Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

17.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

21 Mayıs 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Özet

Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (>% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.

Giriş

Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir.

En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü gebeliğin 10-16 erken ve geç evrelerinde hastalık mekanizmasını kabul edilir. Maternal-fetal tolerans T hücreleri (düzenleyici T hücreleri, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri ve Th17 hücreleri), mac dahil olmak üzere çeşitli lökosit alt popülasyonları, katılımını gerektirirrophages, nötrofiller, mast hücreleri, NK hücreleri, ve NKT hücreleri, dendritik hücreler ve B hücreleri, gebelik 15,17-19 boyunca yoğunluk ve lokalizasyon bu değişiklik. Annenin bağışıklık sistemi cenin antijenler 20,21 ile etkileşime anatomik sitede - Maternal-Fetal tolerans maternal-fetal arayüzü 20'de zenginleştirilmiştir.

Fetal extravillous trofoblastların rahim mukozası 22-24 istila ettiğinde maternal-fetal arayüz plasenta sırasında oluşturulur. Bu arayüz fetal tarafında, fetüsü çevreleyen zarlar plasenta içindeki özel bir epitel yüzey oluşturmak ve sinsityotrofoblast hücreleri anne kanındaki 22 ile doğrudan temas yoluyla besin alışverişini kontrol eder. Arayüzü maternal tarafında, Desidua farelerde bütün desidual hücrelerde% 50% 30'unu lökositlerin heterojen havuz işe. MATERN katılımları yanı sıraEl immun tolerans, bu hücrelerin gebelik sırasında farklı süreçler, örneğin., enfeksiyonlar, döllenmenin gelen üreme sisteminde korunması, embriyo implantasyonu 7,25, desidual anjiyogenez 26 vasküler remodeling 24,27, trofoblast invazyonu 28, plasental anahtar sebeplerindendir kalkınma 24,25 ve nihayetinde, emek ve dağıtım 15,17. Bu nedenle, maternal-fetal tolerans katılan lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonların patogenezi aydınlatılması esastır.

Immünhistokimyasal ve immünofloresan kullanımı doğrudan görselleştirme ve uterin, desidual veya plasental lökositlerin 29,30 lokalizasyonu için veri üretti ederken, ayrıca bu dokuların 31,32 her lökositlerin belirli alt kümelerini ortaya çıkarmıştır sitometri analizi akış. Ayrıca, sitometri yoğunluğu ve mater oranını belirlemek için kullanılır olmuştur akışNAL fetal arayüz hücre dışı ve hücre içi proteinlerin 8-10,34 33 ve ekspresyon seviyelerini lökosit. Maternal-fetal arayüzünde lökositlerin sitometrik akış analizi tek bir hücre süspansiyonu gerektirir. Desidual, rahim ve plasenta dokularından süzücü lökositlerin izole etmek için, doku ayrışma için iki yöntem kullanılmıştır: mekanik ve enzimatik. Her iki yöntem de, bu dokuların hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili infiltre lökosit ayrılmasını sağlar. Daha az kesme kuvveti ile ilişkili hasar 35 ile lökositlerin yüksek verim verir gibi enzimatik doku ayrışma mekanik doku ayrılma üstündür. Sonuç olarak, mekanik doku ayrışma örnekleri değişkenliği ve heterojenitesini artırabilir dokuların 36, havuzlama gerektirir. Bununla birlikte, mekanik ayrıştırma İlgi konusu antigen enzimatik ayrışma veya değiştirilebilir zaman seçim olabilir hücre işleviFaiz ihtiyacı s korunacak (örn., NK hücrelerinin sitotoksisite) 35.

ECM aşağılamak özel enzimlerle proteoliz kullanımı mekanik ayrışma ile gözlenen düşük verim ortadan kaldırır. Çeşitli çalışmalar tripsin 32, kollajenaz 37, DNaz 31, 38 dispase ve çeşitli enzimlerin 32,39 ticari kokteyller kullanımını bildirmişlerdir. Bununla birlikte, doğal ve farklı enzim konsantrasyonu ve sindirim süresi titizlikle tanımlandığı gibidir ve immünofenotipleme için gerekli olan hücre yüzeyi antijenik epitopların bütünlüğünün korunmasını sağlamak için doğrulanması gerekir. Çeşitli yüzey yapıları bir çok monoklonal antikorlar tarafından tanınan lökosit yüzey epitoplarını sıyırma için ünlü olan tripsin gibi bazı enzimler ile, farklı enzimlerin yok farklı olarak duyarlı olan.

Bu tarifnamede sunulan bir proteolyt kullanılan bir yöntem olupAccutase denilen ic ve kolajenolitik enzimatik kokteyl. Bu enzimatik solüsyon kadar anne-fetal arayüzünde sıçangil hücreleri ayrıştırma sırasında halen etkin nazik ve ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için başka ayrışan reaktifler veya serum eklenmesini gerektirmez. Ayrışma zamanı doğrulanması gerekiyor, ancak Ayrıca, yukarıda belirtilen enzimler 40,41 daha sağlamdır, tedarik edildiği gibi kullanıma hazırdır ve.

Doku ayrıştırma her iki tip bir kombinasyonunun kullanılması elde edilen hücrelerin kalitesi ve miktarı artırır; Böylece, çeşitli çalışmalar tatmin edici sonuçlar 31,32,37 ile mekanik ve enzimatik ayrılma kombine kullanımının hayata geçirdik. Burada tarif edilen bir protokol kurulmuş ve laboratuvarda doğrulandı; o sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif bir mekanik ayrışma bir arada kullanır. Bu protokol izolasyonu ve daha fazla çalışma izin verirmaternal-fetal arayüzünde fare dokularda sızan lökositler (rahim, desidua ve plasenta). Akış sitometrik analizi ile gösterildiği gibi, aşağıdaki protokol aynı zamanda, hücre yüzey belirteçleri ve aşağı doğru uygulamalar için verim kadar canlı hücre bütünlüğünü korur. Son olarak, bu protokol analizi ve maternal-fetal arayüz oluşturan farklı fare dokuların karşılaştırma için hücre hazırlama tutarlılığını korumaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, hayvan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları tarafından verilmelidir. Hayvan kanı, hücreleri, ya da bu protokolde belirtildiği gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, uygun biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmelidir.

1. Fare Taşıma ve Doku Koleksiyonu

  1. Steril bir iş istasyonu hazırlayın ve doku toplama steril araçlar edinin. Bu araçlar büyük ve küçük cerrahi makas, forseps ve ince uçlu cımbız içerecektir. (- 22 ° C 20), oda sıcaklığına dengelendi - (5 mi 3) 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi ile doldurulmuş uygun doku adlarını taşıyan kültür kaplarına, içerir. (- 15 mi 10) da 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş, etiketlenmemiş büyük bir Petri kabı, içerir.
  2. Hamile bir fare Euthanize (10,5-19,0 ​​gün sonrası coitum (DPC) ya da teslimattan önce) karbondioksit kullanarak (CO 2). Fare ötenazi emin olmak için, servikal dislokasyon tekniği kullanın.
    Not: 10.5 DPC önce, manüel olarak uterus dokulardan desidual dokuları ayırmak zordur. Desidual lökositlerin izolasyonu gerekli değilse, rahim gebe olmayan farelerin dokularında ya da fareden olanlardan lökositler <10.5 DPC de bu protokol takip edilerek gerçekleştirilebilir.
  3. Steril cerrahi makas kullanılarak, tam olarak deri ve kas dokusu alt karın kısmı çıkartın. Forseps ile rahim kadar bir kenara diğer tüm organları taşımak ve yumurtalıklar görebilir. Rahim hala bağlı olan, periton boşluğuna (Şekil 1A) dışına hareket ettirmek için forseps kullanır.
  4. Her uterin boynuz yumurtalık ve uterotubal kavşağına uzak yumurtalıkların bulun. Küçük cerrahi makas kullanarak, uterotubal kavşakta bir kesi yapmak ve rahim damarları içeren mezenter gelen rahim boynuzları ayrı; o zaman,servikste tüketim periton boşluğuna (Şekil 1B) den rahim boynuzları ayırmak için.
  5. Küçük cerrahi makas ile, serviks ve uterus boynuzları alt segment arasında bir kesi yapmak. Ara uterin boynuzu açma önlemek için bu işlem (Şekil 1C) serviksin bir kısmı eklenmiş.
  6. Implantasyon siteleri nemlendirmek için - (15 ml 10) 1x PBS çözeltisi ile dolu büyük bir Petri kabındaki (serviks dahil) rahim boynuzları daldırın.
  7. Hala 1x PBS çözeltisi batırılır iken, küçük cerrahi makas ile rahim boynuzları gelen herhangi bir yağ kırpın. Diseksiyon boyunca 1x PBS çözeltisi dalmış dokuların tutun.
  8. Forseps ile yerde rahim boynuzları Holding, küçük cerrahi makas (Şekil 1D) kullanılarak arası implantasyon bölgesinde kesti bir enine ile rahim implantasyon sitelerinden birini kaldırın. implantasyon sitesi çevrili fetus içerirkoriyoallantoik membran ve rahim, desidual ve plasental dokuların.
  9. Forseps kullanarak, yerinde siteyi tutun ve plasenta ve desidual dokularda (Şekil 1E) komşu rahim duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu rahim duvarına ve fetus içeren chorioallantoic membran (Şekil 1F) hem ayrılmış hale gelene kadar plasenta / desidua çevresinde Trim.
  10. 1x PBS çözüm plasenta ve ekli desidual doku ve yer çıkarın (3-5 ml; adım 1.12 bakınız).
  11. (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının bağlı chorioallantoic membran ile çevrelenmiş fetus yerleştirin. Bu dokuların hidrasyon rahim duvarından korioallantoik membranın ayrılmasını kolaylaştıracaktır (adım 1.14 bakınız).
  12. Ince uçlu bir cımbız kullanarak, yavaşça plasenta yüzey desidual doku (beyaz-gri tabaka) soyun. Bu gerçekleştirinplasenta ve desidual dokularda (Şekil 1G) bütünlüğünü korumak için dikkatli adım.
  13. (- 5 ml her 3) 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş iki ayrı etiketli Petri kapları plasenta ve desidua dokuları yerleştirin.
  14. Yavaşça ince uçlu cımbız ile chorioallantoic zarından rahim duvarına çıkarın. Bu rahim dokulardır.
  15. (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının yerleştirin.
  16. Tüm implantasyon yerleri işlendikten yineleyerek 1.15 ile 1.8 adımları.
  17. Enzimatik sindirim sırasında hücre verimini artırmak için çok sayıda uterin, desidual ve plasental dokularda toplayın. dokuların miktarı çöp boyutuna bağlıdır; Bununla birlikte, lökosit yalıtım doku> 2 adet gerektirir.
    Not: Farklı gestasyonel günlerde implantasyon sitelerinin diseksiyonu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için, soruşturmalar için Kılavuzu, Bölüm İki bulunan resimleri görüntülemekFare Gebelik 42 üzerinde.

2. Rahim, Desidual ve Plasental Doku Ayrılma

  1. Uygun doku isimde çok sayıda steril 2 ml konik tüpler etiketleyin ve buz üzerinde enzimatik solüsyon 1,000 ul bir şişe yerleştirin.
  2. Etiketlenmiş bir 2 ml konik tüp, uterin, desidual ya da plasental dokularda - (150 ila 100 mg), 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş petri, iki parça aktarın.
  3. Her bir 2 ml konik tüp içine soğuk bir enzimatik solüsyon 500 ul ekle.
  4. Ince steril makas ile, ince kıyılmış kadar enzimatik solüsyon batırılır doku ayırmak başlar. Zamanla, süspansiyon sütlü bir görünüm geliştirecektir. Bu aşama, örneğin aşırı manipülasyonu önlemek için en fazla 2 dakikayı geçmemelidir.
  5. Doku ayrışmış sonra, 2 ml konik tüp, soğuk enzimatik solüsyonun bir ilave 500 ul ekle.
  6. Buz üzerinde 2 ml konik tüp yerleştirin.
  7. Tüm dokular işlendikten yineleyerek her doku ile 2.6 ile 2.2 arasındaki adımları.
  8. 37 ºC bir inkübatör içine buz homojenize doku (kıyılmış dokuya + enzimatik solüsyon) numuneler ile tüm 2 ml konik tüpler aktarın ve nazik bir yörünge ajitasyon (80 rpm) gerçekleştirin. 35 dakika - 30 inkübe. Kuluçka sıcaklığı inkübasyon süresi başlamadan önce stabilize olduğundan emin olun.
  9. İnkübasyon sonrasında, inkübatör ayrışmış dokularla 2 ml konik tüpler çıkarın ve başka sindirim önlemek için buz üzerine koyun.
  10. Doku tipine bağlı olarak, steril 50 ml konik tüp etiketleyin. Kapakları çıkarın ve steril bir hücre süzgeç (100 mikron gözenek boyutu) ile değiştirin.
  11. ~ 1 x PBS çözeltisi 20 ml hücre süzgecinden konik tüp kullanılarak 2 ml ayrışmış dokuları dökün. doku fragmanları hücre süzgecinden kalır ve hücre süspansiyonu içinden geçecek.
  12. Di yıkayınhücre süzgecinden ssociated dokular 2 - Bir transfer pipeti kullanarak, 1x PBS çözeltisi, 20 ml ile 3 kez.
  13. Boş 2 ml 1 x PBS çözeltisi (1 mi) ile konik tüp durulayın ve hücre süzgeçler yoluyla içeriğini dökün.
  14. 50 ml konik tüpler hücre süzgeçler çıkarın ve kapaklarını değiştirin. 4 ºC de 10 dakika boyunca 1.250 xg'de tüpler santrifüj.
  15. Dikkatle, hücre pelet bozmadan süpernatant aspire. Hücre pelet izole lökositler ve stromal hücreler içerir.
  16. Fetal sığır serumu (FBS) içermeyen RPMI kültür ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hafifçe karıştırın. Vorteks kullanmayın.
  17. 5 ml polistiren plastik tüp düzgün FBS 500 ul ekleyin ve yavaş yavaş hücre süspansiyonu kaplaması.
  18. Hücresel kalıntı PBS / FBS arayüzde korunur ise, oda sıcaklığında freni olmadan 1,100 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj canlı hücre pelet.
  19. Hücre pelet dokunmadan süpernatant aspire. cell pelet çoğunlukla canlı hücreleri içerir.
  20. İsteğe bağlı: Aşağıda açıklandığı gibi mononükleer hücreleri konsantre etmek,% 20 doymuş polisakkarit çözümü kullanın.
    1. FBS'siz RPMI kültür ortamının 1000 ul hücre pelletini.
    2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 5 ml polistiren plastik tüpe% 20 doymuş polisakarit çözeltisi 1 ml ilave edilir ve yavaşça, bu çözeltinin üzerine hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman birlikte, hücre süspansiyonu% 20 doymuş polisakarit çözeltisi karıştırma kaçının.
    3. Frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 xg'de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücrelerin karıştırma ve degrade kaybetmemek için fren kapatmak için çok önemlidir. Mononükleer hücreler,% 20 doymuş polisakarit çözeltisi ve 1 x PBS çözeltisi arasında arayüzde bulunacaktır.
    4. Aspire ve süpernatant atın. Hücre topağı çoğunlukla mononükleer hücreleri içerir.
      Hayırte: gerçekleştirmek için adım 6'ya bakınız, izole lökositlerin hücre kültürü gerçekleştirmek için adım 5. bkz canlılık boyama ve sadece dışı boyama gerçekleştirmek için adım 4. bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için 3. adımı bkz canlılık boyama ve hücre içi boyama gerçekleştirmek için Manyetik hücre sıralama, adım 7 bkz.

Tamir edilebilir Hücreler 3. geçerlilik boyaması

  1. 1x PBS çözeltisi 1.100 ul hücre pelletini. Hafifçe mikro-pipet kullanılarak karıştırılır.
  2. 5 ml'lik bir polistiren plastik tüp içine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. 5 ml polistiren tüp 1x PBS çözeltisi 400 ul ekleyin. Bu tüp, doku bir oto-floresan için kontrol edilmesidir. Adım 3.5 kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Yeni 5 ml polistiren plastik hücre süspansiyonunun tüpe Geriye kalan 1000 ul aktarma. Canlılık boya 1 ul ekleyin ve hafifçe homojenize. 4 ° C'de karanlıkta 30 dakika süreyle inkübe edilir.
  4. İnkübasyon sonrasında, 1,000 & # ekleyin181; 1 x PBS çözeltisi l. Elle hafifçe karıştırın.
  5. Santrifüj her ikisi de 5 ml polistiren tüpler 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1250 x g'de (3.2 ve 3.3 adım). Aspire ve süpernatant atın.
    Not: hücre topağı (aşama 3.3), doku bir oto-floresan için bir kontrol olarak hizmet edecek aşama 4. hücre topağı (aşama 3.2) kullanılır.

4. İmmünofenotipleme

  1. Anti-fare CD16 / CD32, 50 ul hücre pelletini (1 seyreltilmiştir: FACS tampon maddesi içinde 100 [% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid, 1x PBS çözeltisi, pH 7.4]). Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. Vorteks kullanmayın.
  2. 10 dakika boyunca 4 ° C de karanlıkta 5 ml polistiren bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, hücre-dışı hücre yüzey markörlerinin veya izotip-eşleştirilmiş kontrol antikoru ile reaksiyona sokulması her anti-lökosit monoklonal antikor 50 ul (antikor seyreltme doğrulanması gerekir) ekleyin. Örneğin, lökosit alt popülasyonları analiz anti-mo kullanmak içinCD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 (Tablo 1): Aşağıdaki lökosit hücre yüzey belirteçleri ile reaksiyona antikorları kullanır.
  4. Hücre-dışı belirteçleri karşı antikorlar, 5 ml polistiren plastik tüpe ilave edildikten sonra, yavaşça karıştırın. 4 ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
  5. Bu kuluçka sırasında hazırlanması ve (iyonu giderilmiş su ile seyreltildi, 1: 5) sabitleme tampon çözeltisi önceden ısıtmak, gerekirse 37 ºC'ye. Kullanımı gereklidir kadar karanlıkta 37 ºC 'de tampon tutun.
  6. 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 ml polistiren plastik tüp FACS tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Bu adım, hücrelerin yıkayın ve bağlanmamış antikor fazlasını uzaklaştırmak için gereklidir.
  7. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1,250 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın.
    Not: hücre içi boyama gerekli değilse, hücre içi boyama gerekli ise, adım 5 bkz geçirgenliği yapmak ve hücreler arasıular boyama burada ve daha sonra sabitleme (adım 4.8) ile devam edin.
  8. Hücre pelletine önceden ısıtılmış sabitleme tampon çözeltisi 500 ul ilave edin ve 37 ° C 'de 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir.
  9. 5 ml polistiren plastik tüp içine FACS tampon 500 ul koyun. Hafifçe karıştırın.
  10. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1,250 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın.
  11. Her bir örnek için FACS tampon 500 ul ekle. Bu örnekler hemen akış sitometrisi ile analiz edilebilir. En iyi sonuçlar için derhal örnekleri edinin.

Unfixable Hücreler 5. geçerlilik boyaması

  1. Hücre-dışı immünofenotiplendirme sonra FACS tampon 500 ul hücre pelletini.
  2. Sadece örnek elde edilmesinden önce 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI, 200 ug / ml) 1 ul ekle.
  3. Debi sitometresinde DAPI ekledikten sonra 2 dakika - 1 içindeki örnekleri gözünüzde canlandırın.

6. Hücre Kültürü

  1. Steril bir davlumbaz altında bir iş istasyonu hazırlayın. Bir su banyosu kullanılarak 37 ° C RPMI kültür ortamının önceden ısıtın.
  2. Hücre sayımı için FACS tampon 1000 ul hücre pelletini.
  3. Üreticinin talimatlarına göre bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanılarak canlı hücre sayısı, saymak. Toplam canlı hücre sayısını kaydedin.
  4. Santrifüj 4 ° C'de 1,250 x g'de hücreler 10 dakika FACS tampon kaldırmak için.
  5. Yavaşça 2-3 kez pipetleme önceden ısıtılmış RPMI kültür ortamında 500 ul hücre pelletini.
  6. Steril 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin istenilen sayıda plaka ve 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka süresi araştırma sorusu ile belirlenecektir.

7. Manyetik Hücre Ayırma

  1. MS sütunlar, manyetik hücre ayırıcı, 15: Aşağıda yer alan maddelerle temiz bir iş istasyonu kurmakml konik tüpler, 30 mikron ön ayırma filtreleri ve bir çok standı.
  2. MACS tamponu (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS çözeltisi, pH 7.2) içinde 500 ul hücre pelletini.
  3. Otomatik Hücre sayıcı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözümü kullanarak, saymak ve toplam canlı hücre sayısını kaydedin.
  4. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1,250 x g'de hücreleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu başka 500 ul ekleyin.
  5. Üreticinin önerilerine aşağıdaki manyetik ayırma gerçekleştirmek için devam edin.
  6. Flow sitometri veya mikroskop ile saflığını belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

maternal-fetal arayüzü fare dokuların diseksiyonu Şekil 1'de gösterilmiştir; Bu prosedür, periton boşluğu (Şekil 1A, B), emplantasyon yerlerinin (Şekil 1D) içeren rahim boynuzları (Şekil 1C) ve uterus dokularının toplama (Şekil 1E), plasenta (Şekil 1F) ve desidual dokuları açıklığı kapsamaktadır 16.5 at (Şekil 1G) DPC. Şekil 2 izole makrofajlar morfolojisi göstermektedir (F4 / 80 +)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları farklı kullanır gerektiren farklı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.

Teşekkürler

NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Magentic Hücre Ayırma
MS SütunlarıMilitenyi Biotec130-042-201
Hücre AyırıcıMilitenyi Biotec130-042-102
30 μ m ön ayırma filtreleriMilitenyi Biotec130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
15 ml konik tüplerThermo Fisher339650
MACS TamponuMilitenyi BiotecLaboratuvar hazırlığı(%0.5 sığır serum albümini, 2mM EDTA ve 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Akaktaz enzimatik çözeltiYaşam TeknolojileriA11105-01
Anti-fare CD16/CD32BD Biosciences533142
Anti-fare hücre dışı antikorlarBD Bioscences/eBiosciencesTablo 1
Sodyum azidFisherS227-500
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
LIVE/DEAD canlılık boyasıYaşam TeknolojileriL23105
Fiksasyon tampon çözeltisiBD Biosciences558049
FACS TamponuBD BiosciencesLaboratuvar hazırlığı%0.1 BSA, %0.05 sodyum azid, 1x PBS, pH 7.4
Tripan mavisi çözeltisi %0.4BIO-RAD145-0013
Fetal sığır serumu (FBS)Yaşam Teknolojileri16000-044
Additional Instruments
Çalkalayıcılı inkübatörThermo ScientificMaxQ 4450
Akış sitometresiBD LSRFortessa
SantrifüjTermo Bilimsel EfsaneLXTR
Vakum sistemilaboratuvarı inşa edildi
Kuluçka makinesiThermo Scientificİnkübatör 3307
Su banyosuHassas51221035
Hücre sayacıBIO-RADTC20 Otomatik Hücre Sayacı
Optik ve floresan mikroskoplarZeiss ve OlympusZeiss LSM780 ve Olympus CKX41

Kaynaklar

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

L kosit zolasyonuEnzimatik SindirimMekanik DissosiasyonFetal Bovine Serum Gradyanmm nofenotiplemeH cre Ay klamaH cre K lt rAk Sitometrisi
Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.