça bıçağı beyin içine tam 3 mm indirin. Bu manipülatör kolunun üzerinde sürmeli ölçekli işaretleri kullanılarak elde edilir. Bıçak 5-10 saniye yerde kalmak için izin verir. Opposi geçmeden önce Kraniotomi rostral ve kaudal sınırları ulaşmasını sağlayan bıçağı üç kez kaudal bıçak eki rostral ile stereotaksik kol Taşıte sonu.
NOT: Dura bıçağı takmadan önce kaldırılmaz. O | an sıçan dura, ~ aksine kalınlığı 7 80 um, fare dura önemli ölçüde daha incedir (sadece birkaç hücre tabakası kalınlığında) ve sokma esnasında bisturi için kayda değer bir direnç üretmez. Her hayvan tutarlı bir yaralanma almasını sağlamak için her bir fare için yeni bir neşter bıçak kullanın. - Yavaş yavaş beyin bıçağı çıkararak, stereotaksik kol yükseltmek. Bıçağın çıkarıldıktan sonra, hemen herhangi bir aşırı kan veya sıvının kadar emmek için beyin yüzeyindeki gelfoam başka bir parça koyun.
- Bu arada, stereotaksik kol kaldırmak ve No. 11 neşter bıçak atmayın. Kanama durduktan sonra, gelfoam çıkarın.
- Böyle etilon veya prolen olarak emilmeyen sütür, cildi dikilmesi yoluyla yarayı kapatın. Dikişler ameliyattan sonraki 9-10 gün çıkarılmalıdır.
- Evde kafes fare dönün ve fare heatin yavaş yavaş kurtarmak için izinsıkıntı herhangi bir işaret için g ped ve monitör. Isofluorane kaynaklı anestezi Kurtarma tipik isofluorane çıkarıldıktan sonra 2-5 dakika içinde ortaya çıkar. Bu sternum recumbancy kazanmış kadar sahipsiz hayvan bırakmayın.
- Hidrasyon sağlamak için laktat Ringer solüsyonu subkutan 0.5-1 ml yönetme.
4. Post-cerrahi Bakımı
- Yakından koloniye dönmeden önce anestezi kurtarma kadar ameliyat sonrası hayvanların izleyin.
- , Ameliyat sonrası ağrı ve rahatsızlığı azaltmak hemen prosedür takip ip enjeksiyon yoluyla 0.05-0.1 mg / kg buprenorfin yönetmek için.
- Böyle kısıtlı hareketler, tımar eksikliği, ya da kilo kaybı gibi sıkıntı şiddetli belirtileri ameliyat sonrası 2-3 gün hayvanları gözlemleyin. Sıkıntı bu işaretlerin herhangi biri gösteren hayvanlar Euthanize ve çalışma çıkarın.
- Stan tarafından hayvanların euthanize, yaralı dokuların histopatolojisini incelemek içindard Intracardial perfüzyon.
- Kısaca, ketamin / ksilazin aşırı dozda hayvanlara anestezi, daha sonra intrakardiyak 15-20 ml% 0.9 NaCl emdirilmiştir veya karaciğer Deneyin sonunda% 4 paraformaldehit, 60 ml, ardından, kan temizlenene kadar.
- % 30 sukroz çözeltisi aktarmadan önce% 4 paraformaldehid içinde 2-4 saat boyunca beyin ve sonrası düzeltme teşrih. Garcia 8,9 açıklandığı gibi veya standart histolojik veya immünohistokimyasal prosedürlerle Bölüm 40-60 mikron bir kriyostat üzerinde beyinleri ve süreç.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu prosedürü geçiren hayvanlar gerekmez, çünkü post-operatif bakım uzman, kısa veya uzun süreli zaman sağ kalım süreleri kolayca yaralanma sonrası akut veya kronik patolojiyi araştırmak için ihtiyaca göre, çalışmaya dahil edilmiştir. Böyle GFAP ve soma hipertrofisi artışı gibi reaktif gliozis temel özellikleri, gibi erken yaralanma sonrası 2-3 gün olarak görülebilir. Reaktif astrositlere için çoğalması zirve faz yaralanma 10 şu günlerde 3-5 sırasında. Aşağıda gösterilen temsilcisi sonuçları 7 gün önce bir bıç...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu kafatası ya da altta yatan dura delme sırasında hasar görmemesi çok önemlidir. Patlak değil kafatası sağlamak için sondaj yaparken hafif baskı uygulayın. Dura sağlamak için kafatası parçasını kaldırma kemik ile kaldırdı değilken ek olarak, dikkatli olunmalıdır.
ön beyin bıçak yaralanması modelleri burada MSS bir delici yaralanma nitelendirdi. Böyle FPI veya CCİ olarak TBI modellere göre daha az klinik çevrilebilir olsa da, ön beyin bıçak lezyon modeli ayrık MSS hakaret tarafından tetiklen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Teknik yardım için Katherine Clark'a teşekkür ederiz. A.D.R.G. kısmen 5K01MH097957-03 tarafından finanse edilmektedir
.Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Stereotax | Harvard Aparatı | 726049 | |
| Yüksek hızlı mikro matkap | Harvard Aparatı | 724950 | |
| paslanmaz çelik neşter bıçağı, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 açılı forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-35 | |
| Jelköpük sünger 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Seyreltme - 1:20.000 (parlak alan); 1:1.000 (floresan) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Seyreltme - 1:20.000 (parlak alan); 1:500 (floresan) |
| Biyotinile keçi tavşan karşıtı | Vektör Laboratuvarları | BA-1000 | Seyreltme - 1:400 (parlak alan) |
| Biyotinile tavşan anti-koyun | Vektör Laboratuvarları | BA-6000 | Seyreltme - 1:400 (parlak alan) |
| Alexafluor 488 keçi anti-tavşan | Yaşam Teknolojileri | A-11008 | Seyreltme - 1:400 (parlak alan) |
| Alexafluor 568 eşek anti-koyun | Yaşam Teknolojileri | A-21099 | Seyreltme - 1:1.000 (floresan) |
| DAPI Nükleik Asit Leke | Yaşam Teknolojileri | D3571 | Seyreltme - 1:1.000 (floresan) |
| Kresil Menekşe Asetat | Sigma Aldrich | C5042-10G | Seyreltme - %1 (parlak alan) |
Kaynaklar
- Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders. Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).
- Bush, T. G., et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Okada, S., et al. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS. Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
- Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord. Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).
- Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain. Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).
- Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain. J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).
- Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds. Glia. 16 (4), 368-382 (1996).
- Hozumi, I., et al. Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain. Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).
- Ness, R., David, S. Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro. Glia. 19 (1), 47-57 (1997).
- Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).
- Steward, O., et al. Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models. Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2008).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions. Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Ip, C. W. Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes. Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).
- Perry, V. H. Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration. Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Buffo, A., et al. Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected]. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
