Yöntem makalesi

Susturulması

9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52849

⸱

12 Ağustos 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Bu makalede

Özet

siRNA ile gen susturma, kanser biyolojisini daha iyi anlamak için BRCA2'ye bağımlı biyolojik fonksiyonları anında çıkarımlarla analiz etmek için uygun bir deneysel stratejiyi temsil eder. BRCA2'yi verimli bir şekilde susturmak için bir yöntem, insan hücre hatlarında immünoblotlama yoluyla BRCA2 protein ekspresyonundaki değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek için deneysel prosedür ile birlikte sunulmaktadır.

Özet

Tümör baskılayıcı protein BRCA2 ve konvansiyonel biyokimyasal analizler tarafından tespit susturma insan BRCA2 proteininin (yaklaşık 390 kDa) büyüklüğü sayesinde büyük bir teknik sorun oluşturmaktadır. Biz insan epitel hücre hatlarında sırasıyla endojen BRCA2 proteini, insan BRCA2 susturmak ve tespit etmek için standart siRNA transfeksiyon ve immunoblotting protokolleri değişiklikler rapor. Anahtar adımlar transfeksiyon reaktif oranı yüksek siRNA ve aynı deney içinde siRNA transfeksiyon birbirini takip eden iki mermi bulunmaktadır. Anti-BRCA2 antikorlar ile analiz immün tarafından değerlendirilecek sürekli olarak insan BRCA2 geninin fazla% 70 susturulması elde standart protokole bu ve diğer değişiklikler kullanma. Buna ek olarak, bunun yerine klasik 70-100 ° C ve immunoblotting prosedür diğer teknik iyileştirmeler 55 ° C'de hücre lizatlarının denatürasyon sağlam BRCA2 proteininin tespiti da WH izinbaşlangıç ​​malzemesinin çok düşük miktarlarda en mevcuttur ya da BRCA2 protein ekspresyon seviyesi çok düşük olduğunda. Insan hücrelerinde BRCA2 etkin susturulması, tümör hücreleri de dahil olmak üzere sağlam BRCA2, hücrelerde BRCA2 fonksiyonunu bozmaya yeni moleküler yollar ve tümör patojenik BRCA2 mutasyonu etkilenebilir hücre fonksiyonlarını incelemek için değerli bir strateji vardır. Verimli susturma ve BRCA2 gibi diğer 'büyük' ​​protein analizi için bu protokolün Adaptasyon kolayca ulaşılabilir olmalıdır.

Giriş

BRCA2 (Meme Kanseri yatkınlık geni-2) gen rekombinaz enzimi Rad51 1 işlevini düzenleyen DNA çift iplikli sonları onarımında önemli bir rol oynayan bir tümör baskılayıcı protein kodlayan. BRCA2 aynı zamanda transkripsiyonun modülasyonu ve hücre döngüsü kontrol 2 implike edilmiştir. BRCA2 geninin germline mutasyonlar için diğer kanser türleri 3,4 otozomal dominant erkeklerde meme ve kadınlarda yumurtalık kanseri ve prostat kanseri olan yatkınlığı, hem de yatkınlığı neden olur. Ancak, bastırmak ya da DNA hasarına neden olan 5-7 kemoterapötik ajanların kanser hücrelerinin daha hassas hale getirebilir BRCA2 fonksiyonunu azaltmak kanser, BRCA2 mutasyonları gelişmekte riski rağmen. Sporadik kanserler o BRCA2 protein düşündüren, BRCA2 proteininin azaltılmış düzeylerinin bazı kanser türlerinde tespit edilmiştir rağmen BRCA2 mutasyonları (<% 3) düşük bir oran sergilemektedirolmayan mutasyon bağımlı mekanizmalar 7,8 ile sporadik kanserlerde tümör oluşumu sırasında kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, tam Kanser biyolojisinde bağlamında gibi diğer biyolojik ortamlarda BRCA2 fonksiyonlarını anlamak önemlidir.

Memeli hücrelerinde gen yeni işlevleri belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır ifadesini susturma etmektir. Bir örnek olarak, normal epitel hücrelerinin çeşitli susturma BRCA2 sentezleme en son anoikis direnci, kanser hücresi invaziv ve metastatik yeteneği 9 edinilmesi sırasında önemli bir aşama düzenleyici olarak BRCA2 yeni bir fonksiyon belirlenmesine yol açmıştır. Gen susması hücrelerin küçük müdahale (si) RNA ya da özel bir geni hedef alan kısa bir saç tokası (sh) RNA molekülleri ya sokulması ile elde edilebilir. Yüksek siRNA gücü ve kullanım kolaylığı kritik biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar kazanma amaçlı deneyler susturmak için onu tercihli aracı yapmak birnd yeni tedavi hedefleri tespit etmek. Ancak, gen ekspresyonunun etkili bir yok etme tüm genler kolaylıkla elde olmayabilir ve hücre türüne bağımlı olarak oldukça değişken olabilir. Hücre içi protein seviyelerinde bir azalma araştırılmaktadır en uygun fenotip olduğu için, gen ürününün analizi immün gen susmasını ölçmek için son derece önemlidir. Bu bağlamda, BRCA2 proteininin bir başka meydan okuma sunuyor: Büyük bir protein (yaklaşık 390 kDa) olan, teknik zorluklar immunoblotting dahil olmak üzere geleneksel biyokimyasal analiz için mevcut.

Biz burada insan epitel hücre hatlarında BRCA2 verimli susturulması için ve analiz immün demonte BRCA2 proteininin hızlı ve başarılı tespiti için optimize edilmiş bir protokol rapor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. siRNA çözümleri hazırlayın

  1. (50 uM son konsantrasyon siRNA) RNaz içermeyen su, 100 ul BRCA2 siRNA kurutuldu pelet 5 karıştırılmış (CTRL) nmol ve 5 nmol yeniden süspanse edin. Bu siRNA stok ve 10 ul alikotları -20 ° C'de saklanmalıdır.
  2. SiRNA stoktan 10 ul bir kısım alın ve 10 uM siRNA çalışma çözeltisi elde etmek için RNaz içermeyen su içinde 40 ul ekle. Bu seyreltme, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanmalıdır.
    NOT: siRNA çalışma çözüm / dondurma geçmesi 3 kat daha fazla çözülme olmamalıdır.

İnsan epitelyal hücre hattı olduğunu 2. Tohum

  1. 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde doku kültürü plakaları içinde hücre mono tabakaları olarak büyüyen insan epitelyal hücre hatları büyüme ortamı çıkarın.
  2. Bir kez RT PBS ile plaka hücreleri (100 mm tabak için 10 ml PBS) yıkayın.
  3. Plaka hücreleri ayırmak için,% 0.25 tripsin ve 2 ml / 0.53 mM EDTA çözeltisi ekleme ve hücre tipine bağlı olarak 3-5 dakika inkübe edin.
  4. Müstakil hücreleri toplamak önce,% 10 fetal sığır serumu içeren tam büyüme ortamı 2 ml eklenerek tripsin nötralize eder.
  5. 15 ml'lik bir tüpe hücreleri aktarın.
  6. Sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 3 dakika boyunca 320-330 xg'de hücreleri santrifüjleyin.
  7. Antibiyotikler-içermeyen ortamdan 5 ml hücre pelletleri yeniden süspanse edin.
  8. Bir Bürker odasında mikroskop altında ya da imalatçının talimatlarına uygun olarak, otomatik bir sayma sistemi kullanarak hücreleri sayın.
  9. 6-delikli plakalardaki hücreler 24 saat (de 0.5-1 x 10 her biri için ortam 2 ml 6 hücre) sonra yaklaşık% 80 konfluent olarak tohumu. Optimal hücre sayısı özel hücre çizgileri, büyüme oranına bağlı olarak değişebilir tohumlanır edilmesi.
    NOT: antibiyotikler olumsuz transfe verimliliği engel olacak çünkü bu noktada ortamda antibiyotik katmayınction. Bu BRCA2 siRNA transfeksiyon, yüksek verim elde etmek için, düşük bir kültür geçitlerin (<10) en hücreleri olması çok önemlidir.

SiRNA ile 3. Transfect hücreleri

  1. Yirmi dört saat sonra, hücreler kaplama sonrası, transfeksiyon ilk tur devam edin.
    1. Indirgenmiş serum ortamı 130 ul lipid bazlı 10 siRNA belirli transfeksiyon reaktif 6 ul sulandırmak.
    2. Indirgenmiş serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (30 pmol) 3 ul sulandırmak.
    3. Seyreltildi transfeksiyon reaktifi ile seyreltildi siRNA birleştirin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin.
    4. İnkübasyon sırasında, hücrelerden orta kaldırmak ve taze ortam (antibiyotiksiz), 37 ° C'de önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin.
    5. Hücrelere siRNA transfeksiyon reaktifi komplekslerinin 250 ul (bu miktar, 6 gözlü bir plakanın tek oyuk için) ekleyin.
    6. 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe76;% 5 CO2 C.
  2. 24 saat sonra, adım 3.1.2 şu değişiklikler 3.1.1-3.1.5 adımları tekrarlayarak transfeksiyon ikinci tur devam: düşük serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (50 pmol), 5 ul seyreltilir.
    1. Analizden önce 37 ° C'de 1-2 gün süreyle inkübe hücreleri.
      NOT: transfeksiyonları ve ikinci turda yüksek bir siRNA / transfeksiyon reaktif oranına kullanımının iki tur BRCA2 sessizliğini yüksek verim elde etmek için gereklidir.

Immunoblotting analizi için 4. Hücreleri,

  1. Iyonik-olmayan, denatüre edici olmayan deterjan oktilfenoksipolietokisetanol% 1, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat, 10 mM sodyum flüorür, 2 mM fenilmetilsülfonil fluorür, 10 ug içeren PBS (pH 7.4), taze liziz tamponu / ml löpeptin, 10 | ig / ml aprotinin. Buz üzerinde tutun.
  2. Hücreler ve w orta çıkarınlevhanın soğuk PBS (2 ml / oyuk) ile bir kez bunları kül. Herhangi bir PBS taşınmasını önlemek için, tamamen plaka çıkarın.
  3. Her bir oyuğa liziz tamponu içinde 200 ul ekle.
    NOT: hücreler, diğer analizler için de kullanılabilir hücreleri trypsinize aşama 2,1-2,6 tarif edildiği gibi ve uygulamaya göre, uygun tampon / ortam içinde hücreler tekrar süspansiyon gerekir ise kullanılır.
  4. Yavaşça eşit lizis tamponu dağıtma ve bir döndürücüde 4 ° C de 15 dakika inkübe etmek plaka döndürün.
  5. Bir hücre kazıyıcı kullanılarak buz üzerinde, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre lizat toplayın.
  6. 4 ° C'de 25 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüje ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak.
  7. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilen protein deneyi kullanılarak protein konsantrasyonu ölçümü.

5. BRCA2 immunoblotting analizi

  1. 20x Tris-Asetat SDS çalışan b 50 ml seyreltilmesi ile çalışan tampon hazırlayınUffer (50 mM Trişin, 50 mM Tris baz,% 0.1 SDS, pH 8.24) damıtılmış su 950 ml.
  2. Aşağıda örnek hazırlayın: 20 nihai bir hacme kadar 15 toplam hücre lizatı ug, 4x numune tamponu içinde 5 ul pH 8.4 lityum dodesil sülfat içeren, 10x Örnek indirgeyici madde (0.5 M DTT) 2 ul ve lizis tampon eklemek ul.
    NOT: Bu protokol, (5 ug kadar), aynı zamanda, toplam proteinlerin daha düşük bir miktarda kullanarak, normal hücre çizgilerinde BRCA2 saptanmasını sağlar.
  3. 10 dakika boyunca 55 ° C'de numune denatüre.
    NOT: 55 ° C kullanmak çok önemlidir. BRCA2 proteini ısıya 11 olduğu için, daha yüksek sıcaklıklar, denatüre edici tam boy (390 kDa), BRCA2 proteininin tutarlı bir azalmaya neden olur.
  4. Üreticinin talimatlarına göre elektroforetik bölmeyi ayarlayın.
  5. Örnekler ve precasted jeli üzerinde yüksek molekül ağırlıklı ön-lekeli protein standardı 10 ul (Tris-Asetat% 3-8) yük ve ab 120 V çalıştırmak2 saat 12. 55 kDa mavi işaretleyici precasted jel ayrılmadan önce elektroforetik akışını durdurur.
  6. 20x Transfer tamponu, 50 ml% 100 metanol, 100 ml ve 850 ml su ile birlikte Transfer tamponu hazırlayın.
  7. 5 dakika boyunca% 100 metanol içinde ıslatarak PVDF membranı (0.45 mikron gözenek büyüklüğü) aktive damıtılmış su ile yıkayın ve en az 5 dakika için transfer tamponu içinde dengeye. Kullanılana kadar 4 ° C 'de transfer tampon maddesi transfer cihazının sünger bekletin.
  8. Elektroforetik çalışma bittiğinde, aşağıdaki sırayla (aşağıdan yukarıya) transfer yığınında sandviç monte: transfer tamponu doymuş üç süngerler, tek 3MM sınıfı kağıt levha transfer tamponu, jel, aktif PVDF membran, tek 3mm doymuş Transfer tamponunda doymuş sınıf kağıt levha, üç süngerler transfer tamponu 13,14 doymuş. 4 ° C'de gece boyunca mA 4 ° C ya da 180 ° C'de 4 saat 350 mA'da cihazı ve aktarım proteinleri içine yığın yerleştirin.
    NOT: yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin tam transferini sağlamak üzere 4 saat veya gece için (üretici ve çoğu aktarım protokolleri tarafından önerilen) olmak BRCA2 çok büyük bir protein o 1 saat transfer süresini uzatmak için çok önemlidir. Buna ek olarak, uzun bir aktarım zaman, bu aşırı ısınmayı en aza indirmek ve sandviç Sökme kolaylaştırmak için 4 ° C 'de soğuk bir odada blotting işleminin gerçekleştirilmesi için çok önemlidir. Yarı kuru transfer sistemleri büyük proteinlerin aktarımı için iyi değildir.
  9. Aktarma işleminden sonra (30 ul anti-BRCA2 tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C'de bir gece boyunca% 5 yağsız kuru süt ve probu içeren TBS-Tween% 0.25 içinde oda sıcaklığında 1 saat (TBS-T) için bloke TBS ile zarın yıkanması [: 300 (h / h) sulandırma 1] 9 ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt içinde seyreltilmiş 200 ng / ml).
  10. Daha sonra TBS 10 ml seyreltilmiş bayır turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru ile 1 ul, 1 saat boyunca filtre inkübe, TBS-T ile, membran üç defa (10 dk) yıkayın-T +% 5 yağsız kuru süt. Bundan sonra, TBS-T ile membranı üç defa (10 dk) yıkayın.
  11. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) Western Blot saptama reaktif maddesi kullanılarak, üretici talimatlarına göre BRCA2 proteini ortaya çıkarmak için ECL tarafından immunodeteksiyon gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü ECL filmlerinde immunochemiluminescent bantları gözünüzde canlandırın.
  12. 10 anti-tubulin antikoru 1000 (10 ul: β-tubulin bir monoklonal antikor kullanılarak 1 seyreltilmiş göre yükleme kontrolü olarak, aynı filtre üzerinde, β-tubulin (55 kDa) gibi bir ev bakıcısı geni için bir antikor ile immunodeteksiyon gerçekleştirme oda sıcaklığında 1 saat ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt). Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare yerine anti-tavşan sekonder antikor kullanılması haricinde, yıkama ve BRCA2 (5,10-5,11) için tarif edildiği gibi sekonder antikoru inkübe edin.
  13. (Immunochemiluminescent bantları ile etkilendim filmlerin dijital görüntü elde ve özel görüntü analiz yazılımı tarafından bant yoğunluğunu analiz, örneğin., ImageJ).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre fonksiyonları üzerine BRCA2 susturma etkisini incelemek üzere bir biyolojik / biyokimyasal tahlil geçmeden önce, ilk adım bir şifreli siRNA (siRNA olmayan hedefleme) BRCA2 siRNA ile yan yana (Şekil 1A kullanarak susturma özgünlüğünü doğrulamak için ). Bu BRCA2 susturma yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA / transfeksiyon oranı ile siRNA transfeksiyon ikinci tur gerçekleştirmek için önemlidir. Gerçekten de, siRNA transfeksiyon tek aşama performans ya da daha düşük, yok et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kadın ve erkek meme kanseri, yumurtalık kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri ve melanom 3,4 dahil olmak üzere birçok kanser türleri, risk artışına BRCA2 geni kurşun germline mutasyonlar, çok sayıda çalışma biyolojik işlevini anlamak için yapılmıştır Çünkü BRCA2 protein. Bu çalışmaların çoğu nedeniyle BRCA2 gibi dev bir protein analiz teknik zorluklar genetik temelli çoğunlukla. BRCA2 protein ekspresyonu susturma ve analiz edilmesi için burada tarif edilen metot, biyolojik tahliller, geniş bir s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, FIRB-Merit hibeleri RBNE08YFN3_005 ve RBNE08HWLZ_012 ve İtalya Ekonomi ve Maliye Bakanlığı tarafından "FaReBio di Qualità" Projesi için CNR'ye desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus Hedeflemeyen Havuz
Lipofiktamin RNAiMAX Reaktifi Life Technologies13778075Transfeksiyon Reaktifi
OPTI-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıLife Technologies31985-070Transfeksiyon prosedürü için ortam
NuPAGE Tris-Asetat %3-8 1,5 mm Jel prekastLife TechnologiesEA0378Protein elektroforezi için jel
NuPAGE LDS Örnek tampon Life TechnologiesNP0007Protein elektroforezi için reaktif
NuPAGE Numune Azaltıcı ajan (10x)Life TechnologiesNP0004Protein elektroforezi için reaktif
NuPAGE AntioksidanYaşam TeknolojileriNP0005Protein elektroforezi için reaktif
HiMark Önceden boyanmış protein standardıLife TechnologiesLC5699Jel için önceden boyanmış işaretleyici elektroforez
XCell SureLoc Mini-Cell  SistemYaşam TeknolojileriEI0002Protein elektroforezi/transferi için ekipman
NuPAGE Tris-Asetat SDS Çalışan TamponÖmrü TeknolojileriLA0041Western blotting
PVDF membranReaktif Western blotting içinMilliporeIPVH00010
NuPAGE Transfer Tampon ÖmrüTeknolojileriNP0006-1Western blotlama için Reaktif
BRCA2 H-300 tavşan poliklonal antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-83261:300 seyreltme
Beta-tubulin monoklonal antikoruSigma AldrichT4026-100UL1:1.000 seyreltme
Yağsız Süt tozuSigma Aldrich70166Western blotting için Reaktif
Tween-20Sigma AldrichP1379Western blotting
için reaktifSuperSignal West Pico/Femto Kemilüminesan YüzeyPierce Thermo Scientific34080/34096Kemilüminesans sistemi
PNT1A hücreleriSIGMA Aldrich (ECACC için)95012614PNT1A insan, SV40 Nthy hücreleri ile ölümsüzleştirilen normal prostat epiteli
SIGMA Aldrich (ECACC için)90011609Nthy-ori 3-1 Hücre Hattı insan, tiroid foliküler epitel hücreleri
Hücre Proliferasyonu Kit I (MTT)Hücre proliferasyon testleri içinRoche11465007001
için Reaktif Kiti

Kaynaklar

  1. Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
  2. Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
  3. Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
  4. Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
  5. Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
  6. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
  7. Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82(2013).
  8. Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
  9. Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
  10. Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
  11. Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  15. Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
  16. Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
  17. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
  18. Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
  19. Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BRCA2 SusturulmassiRNA TransfeksiyonuWestern BlottingProtein TespitiH cre Lizat Haz rlamaY ksek Molek ler A rl kl ProteinlerT m r Bask lay c AnaliziGen Susturma Verimlili immunoblotting OptimizasyonusiRNA Transfeksiyon Oran

İlgili makaleler