Yöntem makalesi

Eşzamanlı Ex vivo Fonksiyonel Test tarafından In vivo Elektroretinogram Sistemi

DOI:

10.3791/52855

⸱

6 Mayıs 2015

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ex vivo ERG, hayvanların veya insanların izole edilmiş sağlam retinalarından doğrudan retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek için kullanılabilir. Burada, retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini incelemek için in vivo ERG sistemlerinin ex vivo ERG kayıtlarına ne kadar yaygın olarak uyarlanabileceğini gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir In vivo elektroretinogram (ERG) sinyali, farklı retina hücre tiplerinden kaynaklanan birkaç örtüşen bileşenin yanı sıra retina dışı kaynaklardan gelen gürültüden oluşur. Ex vivo ERG, retina hücrelerinin işlevini doğrudan hayvanların veya donör gözlerinin bozulmamış izole retinasından incelemek için etkili bir yöntem sağlar. Ek olarak, ex vivo ERG, hayvanlardan veya insanlardan alınan retina dokusu üzerindeki potansiyel terapötik ajanların etkinliğini ve güvenliğini test etmek için kullanılabilir. Burada, ticari olarak mevcut olan in vivo ERG sistemlerinin, izole fare retinalarından ex vivo ERG kayıtları yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Standart bir in vivo sistemin ışık stimülasyonu, elektronik ve ısıtma ünitelerini, özel olarak tasarlanmış numune tutucu, yerçekimi kontrollü perfüzyon sistemi ve elektromanyetik gürültü koruması ile birleştirerek, ticari in vivo olarak dahil edilen toplama yazılımı ile iki retinadan aynı anda düşük gürültülü ex vivo ERG sinyallerini kaydediyoruz Sistemleri. Ayrıca, bu yöntemin, belirli retinal hücre tiplerinin işlevini incelemek için belirli ERG bileşenlerini çıkaran farmakolojik tedavilerle birlikte nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroretinogram (ERG) ışıkla tetiklenir retina elektriksel aktivitesi kaydetmek için kullanılabilen bir köklü bir tekniktir. ERG sinyal retinanın rezistif dışı uzayda akan radyal akımların neden olduğu gerilim değişiklikleri (fotoreseptör ve bipolar hücrelerin ekseni boyunca) ağırlıklı olarak üretilir. İlk ERG sinyali bir balık gözü 1 yüzeyinden Holmgren, 1865 kaydedilmiştir. Einthoven ve Jolly 1908 2 b-, a- denilen üç farklı dalgaların içine ışık başlangıcından ERG yanıtı, ve c-dalgalar, şimdi bipolar hücreler ON fotoreseptör esas aktivitesini yansıttığı bilinmektedir ve pigment epiteli bölünmüş Hücreler sırasıyla 3-8. ERG, yerel (mikroelektrotla (ex vivo) izole sağlam retina arasında, izole edilmiş bir göz Hazırlama 9'da elde edilen, anestezi uygulanmış hayvanlar ya da (in vivo) insan gözüyle 3,10-15 ya arasında belirli bir retina katmanları kaydedilebilirERG) 4,16. Bunlardan in vivo ERG şu anda retina fonksiyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu teşhis amaçlı kullanılabilir veya hayvanlarda veya hastalarda retina hastalıklarının ilerlemesini takip etmek invaziv olmayan bir tekniktir. Ancak, in vivo ERG kayıtları genellikle ekstraoküler fizyolojik gürültü (örneğin, solunum ve kalp aktivitesi) ile kirlenmiş, birkaç örtüşen bileşenleri ile karmaşık bir sinyal üretmek.

Yerel ERG retina spesifik katmanlar arasında sinyalini kaydetmek için kullanılabilir, ancak, en invaziv ve diğer ERG kayıt konfigürasyonları ile karşılaştırıldığında düşük bir sinyal-gürültü oranı (SNR) sahip olmasıdır. Yerel ERG ayrıca teknik olarak ve pahalı donanımları (örn mikroskop ve mikromanipülatörler) gerektirir. Sağlam, izole retina gelen Transretinal ERG (ex vivo ERG) istikrarlı ve HIG izin in vivo ve yerel ERG yöntemleri arasında bir uzlaşma sunuyorhayvanlar ya da insanlar 17 sağlam retina h SNR kayıtları. Son zamanlarda, bu yöntem, memeli primat ve insan retina 18-20 çubuk ve koni fotoreseptör fonksiyonunu incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo olarak, retina pigment epiteli olmaması, ERG sinyalinin pozitif Cı dalga bileşeni çıkarılır ve önemli bir negatif yavaş PIII bileşeni ex vivo kayıtları ortaya çıkar. Yavaş PIII bileşeni retina 21-23 Müller glia hücrelerinin aktivitesi kaynaklı gösterilmiştir. Bu nedenle, ex vivo olarak ERG yöntemi de sağlam retinada Müller hücreleri incelemek için kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda da bu ex vivo ERG kayıtları retina 24 civarında farmakolojik ajanların konsantrasyonu ölçmek ve uyuşturucu 25-27 güvenliğini ve etkinliğini test etmek için kullanılan olabilir göstermiştir.

In vivo sistemlerde birden fazla ticari mevcuttur vemutlaka geniş elektrofizyoloji altyapıya sahip olmayan birçok laboratuvarlarında kullanılan. Buna karşılık, ex vivo cihazlar son zamanlarda 17 kadar ve sadece çok az laboratuarlar anda bu güçlü tekniği yararlanarak bir sonucu olarak mevcut olmamıştır. Bu retina fizyolojisi ve patolojisi hakkında bilgimizi ilerletmek ve hastalıkları kör için yeni tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla laboratuvarlara ex vivo ERG kayıtları kullanılabilir hale getirmek için yararlı olacaktır. Burada, bir basit ve uygun fiyatlı bir ex vivo ERG aygıtı 17 göstermektedir ve bu çubuk ve koni aracılı sinyal kaydetmek için çeşitli ticari olarak temin edilebilir, in vivo ERG sistemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir göstermek (a- ve b-dalgası) ve fonksiyonu görmemiş vahşi tip fare retinaları Müller hücrelerinin (PIII yavaş).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Washington Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Perfüzyon ve Numune Tutucu Kurma

  1. Deney gününde taze retina perfüzyonu için çözelti hazırlayın. Distile ve deiyonize su kullanın. Aşağıdaki üç çözümlerden birini kullanın.
    1. , Medya ve NaHCO 3 1.9 g 'Ames 1 şişe (1 L) çözeltisi' Ames bikarbonat içeren hazırlanması
    2. (MM olarak) Locke çözeltisi hazırlayın: 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl2, 1.2 CaCl2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na süksinat, 0.5 Na glutamat, 0.02 EDTA ve 10.0 glikoz,% 0.1 MEM vitamin ve amino asitler
    3. (MM olarak) Hazırlama HEPES-tamponlu Ringer solüsyonu: 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl2, 1.0 CaCl2, 10.0 glikoz, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH1 M NaOH 5,8 mi ~ ile 7.5'e ayarlandı, 0.72 g / L kültür ortamı Leibovitz L-15 ekleyin. Herhangi bir perfüzyon medya ile fotoreseptör yanıtı izole etmek için 100 mcM BaCl 2 - 50 mcM DL-AP4 ve 50 - 20 kullanın.
  2. (MM olarak) elektrot 28 için çözelti hazırlayın: 140.0 NaCl, 3.6 KCl, CaCl2, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4 MgCl2, 1.2 ve 7.4 pH ayarlamak - NaOH ile 7.5 olarak değiştirilmişti. Elektrot çözeltisi bir kaç ay için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  3. Hazırlayın ve numune tutucu test edin.
    1. Numune sahibinin taban kısmının kubbelerin üstünde siyah / gri filtre kağıdı Tutkal (Şekil 1A bakınız). Kubbelerin düz üstleri kenarlarda dikkatlice iki bileşenli 5 dk epoksi tutkal sürün. Gerekirse, diseksiyon mikroskobu altında bunu.
    2. Tutkal neredeyse kuru (yaklaşık 4 dakika) kadar bekleyin ve düz öğesini kullanarak kubbe üzerinde filtre kağıdı bastırın. Tutkal filtre kağıdı deneyden önce en az bir gün.Filtre kağıdı, birden çok kez kullanılabilir ancak kayıtların bir ay sonra değiştirilmelidir. Yedek kağıt yüklemeden önce herhangi bir yapışkan kalıntısı dikkatlice kubbeleri temizlemek için% 70 etanol kullanın.
    3. Elektrot çözelti hava kabarcıklarını önlemek ve elektrot kanallarına dişli adaptör ile kapalı pelet elektrotlar (Şekil 1A ve B) vida çalışıyor elektrot kanalları doldurun. Dört vida ile numune tutucu üst ve alt parçaları bağlayın ve elektrot çözeltisi ile perfüzyon çizgileri doldurmak.
    4. Multimetre (Şekil 1B) kullanarak her bir elektrot çiftinin uçları arasındaki direnci ve voltajı ölçün. Direnç 100 Ωk ve 10 mV altında geriliminin kanalları kabarcık-ücretsiz ve elektrotlar iyi şartlarda iseniz altında olmalıdır.
  4. Cam şişe perfüzyon medya 700 ml - 400 dökün. Başka bir 300 mi retina ve s diseksiyon kullanılacak AyrıBir buzdolabına yırttı. Eşanjör bloğunda perfüzyon tüp ayarlayın ve ısıtıcı plaka üzerinde ısıtılmış blok yerleştirin (Şekil 1D bakınız).
  5. (Şekil 1D bakınız) (Ames 'ya da Locke kullanılması durumunda) bağlantıları 2 / O 2 gazı CO olan bir kapakla şişe ve perfüzyon tüp için sarmalar. 37 o C medya ile şişeyi Onceden ve ısıtma plakası veya 37 ayarlanmış su banyosunda hafif stimülasyon birimi üzerine yerleştirin - 39 o C 17.
    1. Prime yerçekimi ile çalışan akmayı başlatmak için perfüzyon ortamı ile doldurularak perfüzyon hattı.
      1. LKC sisteminde, daha sonra deney sırasında şişede perfüzyon çözeltisi düşürücü seviyesi etkilenmeden akış hızı regülatörü ile ayarlanır önemli bir yer çekimsel bir akış sağlamak için stimülatör ünitesi 17 üzerine şişe yerleştirin.
      2. Ocuscience sisteminde, s yernumune tutucu uzun perfüzyon çıkış hatları gürültüyü en aza indirmek ve yerleştirmek amacıyla Faraday kafesi içinde erfusion şişe çözümünün yerçekimi sürücü artırmak için de numune tutucu (ve perfüzyon şişesinin) seviyesinin altına (adım 2.8 bakınız). Bu çıkış hatlarını koruyun ve ERG sinyal elektromanyetik gürültü bağlanmasını engellemek için amplifikatörün toprağa kalkanı bağlayın.
  6. Debi regülatörleri kullanarak / dk 5 ml - 3 perfüzyon ayarlayın. Doğru regülatör ile bir silindirden% 5 CO 2 /% 95 O 2 gazı bağlayın ve bir hava taşı ile şişe medyanın sürekli köpüren sağlamak için akış hızını ayarlayın.

2. Numune Hazırlama

  1. Düz kanatlı microscissors, bir ya da iki 45 o cımbız, jilet ve filtre kağıdı dikdörtgen bir parça da dahil olmak üzere, temiz ve keskin diseksiyon aletleri birleştirin.
  2. Soğuk perfu yaklaşık 200 ml dökünbüyük bir Petri kabındaki yon çözeltisi (kubbe dahil olmak üzere), numune tutucu bütün alt kısmı çözeltisi içine daldırılmış şekilde. Kubbelerin üzerindeki retina monte ederken Bu adım önemli hale (adım 2.6 bakınız). Bazı çözeltiler karbojen (% 5 CO 2/95% O x 2), doymuş üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu diseksiyon amaçları için gerekli değildir ve burada tarif edilen deneylerde yapılmadı.
  3. Kayıtların önce 12 saat - Tipik bir deney için, aydınlık / karanlık döngüsü ve 6 onları koyu adapte 12/12 saat içinde hayvanlar tutmak. (Mikroskop ışık kaynağının önünde, örneğin kırmızı filtre kullanın) loş kırmızı ışık altında servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla hayvan Euthanize ve loş kırmızı veya kızılötesi ışık altında aşağıdaki işlemleri yapmak.
    1. Cımbız kullanarak gözleri dışarı çekin ve medya koyun. Kağıt (örneğin, bazı düzenli filtre kağıdı) küçük bir parça üzerinde bir seferde bir göz yerleştirin ve olarak yapmakCımbız ile göz (bu burada çözümün dışında yapılır) tutarken ora serrata düzeyinde yaklaşık yaktı.
  4. Ora serrata boyunca kesin (ya da yakın gözün ekvatora) microscissors ve kornea ve lensi çıkarın. Büyük Petri kabındaki soğuk medyada göz fincan koyun ve diğer gözle aynı işlemi tekrarlayın.
  5. Mümkün olduğunca sağlam olarak retina tutmak için retina ve sklera arasındaki makas tutarak optik sinir doğru göz fincan üstünden küçük bir kesi kesin. Kavrama iki cımbız kullanarak ve retina ayırmak için birbirinden uzakta cımbız çekin tarafından kesi her iki taraftan sklera.
    1. Optik siniri kesin ve uzak yüzeye fiziksel temas minimum miktarda retina izole etmeye çalışın. RPE çoğunlukla diseksiyon işlemi sırasında retina otomatik olarak ayırmak olacaktır. Bu gerçekleştirmek için daha retinanın mekanik rahatsızlık önlemek için daha önemlidirDiseksiyon hızlı bir şekilde, genel olarak retina yanıtı özellikleri üzerinde önemli etki olmadan çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edilebilir.
  6. Numune tutucu (Şekil 1C) kubbe üzerinde retina monte edin. Disseke retina ile Petri kabındaki numune tutucu alt kısmını daldırın. Kubbenin üzerindeki retinayı yukarı fotoreseptör tarafı (izole retinanın dışbükey yüzeyi), Slayt ve retina filtre kağıdı üzerinde verdiği, böylece numune tutucu kaldırın. Diğer retina için aynı işlemi tekrarlayın.
  7. Elektrik retina arasındaki karışma yanı sıra gürültü ve sinyal şant önlemek için dikkatli bir şekilde tutucu plakayı kurutun. Numune tutucu tutucu alt ve üst parçaları arasındaki çözüm dökülme önlemek için yanı sıra bireysel retina fotoreseptör ve ganglion hücre tarafı elektrik izolasyonu yardım etmek için alt kısmı kubbe etrafında O-halkalarını vardır. (Dört vida ile sahibinin üst kısmını takınŞekil 1B) ve bir şırınga ve iğne kullanılarak perfüzyon çözeltisi ile perfüzyon kanalları doldurun.
  8. Isı değiştirici blok sonraki numune tutucu aktarın ve numune tutucu (Şekil 1D) giriş ve çıkış perfüzyon hatlarını bağlayın. (Üst elektrotlar amplifikatör toprak / eksi pin bağlantı) ERG amplifikatör elektrotlar bağlayın ve bir adaptör kullanılarak numune tutucuya stimülatörü / kontrol ünitesi takın veya bağlı stimülatörü ünitesine ısıtma yastığı kaydırın in vivo hangi ERG sistemi kullanılmaktadır.

3. Kayıtlar

  1. In vivo sistemin yazılımını kullanarak amplifikatör ve uyarıcı ayarlarını yapılandırın. 300 Hz filtreleme 1 ile 10 kHz ve low-pass arasında bir değere satın alma frekansını ayarlayın. Yüksek geçiren filtreleme kullanmayın. 60 Hz (veya Avrupa'da 50 Hz) Gerekiyorsa filtreyi çentik kullanın.
  2. Işık uyarımı ve zekâ olmadan Tutanak temelh loş stimülasyon (örn., -35 dB veya 0.3 mCd şiddetindeki sm -2 yeşil ışık) elektrotlar ve retina örnek arasında iyi elektrik bağlantısı için test etmek. Retina sıcaklık ve fonksiyon istikrarlı duruma ulaşması ve böylece veri toplama başlamadan önce 20 dakika - 10 bekleyin.
    1. Herhangi bir özel deneye göre uyaran parametrelerini seçin ve veri toplama başlar. Örneğin, 0 dB kadar ya da 0.1 1.000 kadar mCd şiddetindeki sm den -40 yeşil ışık kullanmak -2 bir skotopik yanıt aile için. Çubuklar arka plan ışığı tarafından bastırılmış gereken Fotopik kayıtlarda yaklaşık 2 parlak log-birimleri 3 yanıp söner kullanın (3-30 Cdm -2) ya da bir prob flaş (-2 = 1 dB yaklaşık 1.3 Cd sm, bakınız Şekil 3).
    2. Ancak, tam ışık şiddeti değerleri sistem kalibrasyonu ve deneysel koşullara biraz bağımlı olabileceğini unutmayın. Genel bir kural olarak, aşağı 5 ölçek yoğunlukları - 10 kat in vivo karşılaştırıldığında kayıtlar yeşil ışık 17 kullanarak. (Ticari bağdaştırıcı sistemine dahil) retina üzerinde delikler olan bir siyah kapağı numune tutucu ışık saçılması: azaltmak ve in vivo sistemler ticari Ganzfeld çevrede her iki retina homojen ve eşit bir uyarım kolaylaştırmak için kullanılabilir.
      NOT: koyu adapte retina kayıtları, tipik bir deney ağartıcı pigment sadece önemsiz bir kısmını kullanılan test yanıp söner yoğunlukları böylece RPE odaklı rejenerasyon eksikliği söz konusu değildir. Buna ek olarak, daha önce koni pigment rejenerasyon hala Müller hücresi görsel döngüsü 20 üzerinden izole retinada yer alabilir gösterilmiştir.
  3. Deneyler birkaç saat 30 dakika kadar tipik son gibi bu değişiklikler teknik sorunlara işaret edebileceğiniz gibi, deney sırasında bazal sürüklenme, gürültü seviyesi ve yanıt istikrarı izlemek.
    NOT: Artan gürültü ya da azalmad tepki genlikleri hava perfüzyon veya elektrot kanalları kabarcıklar, çok düşük ya da yüksek sıcaklık, çözüm sızıntı / dökülme veya retina deplasman gösterebilir.

4. Temizlik

  1. Perfüzyon hatları numune tutucu ayırın açın ve filtre kağıdı retina yıkayın. Elektrotları çıkarın ve damıtılmış su (etanol kullanmayın) ile durulayın. Etanol ve / veya distile su ile (perfüzyon kanalları dahil) numune tutucu temizleyin. Dikkatlice yıkayın perfüzyon boru 70> ile% etanol.
  2. Damıtılmış su (deterjanlar kullanmayın) ile perfüzyon şişesini durulayın. Etanol, aynı zamanda şişe temizlemek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu koyu adapte yabani tip flaş yanıtları kaydedildi deney protokolleri farklı standart perfüzyon için solüsyonlar (Şekil 2) ile, yukarıda tarif edilen ve Şekil 1 'de gösterilen izleyerek (WT), C57BL / 6 fare retinaları. tepki dalga ve kinetik yanı sıra çubuk fotoreseptör duyarlılığı Ames "ve Locke'un medya (Şekil 2A ve B) benzer çıktı. Öte yandan, HEPES-tamponlu Ringer çözeltisi (Resim bikarbonat ya da% 5 CO 2/95% O 2) altında tepk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada bir ex vivo ERG adaptörü ile birlikte in vivo ERG sistem bileşenlerini kullanarak iki izole fare retina aynı anda yüksek kaliteli ex vivo ERG kayıtları elde etmek için kritik adımlar göstermektedir. Bu çalışmada, aynı solüsyonu (ya Ames ', Locke ya da Ringer) ile hayvandan her iki retina perfüze ama uyuşturucu test amaçlı, farklı bir çözüm örneğin her retina serpmek de mümkündür. yüksek kaliteli veri elde etmek için en önemli adımlar, gelişmiş bir ısmarla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

St Louis Washington Üniversitesi Xenotec, Inc. ile bir lisans anlaşması olan ve ex vivo adaptörün satışından elde bir telif alabilirsiniz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibe EY019312 ve EY021126 (VJK), Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Görsel Bilimler EY002687 tarafından desteklenen ve Araştırma tarafından Körlük Önlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
In vivo ERG sistemiOcuScienceHMsERGwww.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG sistemiLKC TechnologiesUTAS-E 3000www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
>Ex vivo adaptörüOcuScienceEx VIVO ERG adaptörüwww.ocuscience.us/id107.html
Diseksiyon mikroskobuNorth Central InstrumentsLeica M80Herhangi bir marka
>IR yayıcıOpto Diode Corp. kullanabilir.OD-50Lwww.optodiode.com
Prowler Gece Görüş DürbünleriBE Meyers Elektro OptikD4300-IAskeri sınıf ürün.
Kırmızı filtreRosco LaboratoriesRoscolux #27 Orta KırmızıIR sistemi yerine kullanılabilir
Kırmızı kafa lambasıOcuScienceERGX011www.ocuscience.us/catalog/i29.html
MicroscissorsWPI, Inc.500086www.wpiinc.com/
Dumont cımbız #5WPI, Inc.14101
Tıraş bıçakları ElektronMikroskobu Bilimleri72000www.emsdiasum.com
ÖlçekMetler ToledoAB54-S/FACTHerhangi bir marka
>pH metre ve elektrotBeckman CoulterpHI 350Herhangi bir markayı kullanabilir
NaClSigma-AldrichS7653Herhangi bir markayı kullanabilir
KClSigma-Aldrich60129Herhangi bir markayı kullanabilir
MgCl2Sigma-Aldrich630201.0 M
CaCl2Sigma-Aldrich211141.0 M çözüm
EDTASigma-Aldrich431788Herhangi bir markayı kullanabilir
HEPESSigma-AldrichH3375Herhangi bir markayı kullanabilir
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS6297Herhangi bir markayı kullanabilir
Ames mediumSigma-AldrichA1420Herhangi bir markayı kullanabilir
BaCl2Sigma-AldrichB0750kullanabilir herhangi bir marka
DL-AP4Tocris Bioscience101Herhangi bir marka
Süksinik asit disodyum tuzuSigma-Aldrich224731Herhangi bir marka
L-Glutamik asitSigma-AldrichG2834Herhangi bir marka
D kullanabilir (+) - GlikozSigma-AldrichG7528Herhangi bir marka
Leibovitz kültür ortamı L-15Sigma-AldrichkullanabilirL4386Herhangi bir marka
MEM vitaminlerikullanabilir Sigma-AldrichM6895
MEM amino asitleriSigma-AldrichM5550
KarbojenAirgasUN3156%5 CO2
kullanabilir çözelti kullanabilir kullanabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ex Vivo ERGIn Vivo ERG SistemiRetina zolasyonuNumune TutucuYer ekimi Kontroll Perf zyonElektromanyetik G r lt KalkanFarmakolojik Manip lasyonRod Kon SinyalizasyonuRetinal H cre Fonksiyonula Tarama

İlgili makaleler