Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Özet

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, hepatosellüler karsinom (HCC) metastazı sinjeneik fare tümörü modelinin tam kanından CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Kansere bağlı ölümlerin en önde gelen nedeni kanser metastazıdır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) kanser metastazında önemli olduğunu göstermiştir. Gerçekten de, CTC'lerin sayısı tümör boyutu ile ilişkilidir. Burada, katı organ tümörü metastazının potansiyel olarak önemli moleküler mekanizmalarının aşağı akış analizine izin veren sinjeneik bir hepatoselüler karsinom (HCC) fare modelinden CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanmıştır. Bu yöntem verimli ve tekrarlanabilir. Non-invaziv bir tekniktir ve bu nedenle, komplikasyonlarla ilişkili olabilecek insanlardan alınan dokuların invaziv biyopsisinin yerini alma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, burada tartışılan yöntem, CTC'lerin tam kan örneklerinden incelenebilecek ve karakterize edilebilecek şekilde izole edilmesine ve çoğaltılmasına izin verir. Bu, tanı ve kişiselleştirilmiş hedefe yönelik tedavi gibi klinik uygulamalar için gelecekteki adaptasyon potansiyeline sahiptir.

Giriş

Kanser araştırma topluluğu, ilk kez 1869'da Thomas Ashworth tarafından gözlemlendiğinden beri dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) varlığını bilmektedir¹. O zamandan beri, CTC'lerin tümör metastazı ve hastalık progresyonu^2-5'te önemli olduğu gösterilmiştir. Günümüzde solid tümörler tüm dünyada önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. CTC'ler, primer tümörlerden kaynaklanan ve kan dolaşımı yoluyla farklı organlara giden nadir hücrelerdir ve bunların sadece küçük bir kısmı sonuçta metastaz^2-5'e dönüşür. Özellikle, tümör boyutu ile^{CTC numarası 3,4} arasında pozitif korelasyon vardır.

CTC biyolojisinin anlaşılması, hedefe yönelik tedavi arayışına katkıda bulunabilir. Ayrıca, CTC'lerin teşhis uygulamaları olabilir. Bu potansiyel klinik uygulamaları başarmak için, CTC'leri incelemeye yönelik bazı güncel zorlukların üstesinden gelmek gerekir. Bir zorluk, CTC'lerin tek hücreler veya kümeler halinde bulunabileceği ve hatta kan mikroçevresine yanıt olarak fenotiplerini değiştirebilecekleri gerçeğiyle ilgilidir². Ayrıca, kısmen, kandaki mililitre başına bir milyarhematolojik hücre arasındaki düşük CTC sayısı (mililitre başına birkaç ila yüzlerce) nedeniyle tespit çok zor olabilir⁶. Bununla birlikte, son yıllarda, katı organ kanserlerinden CTC'lerin potansiyel klinik uygulamalarına yönelik araştırmalar yoğunlaşmıştır.

Bu çabalara rağmen, CTC'lerin rolünü incelemenin ve anlamanın zorlukları, CTC'lerin nadir olması ve şu anda mevcut olan teknolojik araçların yetersizliği nedeniyle devam etmektedir. Bu zorluklara rağmen, klinik uygulamalar için muazzam potansiyel, CTC'lerin kanser metastazındaki rolüne ilişkin araştırmaları sürdürmek için bir teşvik olmaya devam etmektedir.

Yakın zamanda, hepatoselüler karsinom (HCC) metastazı^5'in ortotopik sinjeneik fare modelinden hücre kültürü CTC'lerini izole etmede ve çoğaltmada başarılı olduk. Bu makalenin amacı, başarılı metodolojinin tüm yönlerini ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Bu metodolojinin önemi, bu yaklaşımın, insan CTC'lerini kültürde başarılı bir şekilde izole etmek ve çoğaltmak için değiştirilebilmesi ve böylece CTC biyolojisinin in vitro çalışmalarının olasılığını arttırması gerçeğinde yatmaktadır.

CTC'lerin kullanımı için birden fazla potansiyel klinik uygulama vardır. CTC'ler prognoz, yanıt izleme, tarama, tümör moleküler değişikliklerinin dinamik izlenmesi ve kişiselleştirilmiş tedavi için yararlı olabilir⁴. Bu nedenle, CTC'lerin biyolojisinin daha iyi anlaşılması, klinik etki için yüksek potansiyele sahiptir.

Protokol

Etik Beyanı: Tüm hayvan çalışmaları New York Şehir Üniversitesi Hunter College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ön deneme İşlemleri

1. Hayvan tesis varışta, başlangıçta süzülmüş üst ve ahşap talaş yatak ile bir kafese 3 BALB / c fareler ev. Fareler yiyecek, purina kemirgen yemi ve su ücretsiz erişimi olduğundan emin olun. Kafesleri haftada bir kez temizlenmesi gerekir iken Yatak ve gıda haftada iki kez değiştirilmelidir.
2. Dakika başına 1 L sabit bir akış oranında oksijenle birlikte izofluran buharlaştırıcı kullanılarak farelerde, genel anestezi neden. Sistem kendine güvenen ve hassas buharlaştırıcı içerir.
3. Buna bağlı hassas buharlaştırıcı ve gaz / anestezik sistemine sahip bir plastik kutu içinde Pozisyon hayvan. Hayvan hangi noktada 2 buharlaştırıcı düşürmek, bilinçsiz kadar Başlangıçta 2.5 buharlaştırıcı ayarlayın.
4. O zaman, geçişVana hattı, kutu onu sızdırmazlık ve burun konisi onu açmadan.
5. Burun konisi (bakım anestezi için) düzgün yerleştirilmiş ve bağlanmış olan, hazırlık alanına hayvan hareket ettirin.
6. Fare başına implantasyon için 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücreleri hazırla. BNL 1ME A.7R.1 ortamında büyüyen olmalıdır (% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) hava ve% 5 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de bir hücre kültür kabı içinde inkübe CO _2.
7. Bir şırınga, bir 20 G iğne sahip olan, BALB / c farelerinin karaciğerinin bir kulak memesine 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 fare hepatoselüler karsinoma hücreleri ihtiva eden PBS implant 100 ul primer tümör üretmek. Sonrası emplantasyon ev ön implantasyonu ile aynı ev gereksinimleri olan bir kafese, BALB / c farelerinde indüklenmiştir.
8. Deneysel uç noktada, hepatosellüler karsinom klinik kanıt vücut kondisyonu önemli azalma olarak gözlemlenebilir(genellikle 4 hafta sonra tespit) skoru. Bu noktada, metastatik yatakları akciğerlerde oluşmuş ise primer tümörler, karaciğer gelişmiştir bir olasılık mevcuttur. Bundan sonra, dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonu ve yayılma süreci başlar.

Tümör Hücre İzolasyonu Sirkülasyon Tüm Kanı 2. Koleksiyonu

NOT: Düzgün cerrahi alan dezenfekte ve dağınıklıktan arınmış olduğundan emin olun. Tüm cerrahi aletler otoklav veya üreticinin tavsiyesine göre bir dezenfektan emmek

1. Deneysel sonu noktasında insani ötenazi (tümör gelişiminin klinik kanıt) tarafından fareler Kurban. Farelerin Euthanization _CO2 boğulmaya içermelidir. Anestezi onaylamak için düzgün fareler uyun doğru dağıtılır. Solunum durduracak şekilde 10 dakika - Karbondioksit 5 bir süre boyunca odaya yavaş yavaş serbest bırakılması gerekir. Intrakardiyak kan kaybından ve cervic tarafından takipal çıkığı. ⁵
2. Tam kan toplanması için bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne kullanın. 0,01 mi heparin ile şırınga Heparanize. Xyphisternum yaklaşık 45 ° açı ile aşağı iğne ile hemen Delinme cilt. Kalbi delinme yavaş yavaş iğne Advance, sonra iğnenin açısını azaltın. Mütemadiyen yerinde iğne ve şırınga tutun ve 500 ul dışarı çıkartalım - kalpten kanın 1.000 ul.
3. Şırınga ve iğne çıkarın ve önceden etiketlenmiş 1.5 ml'lik pirojensiz tüp içine kan transferi. 5 dakika boyunca 1167 x g'de 1.5 mi pirojensiz tüpe tam kan santrifüjleyin.
   Not: santrifüj, üç tabaka halinde, tüm kan örneğinin ayırır: kırmızı kan hücreleri, buffy coat bir ara ince tabaka, ve bir üst plazma katmanının oluşan alt ya da hematokrit katmanı.
4. Pipetle dikkatlice plazmayı çıkarın ve Furth için ayrı 1.5 ml pirojensiz tüp içine toplamaBu tür hücre içermeyen nükleik asitlerin ⁷ algılama gibi er deneyleri.
5. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) izolasyonu için, kırmızı kan hücresi (RBC) lizis hazırlanmasında ayrı bir 1.5 mi pirojensiz tüp içine buffy coat toplar. Bu ince beyaz tabaka tabakası kalıntı eritrositlerde kaldırmak için gereklidir.

Kırmızı kan hücresi (RBC) Liziz Tamponu 3. Tarif

1. RBC parçalama tamponu 1 L'lik bir çözelti sağlayın.
2. Bir amonyum klorür 500 ml Tris, 500 ml sağlayın. Daha sonra amonyum klorür 155 mM ve Tris, 10 mM bir son konsantrasyonda olan RBC parçalama tamponu 1 L'lik bir çözelti oluşturmak için karıştırılır.
3. 7.5 arasında bir pH değerine çözeltisi Tampon. 2 8 ° C'de RBC parçalama tamponu Mağaza ve kullanımdan hemen önce oda sıcaklığına getirin.

Buffy Coat 4. RBC Liziz

1. Toplanan ince beyaz tabakayı içeren steril pirojensiz bir 1.5 ml'lik tübe RBC parçalama tamponu 1 ml ilave edilir.
2. Tüpün içeriği karıştırınbirden çok kez ters yüz. Bankta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırılır tüpün içeriği inkübe edin. X g 1.167 5 dakika boyunca karıştırılır içeriği santrifüjleyin.
3. Santrifüj işleminden sonra, beyazımsı bir pelet elde edilir. Pelet herhangi bir kesinti olmadan yavaş ve dikkatli% 10 çamaşır suyu içine kırmızımsı süpernatant atın. 3.5 - pelet beyazımsı değilse, yeniden do 3.1 adımları tekrarlayın. 10 RBC parçalama tamponunda kuluçka süresinin arttırılması - 15 dakika da yararlı olabilir.
4. % 10 çamaşır suyu biyolojik atık arındırma 24 saat sonra tamamlandığında Güvenle biyolojik atıkların imha edin.

Hücre Kültürü 5. Yayılım

Not: Tümör hücreleri tipik olarak hızlı bir şekilde hücreler kabı içine ekilmiş hücrelerin özgün bir karışımı bol miktarda bulunan, beyaz kan hücreleri büyümektedir. Ortamının tekrar tekrar değiştirme ve kapalı zaman eğrilerinin sonraki geçişleri sonra tüm akyuvar çıkarılır ve kapalı zaman eğrilerinin nispeten saf popülasyon kalır.

1. Sonraki% 10 çamaşır suyu içine süpernatant atarak, hücre kültürü içinde yayılma için tam kültür ortamı içinde en az bir kez 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde beyaz pelet yıkayın ve süspansiyon haline getirin.
2. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelet tam BNL 1ME A.7R.1 kültür ortamında (FBS,% 10 ısı,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) 1 ml ekleyin ve kültür ortamında pelletini.
3. Bir hücre kültür çanak içine hücreleri yeniden süspanse karışımı Tohum. Hava ve% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de hücre kültürü çanağı inkübe edin.
4. Her iki veya üç gün hücre kültür ortamı değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, KTC hücre kültürü çanak yapıştırılır ve çoğalan başlamış olacak. Bu hücreler 25 pasajlar ötesinde ve tekrarlanan donma ve çözülme döngüleri ⁵ sonra canlı kalacaktır.

Hepatosellüler karsinom 6. Doğrulama Tümör Hücre Hattı Sirkülasyon

1. Ap gerçekleştirinzincir reaksiyonu (PCR) bazlı bir yöntem olymerase, yeni bir CTC hücre çizgileri, orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 HCC çizgi gibi fare hücreleri kurulan onaylamak için fare β-globin geninin sadece tek bir özel DNA bölümünün yükseltilmesi için. Yöntem aslında anlatılan ve Steube ark doğrulandı. ^5,8
2. Belirli bir antikor kullanarak protein 3 gibi 3 (CREB3L3) bağlanma hepatosite özel işaretleyici cAMP yanıt elemanı için immün gerçekleştirin. Bu kurulan KTC gerçekten orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 hücre hattı gibi hepatositlerin bu romanı teyit edecektir. ⁵

Sonuçlar

Burada tarif edilen yöntem kapalı zaman eğrilerinin izole edilebilir olduğunu göstermiştir. Fareler insanca deneysel sonu noktasında ötenazi edildi. Süreç katılan karbondioksit asfiksi, intra-kardiyak kan kaybı ve servikal dislokasyon. Prosedürün temel aşamalarının bir şeması, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Intrakardiyak eksanguinasyon yoluyla toplanan tam kan örnekleri, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak işlenmiştir. Bundan sonra, santrifüjleme RBC lize tabi tutuldu ve ince b...

Tartışma

Bu çalışmada, HCC'li sinjeneik bir farenin tam kanından CTC'lerin nasıl izole edileceği ve çoğaltılacağı anlatılmıştır. Bu çalışmanın amacı, kanser metastazı mekanizmaları ile ilgili devam eden çalışmaları geliştirmektir.

Birçok kanserin kötü prognozuna katkıda bulunan bir faktör, malignitenin zamanında tespit edilmemesi ve bunun sonucunda yaygın olarak yayılmasıdır³. CTC'ler birincil kanserlerden kaynaklanır ve kan dolaşımı yoluyla uzak organlara yayılır. Bu nedenle, CTC'ler kanse...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Heparin Sodyum Tuzu 1 g	VWR	89508-852
BTX Tüp Mikro 1.5 ml Şeffaf NS	VWR	89511-254	1.5 ml  Pirojen İçermeyen Eppendorf Tüpleri
İğne Steril Disp BD 25 G x 1 inç	VWR	BD305125	25 G İğne
Slp Ucu SRNG 1 ml 200 paket başına	VWR	BD309659	1 ml şırınga ucu
Şırınga 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml şırınga
VWR Forseps Doku 6	VWR	82027-446	Forseps
Cyromold girişi 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct bileşeni 4 oz	VWR	25608-930	Oct bileşik
VWR Slayt sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slaytlar
VWR Kapak Camı #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Kapak Camı
VWR Slayt Kutusu Gerçek Kuzey Fm Pu	VWR	89140-278	Slayt Kutusu
Süper HT PAP Kalem	VWR	89427-058	PAP kalem
Su RNASe ve DNAse içermez 2 L	VWR	101454-204	Nükleaz İçermeyen
Su Tamponu Tris Ultra Saf Sınıf 500 g	VWR	97061-796	Tris Tampon
Amonyum Klorür ACS Sınıf 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Amonyum Klorür Tampon
Falcon Doku Kültürü Kabı 60 x 15 mm Stil polistiren	VWR	353002	Doku Kültürü Kabı
Clorox Antiseptik Ağartıcı, Normal	VWR	89501-620	Clorox Çamaşır Suyu
PBS, 1x (Fosfat Tamponlu Salin) kalsiyum ve magnezyum içermez (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  4.5 g/L glikoz ile & Sodyum piruvat içermeyen L-glutamin	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM BNL 1ME A.7R.1 hücreleri için 1x ortam
Fetal Sığır Serumu	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penisilin Streptomisin Çözeltisi, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penisilin Streptomisin
Sorvall Biofuge pico Thermo	Fischer Scientific	75002411	13.000 rpm Santrifüj