Kanserin metastaz kansere bağlı ölümlerin önemli bir nedenidir. Biz solid organ tümörlerinin metastaz mekanizmaları çalışmak için bir "hasta" gibi ortotopik singenik fare modeli sistemi kurulması için hayatta kalma cerrahi yönteminin derinlemesine bir açıklama sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir "Hasta gibi" Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı
Bu makalede
Özet
Özet
Kansere bağlı ölümlerin büyük çoğunluğu primer tümörün kendisinden ziyade kanserin metastazı sonucu oluşur. Yine de, kanser metastazının altında yatan mekanizmalar hala belirsizdir. Hayvan modelleri, metastatik kanserlerin tedavisinde mekanizmaların aydınlatılması ve yeni stratejilerin değerlendirilmesi için gereklidir. Burada, katı organ tümörlerinin metastaz mekanizmalarını araştırmak için "hasta benzeri" bir ortotopik sinjeneik fare modelinin derinlemesine bir açıklaması sağlanmaktadır. BNL 1ME A.7R.1 fare hepatosellüler karsinom hücrelerinin, kendi içinde yetiştirilmiş vahşi tip immün yetkin laboratuvar faresi türü BALB/c'nin doğrudan karaciğerine (orijin organı) sağkalım cerrahi implantasyonu tarif edilmiştir. Bu metodolojinin başarısı ve tekrarlanabilirliği, katı organ kanseri metastazının biyolojik mekanizmalarının aydınlatılmasında yaygın olarak kullanılmasını önermektedir.
Giriş
Hepatosellüler karsinom (HCC), kötü prognozu ve düşük yaşam beklentisi ile en ölümcül kanserlerden biridir. Kansere bağlı ölümlerin neredeyse tamamı, hastalığın kaynak organdan ek uzak organlara metastatik yayılımına bağlıdır2-6. HCC ilerlemesi karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, metastatik HCC'de doğal olarak bulunan tümör mikroçevresini hayvan modellerinde modelleyebilmek, insanlarda ilgili mekanizmaları ortaya çıkarmanın başarılı ve yararlı bir yolu olabilir. 7Ne yazık ki, kanser metastazı mekanizmaları hala büyük ölçüde belirsizdir. Bu nedenle, HCC3,5 gibi kanserlerin metastazlarının altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmamızı sağlayacak hayvan modellerinin oluşturulmasına ihtiyaç vardır.
Fare model sistemleri, metastatik insan kanserlerinin tedavisi için mekanizmaları tanımlamak ve yeni stratejileri değerlendirmek için çok yararlı bir yaklaşımdır5,8. Şu anda var olan çeşitli fare model sistemleri, araştırmacıların hastalığın karmaşıklığını doğru bir şekilde tasvir etme çabalarının bir kanıtıdır5,8,9.
Ogunwobi ve meslektaşları yakın zamanda HCC3'te metastaz çalışması için yeni bir ortotopik sinjeneik fare modelinin kurulduğunu göstermek için bir sağkalım cerrahi yaklaşımı kullandılar. Çalışmaları, agresif ve metastatik HCC'lerin özelliklerini özetleyen "hasta benzeri" bir fare modeli oluşturdu3. Ayrıca, bu fare model sisteminin dolaşımdaki tümör hücrelerinin biyolojisini incelemek için kullanılabileceğini ve bunun kanser metastazı3 mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinme potansiyeline sahip olduğunu gösterdiler.
Bu makalenin amacı, HCC metastazı3'ün bu "hasta benzeri" ortotopik sinjeneik fare modelini oluştururken kullanılan metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklamaktır. BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücrelerinin, hayatta kalma cerrahisi kullanılarak kendi içinde yetiştirilmiş vahşi tip bağışıklık yetkin laboratuvar faresi türü olan BALB/c3'ün doğrudan karaciğerine (orijin organı) nasıl implante edileceğine ilişkin metodoloji açıklanacaktır. İnsan tümör hücrelerinin bağışıklık yetmezliği olan farelere implante edildiği diğer fare ksenogreft tümör modellerinin aksine, bu sistem sinjenektir ve bu nedenle tümör metastazında bağışıklık sisteminin rolünü incelemek için uygundur3,5,8. Bu yaklaşım, katı organ kanserlerinde metastaz mekanizmalarını incelemek için yaygın bir kullanım kazanacaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Beyanı
Tüm hayvan çalışmaları New York Şehir Üniversitesi Hunter College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Not: Sekiz BALB / c fareleri, bu deneysel prosedür kullanılmıştır. Beş BALB / c fareleri, primer tümör üretmek için 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare hepatoselüler karsinoma hücreleri ile implante edildi. Herhangi bir nakil Üç BALB / c fareleri, kontroller olarak kullanılmıştır. BNL 1ME A.7R.1 sıçangil olmayan tümörijenik hepatosit hücre çizgisi BNL CL.2 kimyasal dönüştürme ile elde edilen bir murin hepatosellüler karsinom hücre hattıdır. BNL 1ME A.7R.1 Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (ATCC) elde edilmiştir.
1. Ön cerrahi
- Tüm yaşam ameliyatları sağlıklı için fareler olun. Fareler sağlıklı olduğundan emin olmak için, cilt tenting ile dehidratasyon belirtileri kontrol edin. Hastalık ya da d herhangi bir kanıt ile fareler kullanmayınBu deneylerde istress.
- Onlar kilolu olmayan sağlamak için farelerin tartılır. Ağırlığı en az 16-20 gram olduğundan emin olun.
- Fare başına implantasyon için 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücreleri hazırla:
- BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücrelerinin% 70 birleşen hücre kültürü çanak - 10 ml'lik% 60 aspire medya. 5 ml PBS ile iki kez yıkanır. Çanak tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca hava ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- Daha sonra, bir pipet 10 ul 10X büyütmede mikroskop altında hücre sayımı için manuel bir hemasitometre içine hücreleri tripsinize. Dört büyük köşe meydanlarda bulunan hücrelerin toplam sayısını ve toplam hücre sayısına göre seyreltme faktörünü çarpın. Ardından, (ml başına hücreleri) sayılan kareler sayısına göre bölmek ve hücre konsantrasyonu 10 6 ile çarpın.
- Hesaplama kullanarak, steril fare başına 5 milyon hücreleri toplamak1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler etiketleyin.
- Fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ul (PBS) içinde 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücrelerinin yeniden süspanse edin. Cerrahi implantasyon kadar buz üzerinde bu hücreleri tutun.
- Böyle anestezi indüksiyon ve saç kirlenmesini önlemek için steril ekipman ve materyallerden uzak kırpma olarak ameliyata farelerin hazırlanması için gerekli aktiviteleri yapın.
- Ve dakika başına 1 L (yakl.% 2.1) sabit bir konsantrasyonu, bir akış oranında oksijenle birlikte izofluran buharlaştırıcı kullanılarak izofluran teneffüs ettirilerek farelerde, genel anestezi neden. Not: Sistem kendi kendine yeten ve hassas bir buharlaştırıcı, bir oksijen kaynağı ve gaz / anestezik atma için gerekli bir solunum devresine bağlı olan bir aktif karbon filtresi içerir.
- Anestezi, ameliyat sırasında ağrı geçiyor gelen hayvan önlemek için yeterli olduğundan emin olun. Ayak-tutam gerçekleştirin ve non-sorumluluk gibi için hayvan gözlemlemekcilik anestezi onaylayın.
- O zaman, burun konisi vana hattı, mühür kutusuna açık geçiş yapın.
- En kısa sürede fare anestezi olarak, kurutma ve hasardan koruyucu bir önlem olarak kornealara bir göz merhemi küçük bir miktar uygulayın.
- Daha sonra, burun konisi düzgün (bakım anestezi için) yerleştirilir ve bağlı olan, hazırlık alanı hayvan taşımak. Bu hazırlık alanında Depilasyon tarafından ameliyat için cerrahi kesi yeri hazırlayın.
- Cerrahi alan diğer tüm aktivite ücretsiz bir yerde olduğundan emin olun.
- Çalışma yüzeyi sağlam ve uygun dezenfekte, unsoiled ve dağınıklıktan arınmış ameliyattan önce olduğundan emin olun. Keten ya da üzerinde cerrahi tepsi steril parça yerleştirin.
- Operatif alan ameliyatı yapan yalnızca kişilerin mevcut olduğundan emin olun. Cerrahi oda uygun bir dezenfeksiyon ile temizlenmeli ve uygun bir temizleyici ile süpürüldü ve püskürtülür emin olunctant.
- O da uzak kapılar ve hava akımlarından olarak windows konumlandırılmış sitenin kirlenme giden toz yayılabilir emin olun.
- Steril aletler ile hayatta kalma ameliyat gerçekleştirin. Ya üreticinin tavsiyesine veya otoklav göre dezenfektan aletleri ıslatın. Kullanıma hazır olan temel steril malzemeleri kullanın.
- Ayrı araçlar işlevlerine göre steril alanlara bulaşmasını önlemeye yardımcı olur.
- Hayvanın karaciğeri erişmek için kesi (orta hat insizyonu) sitesinde etrafında yaklaşık 1 inç tıraş. Ameliyat bölgesinde uzak hayvandan saç çıkarın.
- Tıraştan sonra sabunlu dezenfektan (betadin cerrahi fırçalayın) alanı fırçalayın ve steril PBS solüsyonu ile aşırı dezenfektan silsin. Yaklaşık 5 dakika süren tüm bodur süreci ile, bu birkaç kez yapın. Çıkarın ve kullanılan eldivenler atılır.
- Daha sonra, bu tür Surgic olarak koruyucu giysi değiştirmekal elbisesi, bodur üst ve yüz maskesi. Sonraki cerrahi eldiven takmadan önce doğru fırçalayın solüsyonu ile eller dezenfekte. Not: Bu dökülme ve potansiyel kirleticiler ile cerrahi siteyi kirlenmesine önlemek için gerekli bir adımdır.
2. Cerrahi
- Anestezi tüm süre boyunca sıcaklık için bir dış ısı kaynağı sağlar. Anestezi termoregülasyonun bozuklukları neden olduğundan hayvan bazı hipotermi karşılaşabilirsiniz; Bu nedenle, vücut ısısını muhafaza.
- Ameliyat boyunca sırtında fare yerleştirin.
- Cerrahi bantlar parçaları ile ameliyat masasına ön bacaklarda, arka bacaklarda ve fare kuyruğu sabitleyin.
- Xyphisternum düz bir çizgi kesi hemen aşağı olun.
- Karaciğeri maruz steril kendini istinat cerrahi retraktörü kullanın.
- Bir şırınga yavaş ve dikkatli bir 20G iğne sahip olan 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 içeren PBS 100 ul enjekteKaraciğerin sağ lobunun içine fare HCC hücreleri.
- İğneyi çıkardıktan sonra, bağlı karaciğer yüksek vaskülarite için herhangi bir potansiyel kanamayı durdurmak için en az 1 dakika süreyle steril bir pamuklu çubuk uygulayın.
- Cerrahi klipleri kullanarak cilt kapatılması ve ardından bir emilebilir sütür ile cilt altı dokusu kapatın. Daha sonra, betadin fırçalayın ile bir kez daha yara temizleyin. Not: Bu cerrahi yaranın kapanmasını sağlayacaktır.
- Subkutan serum fizyolojik 100 ul verir.
3. Post-cerrahi
- Ameliyattan hemen sonra, fare durumun bakıcıları bildirmek için bir ameliyat sonrası kimlik kartı ile temiz bir kafes fare aktarın. Su ve yiyecek sağlamak. Not: Bizim tecrübelerimize göre, ilk 24 saatlik süre sonrası ameliyat için ıslak yiyecek ve su ile tek başına ev sahipliği eğer sadece en iyi ücret olacak ameliyat geçirmiş bir fare.
- 38 ºC aşarak değil ısı üreten bir ısı lambası ile hayvan sıcak tutun. UFare tamamen iyileşti kadar sıcaklığını ölçmek için bir termometre se.
- Tercihen kağıt yatak ile bir kafes içinde Evi hayvan konfor sağlamak için.
- İlk kurtarma sonra, rahatsızlık, kanama, ağrı ve sıkıntı belirtileri için hayvan izleyin. Ağrı gidermek için buprenorfini (0.05 -0.1 mg / kg) verin. Yakından yaklaşık 2 saat boyunca aktivitesi, davranış ve görünüm, hem de su ve gıda tüketimi izler. Ayaktan ise, farelerin normal, normal konut için geri alan hayvan taşımak ve 24 saat sonrası ameliyat için 6-12 saat aralıklarla izlemeye devam. İsterseniz bir ağırlık kontrolü yapın.
- Hayvan sorunları iyileşirken sahip Ancak, eğer uygun destekleyici bakım eylemleri. Fareler kurtarmak için yapamıyorsanız, insancıl CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon yoluyla fareler euthanize. Ötenazi için onaylanan kurumsal yönergeleri izleyin.
- Post-cerrahi, genellikle observab olan HCC klinik kanıt kontrolvücut kondisyon skoru le olarak anlamlı bir azalma. Not: Bu noktada, bir primer tümör olasılıkla karaciğerde gelişmiş ve metastatik yatakları olasılıkla akciğer gelişmiştir.
- Bu noktada, insani ötenazi deneyde yer alan (deney ve kontrol) tüm fareler kurban. Karbon dioksit ile boğularak fareler Konu: çok yavaş 5 -10 dakikalık bir süre boyunca bölme içine karbon dioksitin bırakın. Bu solunum durmasına neden olur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Balb / c fare karaciğerleri 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücrelerinde implante edildi. HCC gelişme Klinik kanıtlar 63 gün ameliyat sonrası gözlemlenebilir oldu. Sonuç olarak, fare insanca kurban edilmiştir. Otopsi Öldürülen farelerin üstünde gerçekleştirilmiştir. Akciğerler ve karaciğer, resekte edilen ve dikkatli bir brüt incelenmesi makroskopik tümörlerin belirlenmesi için gerçekleştirilmiştir. Bir farede, yüzeysel tümör karın duvarı (Şekil 1A) bazı bağlantı ile karaciğerin yüzeyi üzeri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda yöntemin derinlemesine bir açıklama (Şekil 2) son zamanlarda Ogunwobi ve HCC metastazı ortotopik singeneik fare modeli başarılı kuruluş arkadaşları tarafından rapor edildi verilir 3. Bu prosedür için tümörlerin alım oranı yüksektir. Biz daha önce% 100 3 tümör almak oranı gözlemledik. Ancak, take oranı araştırmacının yetkinlik bağlı değişken olabilir. Eğitim altında yeni bir yüksek lisans öğrencisi tarafından gerçekleştirilen son deneyde, tümör almak oranı% 40 gibi düşük o...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Makaleyi düzelttiği için Pascal DuBois'ya teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca New York Şehir Üniversitesi Hunter Koleji'ndeki Hayvan Tesisi personeline de teşekkür eder. Bu çalışma, Hunter College'a bir NIH RCMI hibesi ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mikro Diseksiyon Cımbız | Roboz | (RS-5040) | Uç 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Mikro Diseksiyon Forseps, tırtıklı kavisli uç | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 diş, kavisli uç genişliği 0.6 mm |
| Mikro Diseksiyon Retraktörü-Agricola (3 x 3 uçlu) | Roboz | (RS-6501) | Kör 3 X 3 uç, derinlik 4 mm, yayılmış 25 mm |
| Mikro Diseksiyon Retraktörü-Goldstein (3 x 3 uçlu) | Roboz | (RS-6503) | Künt, 3 X 3 çatal, derinlik 4 mm, yayılmış 19 mm |
| Jameson Kaliper (Tümörleri ölçer) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inç ölçekli, krom kaplama |
| Mikro Diseksiyon Makası, büyük halka sisörler, düz ve keskin | Roboz | (RS-5852) | 23 mm bıçaklar, uzunluk 4 inç, düz saplar ve büyük halkalar |
| Hassas diseksiyon prosedürleri için bıçaklı neşter | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Neşter sapı | Roboz | (RS-9884) | Katı |
| Littauer Dikiş Sissorları | Roboz | (RS-7074) | Uzunluk 4.5 inç |
| Kahverengi iğne tutucu, kolay dikiş bağlama için | Roboz | (RS-7960) | Dışbükey çene, ince tırtıklar |
| Refleks 7MM yara klipsleri refleks 7 klipsli aplikatör | Roboz | (RS-9262) | güvenli, güvenli alternatif yara kapatma yöntemi |
| Alet tepsisi ve kapağı | Roboz | RT-1350S | |
| Çıkarılabilir bıçaklı mini kesme makinesi | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (Mikrop Sonlandırıcı) Kuru Sterilizatör | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | Mikro diseksiyon aletlerinin hızlı dekontaminasyonu için. Aletler 15 saniye içinde dekontamine olur. |
| Mikroenjeksiyon iğneleri | VWR | BD305125 | 25G İğne |
Kaynaklar
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
