Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Summary

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), biyolojik zarların görüntülenmesine izin veren çok yönlü, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme tekniğidir. Membran alt yapılarını ve hatta tek tek molekülleri incelemek için yeterli büyütme oranına sahiptir. AFM, membranların etkileşimlerini ve mekanik özelliklerini ölçmek için bir kuvvet probu görevi görebilir. Desteklenen lipid çift katmanları, AFM çalışmalarında geleneksel olarak membran modelleri olarak kullanılır. Bu protokolde, desteklenen çift katmanların nasıl hazırlanacağını ve AFM kullanarak yapılarını ve mekanik özelliklerini nasıl karakterize edeceklerini gösteriyoruz. Bunlar, iki tabaka kalınlığı ve nüfuz etme kuvvetini içerir.

AFM görüntüleme ve kuvvet spektroskopisi tarafından sağlanan bilgiler, membranların mekanik ve kimyasal özelliklerini tanımlamaya yardımcı olur. Bu özellikler, çevresel stresten hücre hemostazını korumak, zar proteinlerini bir araya getirmek ve protein komplekslerini stabilize etmek gibi hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar.

Introduction

Atomik Kuvvet mikroskopisi (AFM), çok keskin ucu ¹ ile konsol kullanılarak numunenin bir alanı boyunca tarama bir yüzeyin bir görüntü oluşturur. konsol hareketi numunesinin yüzey topolojisini araştırıyor. Sıvı ^2-5 hava ya da doğala yakın halde sabit örnekleri analiz çok yönlülüğünü nedeniyle, protein, DNA, ve membran da dahil olmak üzere - AFM yaygın biyolojik moleküllerin uygulanmıştır.

Apart nanometre aralığında, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneği gelen, AFM konsol etkileşim kuvvetlerini (yapışma ve itme) ve örnek ^5,6 mekanik özelliklerini araştırmak üzere bir yay gibi davranır. Bu kuvvet spektroskopisi diye bilinmektedir. Bu modda, prob birinci numune (Şekil 1A) ile temasını kaybeder kadar daha sonra geri çekilir, örnek yaklaşır ve bunun üzerine bir kuvvet uygular. oluşturulan eğriler uygulama hem de konsol mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet gösterirhamamböceği ve geri çekilme. Elastikiyet modülüne dahil olmak üzere birçok özellikler, bir malzemenin sertliğini ölçmek için, ve yapışma güçleri elde edilebilir.

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır bir katı destek üstünde yatan biyolojik model membranlar - genellikle mika, borosilikat cam, erimiş silis veya silikon ⁷ oksitlenmiş. Bunlar vesikül birikimi gibi çeşitli teknikler kullanılarak hazırlanmaktadır, Langmuir-Blodgett yöntemi ve ^8,9 spin kaplama. AFM görüntüleme bu desteklenen ikili tabakalar ¹⁰ oluşumunu takip ve farklı bileşimler ^11-15 membranları tarafından oluşturulan farklı yapıları incelemek için kullanılmıştır.

Yaklaşım eğrisi de bir zirve desteklenen bilayers sonuçlarına kuvvet spektroskopisi gerçekleştirme. Bu zirve bilayeri delmek için gerekli kuvveti gösterir ve atılım kuvvet denir. iki tabakalı kalınlığı da kuvvet eğrisi ⁶ kullanılarak ölçülebilir. bilayers tipik atılım gücü1-50 arasındaki aralık NN ^6. Bu özellikler, lipit ambalaj (sıvı veya jel fazı) ve yapının (asil zincir uzunlukları ve doymamışlık derecesi) ve zar-aktif maddeler ¹⁶ tarafından değiştirilmiş bağlıdır. rüptür arkasındaki teori ¹⁷ açıklanmıştır ve bu konsol yumuşaklık, uç yarıçapı ve yaklaşım hızı gibi diğer deneysel parametreler de atılım gücü ^15,16,18 etkiler. Kuvvet spektroskopisi zar ²¹ stabilitesi, farklı lipit fazları ^11,19, peptidler gibi bir bileşim bağımlı değişiklikler ^12,20, hem de diğer biyomoleküllerin etkileri özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır.

Desteklenen iki katmanlı yassı yönelimi daha iyi bir yapı ve membran özelliklerini karakterize etmek için bu yüzey plazmon rezonans ²² ve floresan mikroskobu ^11,19 gibi diğer yöntemler ile AFM birleştirilmesi için avantajlıdır.

Bu ayrıntılı video protocol vezikül birikimi kullanarak desteklenen lipit katmanlarını hazırlamak ve AFM ve kuvvet spektroskopisi ile bunları analiz etmek amaçlanmaktadır. Çeşitli büyüklüklerde veziküller iki katmanlı yapılar hazırlamak için kullanılabilir olsa da, bu protokol, küçük ve büyük tek lamelli vesiküller odaklanmaktadır. Faz sıvı emretti _(ğ) ve sıvı düzensiz (L _d) aşamalarında ayırmak Desteklenen bilayers ^11,15 karakterize edildi. 2: 1 oranında membran 2 di-oleoil-fosfatidilkolin (DOPC), sfingomiyelin (SM) ve kolesterol (kol) oluşmaktadır. Bu kompozisyon modelleri, protein kaçakçılığı ve sıralama, hücre sinyalizasyon ve diğer hücresel süreçleri ^23,24 önemli platformlar olarak davranmaya önerilmiştir lipid sallar.

Protocol

Desteklenen Lipid Bilayers 1. Hazırlama (SLB) ^11,12,21

1. Lipid Karışım ve çok katmanlı veziküllü Cezalı Hazırlanması
   1. Önceden aşağıdaki tamponlar hazırlayın.
      1. 2.7 mM KCI, konsantrasyonlarda, PBS tampon hazırlanması 1.5 mM KH ₂ PO _4, 8 mM Na ₂ HPO ₄ ve 137 mM NaCl, pH 7.2.
      2. 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.4 konsantrasyonlarda SLB (desteklenen lipid iki katmanlı) tamponunu hazırlayın.
      3. 1 M _CaCI2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
   2. İstenen bir konsantrasyonda kloroform içinde, aşağıdaki lipitleri çözülür: örneğin, di-oleoil-fosfatidilkolin, 10 mg / ml'de 25 mg / ml ve kolesterol (Chol) 25 mg / ml, sfingomiyelin (SM) 'den (DOPC).
   3. 2: 1: DOPC: SM: Kol mol oranında, bir 2 toplam lipidlerin 1 mg bir çözeltinin yapılması için DOPC 18.38 ul, SM 17.10 ul ve Chol 11.30 ul alır. Conce göre buna uygun hacimleri Vary1.1.2 hazırlanan lipitlerin ntrations. 2: 1: DOPC: SM: kol, zar ²⁵ faz özelliklerini değiştirecek mol oranı değiştirilerek Ancak, 2 molar oranını korumak.
   4. Vorteks tamamen çözüm karıştırın. Biri floresan mikroskop ile bilayeri görselleştirmek isterse 0.05 mol% bir floresan lipidik boya ekleyin.
      Not: Uzun zincirli dialkylcarbocyanines ailesini, yaptığımız gibi, DII ve Dio dalga boylarında geniş bir yelpazede hizmet ve ideal lipid membranlar etiketlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, rodamin-fosfatidiletanolamin ya da BODIPY-kolesterol gibi flüoresan etiketli lipidler kullanılabilir. Her durumda, boyanın konsantrasyonu lipid bağlı fluorofor yüksek konsantrasyonlarda lipid davranışı ¹⁹ değiştirebilirsiniz akılda tutarak, mikroskopi ayarına göre optimize edilmelidir.
   5. N ₂ gazı kullanılarak kloroform (veya herhangi bir kullanılabilir inert gaz gibi Ar gibi He) kapalı kurulayın.
   6. Bundan başka, kuru tEn azından 1 saat için vakum altında bir karışım, kolesterol.
      Not: bu lipit karışımı depolamak için, soy gaz ile _(N2, Ar veya He) hava üfleme ve -20 ° C'de saklayın. Küçük kahverengi şişelere fazla lipidler-in-kloroform kısım. -20 ° C'de soy gaz ile _(N2, Ar veya He) ve mağaza hava yerini, lipit karışımı gibi benzer bir şekilde, kurutun.
   7. 10 mg / ml'lik bir konsantrasyona PBS tamponu içinde kurutuldu lipidleri çözülür.
   8. 1 dakika vorteksleyin, yaklaşık 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde kanşım çok katmanlı veziküller içeren, bulanık bir süspansiyon elde etmek için. Flakon kenarlarına yapışmasını hiçbir lipit film olmadığından emin olun.
   9. 10 ul alikotları (lipid 1 mg 10 bölüntülerin yapar) içine bu süspansiyon dağıtın.
   10. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edin.
2. Tek lamelli vesiküller hazırlanması
   Not: tek lamelli vesiküller çeşitli boyutlarda sonikasyon yöntemi ya da kalıptan çekme yöntemi ile hazırlanabilir. Sonikasyon s kullanıround enerji karışımı ajitasyon ve çok katmanlı süspansiyon katmanları ayırmak için. Bu puslu süspansiyon kadar takas ile gösterilir. Ekstrüzyon kesin bir gözenek büyüklüğüne sahip bir membran filtreden geçmesine çok katmanlı veziküller zorlar.
   1. Sonikasyon Yöntemi
      1. Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin.
      2. Küçük (2 mi) kapaklı cam şişelere karışımı aktarın ve Parafilm ile sızdırmaz.
      3. 10 dakika süre ile ya da (çapı 50 nm altında, SUV), küçük tek tabakalı veziküller elde etmek için açık hale gelinceye kadar bir banyo sonikatörü içinde, oda sıcaklığında, karışım sonikasyon.
   2. Ekstrüzyon Yöntemi
      1. Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin.
      2. Kriyojenik bir tüp içine süspansiyon aktarın.
      3. Sıvı azot içinde bir kaç saniye için kriyojenik tüp daldırılması lipid süspansiyonu dondurun.
      4. Çözülmebir kaç dakika için bir su banyosu oda sıcaklığında veya 37 ° C kriyojenik tüp daldırarak Lipid süspansiyonu. Donma-çözülme adımları en az 10 kere tekrarlanır.
      5. Lipid süspansiyonu ekstrüde etmek amacıyla, 200 nm gözenek boyutuna sahip olan bir polikarbonat membran kullanımı ticari bir ekstrüzyon tertibatı ²⁶ (diğer gözenek boyutları 100 nm ya da 400 nm gibi mevcuttur).
         Not: Şu anda, iki ekstruder cihazları piyasada mevcut vardır: manuel ekstrüzyon küçük hacimleri (bir kaç ml 200 ul) için mevcuttur. Bu durumda, Örnek elle iki şırınga arasında ileri ve geri süspansiyon iterek zardan basınç altında geçirilir. Üreticisine bağlı olarak, lipid tümbölenler set up asgari hacme ulaşmak için kombine edilmesi gerekir. Daha büyük hacimler için (en fazla 50 mi) daha karmaşık cihazlar kullanıldığı süspansiyon sıkıştırılmış gaz kullanarak polikarbonat zardan itilir. Set-up ve ekstrüzyon koşulları mod göre değişebilirEl. Kullanmadan önce üreticinin talimatlarına bakın. Bu protokol, küçük miktarlar için manuel ekstruder anlamına gelir.
      6. Ekstruder üzerinden su geçirilerek su içinde ekstrüderi dengelenmesi. Suda membran daldırın.
      7. Iki piston arasında zarın cihazı monte ve bir şırınga diğerine, ekstrüzyon yoluyla tampon geçirilerek, tampon maddesi içinde dengeye. Bu adım ayrıca sistemin leakiness test sağlar. Bu sızıntı varsa, sökmeye ve tekrar zar değişiyor yenilemek.
      8. Ekstruder bir şırıngayı ('kirli yüzü') ile lipid süspansiyon atın.
      9. Tek odasının lipit süspansiyon ve karşıt odasının boş şırınga içeren şırınga takın.
      10. Bir ucunda şırınga itin. Zarından ve rakip şırınga içine çözüm geçirin. Bu ^1. pass.
      11. 31 kat gibi bir toplam zar geçirinÇözelti rakip şırınga ('temiz tarafı') üzerine biter.
          Not: ekstrüzyon sonra membran kontrol ediniz. Kırık, sonra ekstrüzyon işlemi başarılı değildi ve tekrar edilmesi gerekir.
      12. Küçük bir tüp içine şırınga boşaltın. 4 ° C 'de muhafaza edilmesi durumunda Büyük tek tabakalı veziküller (LUVler) 1-2 gün boyunca stabildir.
3. Mika ve lameller hazırlanması
   1. Yıkama etanol önce su ve daha sonra lamelleri. Kuru hava.
   2. Mika diskleri alın ve yapışkan bant kullanılarak dış katman soyulabilir.
   3. Lamel üzerine mika diski takın. Biri floresan mikroskop ile bilayers kontrol edebilirsiniz böylece Şeffaf optik yapıştırıcılar optimum bulunmaktadır.
   4. Optik tutkal / gres kullanarak plastik silindirler (2.5 cm dış çapı 2 cm iç çapı ve 0,5 cm yükseklik) takın. Her şey sızdırmaz olduğundan ve sızıntı olmadığından emin olun. Kolayca inci ayrılabilir olarak silindirlerin yeniden kullanmak isteyen yaparken gres kullanınE lamel ve yıkanmıştır. Plastik silindir boyutları AFM konsol tutucu büyüklüğüne bağlıdır ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır.
4. Katı Destek tek katmanlı veziküller birikmesi
   1. Pipetleyin mika doğrudan bütün lipozom çözüm. 300 ul bir hacim ulaşmak için daha fazla SLB tamponu ekleyin.
   2. 3 mM Ca2 ⁺ nihai konsantrasyona ulaşmak için, 1 M kalsiyum klorür çözeltisinin 0.9 ul ekleyin.
   3. 2 dakika ve daha sonra en az 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta, 37 ° C'de inkübe edilir. Her tampon ile iki katmanlı kapsamaktadır. Hava ve hava kabarcıkları ile irtibat onu yok edecek. Gerekirse İnkübasyon sırasında, yüksek sıcaklıklarda kuluçka, özellikle daha fazla tampon eklemek.
      Not: İnkübasyon ısılarının, ihtiyaç duyulan lipid karışımları ve fazlar göre değişir. En az 10 dakika kuluçkalama süresi desteklenen iki katmanlı yapılar oluşturmak için gerekli olan, ancak sıcaklık ve bileşimine bağlı olarak, daha uzun olabilir.
   4. YıkamaSıcak (65 ° C) ile iki tabakalı SLB tamponu 15-20 kat kalsiyum ve kaynaşmamış kesecikler kaldırmak için. Tamponu altında bilayeri tutmak için yıkama adımları sırasında ekstra özen ve yavaşça bilayeri yok önlemek için yıkama solüsyonu pipetlemeyin.
   5. AFM ölçümlerinden önce oda sıcaklığında soğutun desteklenen bilayers. Bu membran, farklı fazlar oluşturabildiğini gibi alet termal kaymasını en aza indirmek için gereklidir.

2. Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri ^11,12

1. Görüntüleme
   Not: İletişim modu veya mod dokunarak atomik kuvvet mikroskopisi görüntüleme gerçekleştirin. Çözelti içinde Resim desteklenen bilayers; Bu bilayers yok gibi çözüm tamamen buharlaşması için izin vermez. Tek tampon ile çalışıyor olacak gibi, herhangi AFM kısmı sıvı dökülmelerine karşı korumalı olduğunu emin güvenlik önlemlerini dikkate alınız.
   1. Yumuşak bir konsol seçin (0.2 N / m yay sabiti tavsiye edilir altında) ve t monteO AFM. Konsol sertlik seçimi kuvvet spektroskopisi için daha önemlidir (ve bu daha sonra ele alınacaktır).
   2. AFM sahnede örnek takın ve tüm titreşim izolasyonu modülleri açık olduğundan emin olun. Dengeye ve sistemin termal sürüklenme azaltmak için en az 15 dakika boyunca bekleyin. AFM set-up bağlı olarak, ayarlama ve görüntüleme özellikleri değişebilir. Üreticinin kullanma kılavuzuna bakınız.
   3. Temas edene kadar AFM ucu ile örnek yaklaşın.
   4. Lipid bilayers genellikle yüksekliği 4 nm olduğundan, (örneğin 1.5 mikron için) en yüksek z-çözünürlüğü verecek cihazın Z-dizi kullanın.
   5. Görüntünün bir bölge seçin. Çift katlı lipid genel bir bakış, x 25 mikron bölge imajı için iyi bir başlangıç ​​noktası olacaktır 50 mm x 50 mm veya 25 mikron almak için. Daha küçük özellikler belirirse, küçük alanlarda bir kutu görüntüsü (10 mm x 10 mm veya 2 mm x 2 mm). görüntüleme alanının seçimi de çalışma r bağlıdırPiezoelektrik tarayıcı ange. Bunun için alet kılavuzuna bakınız.
   6. Bilayers çok kırılgan olduğu için, numune ile temas korurken, termal sürüklenme için en az kuvvet ve doğru tutmak için görüntüleme sırasında AFM ucu ayar noktasını ayarlayın. Iletişim modunda, ayar noktasını en aza indirmek. Modunda dokunarak, set noktasını maksimize.
   7. Polinom tesviye işlevlerine her tarama satırı takarak Süreç görüntüler. AFM üretim şirketi özel yazılım kullanılarak membran ile temas kaybetmek taramalar için hat kaldırma gerçekleştirin.
2. Kuvvet Spektroskopisi
   1. Üreticinin protokolüne göre yönergeleri izleyerek konsol ayarlayın. Kalibrasyon fotodiyotlar kuvvete (Şekil 1B) elektrik sinyalinin dönüşüm sağlar.
      1. Volt uç duyarlılığını (uzunluk birimi olarak) z-piezo hareketi olarak sapma ölçmek yerine, elektrik sinyalini kalibre edin.
         Not: AFM bir lazer kullanarak konsol sapmasına değişiklikler konsolun arkasında yansıyan algılar. Lazer mekansal lazer nokta pozisyonunu tespit edebilen bir fotodiyot ulaşır. Bu numune ile temas üzerine eğilir olarak konsol sapmasına bir değişiklik "dikey sapma" olarak foto diyot tarafından tespit edilir ve bu gerilimin birimleri cinsindendir. Konsol z piezo ile taşınır için, düşey sapma, z-piezo hareket ile ilgilidir. Dikey sapma ve z hareketi arasındaki oran hassasiyeti denilen ve mesafe gerilim dönüştürür.
      2. Genellikle AFM yazılımı dahil termal gürültü frekans yöntemi kullanılarak konsol bahar sabitini hesaplayınız. Bu yöntemde, güç spektrumu yoğunluk arsa oluşturma, salınım frekansına göre gürültü titreşimin genliğini çizilir. Bu arsa rezonans frekansı etrafında bir tepe gösterecektir. Frekans nerede genlik iEn büyük s rezonans frekansı olduğunu. Yazılım tarafından otomatik olarak yay sabitini hesaplamak için tepe etrafında Lorentz işlevi takın. Isıl gürültü yönteminin teorisi için bazı yararlı kaynaklar referanslar ^27-30 verilmiştir.
   2. Çift katlı bir alanı görüntüleme sonra kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için iki katmanlı bir 5 mm x 5 mm bölgeyi seçin.
   3. O bölgenin 16 x 16 grid kuvvet eğrileri alır, böylece AFM ayarlayın. Bu bölgenin başına 256 kuvvet eğrileri ile sonuçlanır. iki komşu nokta arasındaki boşluk membran alanı sonraki noktaya denk olur bir noktada tarafından tanınacak olan önlemek için yeterli olmalıdır. Bu uç yarıçapına bağlıdır. İki nokta arasında bir 100 mil mesafesi ideal olacaktır. 16 x 16 ızgara içine 5 mm x 5 mm bölgesini bölün. Faz büyüklüğüne bağlı olarak, bir küçük veya daha büyük bölgeyi seçmek ve daha sonra buna göre ızgara boyutunu ayarlayabilirsiniz.
   4. Ayarlayın z-piezo deplasman400 nm. Bu z-piezo maksimum hareket aralığını belirler. Bu konsol tamamen ölçümler arasında numune uzak geri emin olmak için yeterince büyük olmalıdır.
   5. 800 nm / sn yaklaşım hızını ayarlamak ve 200 nm / sn hıza geri çekin. Iki tabakalı yapısı ve lipit fazı ^6.16 incelenecek bağlı 6.000 nm / sn 400 arasında bir yaklaşım hızı kullanın.
   6. Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, AFM yazılımı "run" düğmesine basarak, kuvvet eğrileri kazanır.
   7. Yükseklik eğrileri vs kuvvet olarak kuvvet eğrileri (z-piezo hareketinin bir ölçüsü) kaydedin. Bu husus örnek ile temas dikkate konsol bükülmesini almaz. Veri işleme adımı sırasında, AFM yazılım iki tabakalı kalınlığı için uygun değerler verecek uç-numune ayırma eğrileri (Şekil 1C), vs kuvveti elde etmek için eğilme konsol için düzeltme sağlar. Düzeltme değerleri, genellikle calibr içinde bu buluşa katılmıştırHer kuvvet eğrisi ile kaydedilir tirme. Belirli bir noktada piezo hareketinden, dikey saptırma çıkarılarak uç-numune ayırma hesaplayın.
      Not: yaklaşım kuvvet eğrisinde tepe (kuvvet değeri aşağı konsol hareketi yaklaşım döngüsü hala olsa bile gider) membran atılım gücüdür iken bu zirve pozisyon ve nokta konum arasındaki fark kuvvet yükselmeye başladığı tekrar zarın kalınlığı sağlar.
   8. Iyi istatistikler elde etmek için her durum için en az 500 kuvvet eğrileri edinin. Menşe veya MatLab gibi programları kullanarak değerleri bir histogram çiziniz ve dağıtım zirve ve genişliğini almak için Gauss dağılımına histogramlar uygun.

Results

DOPC oluşan Desteklenen lipid bilayers: SM: Chol (2: 2: 1) AFM içinde görüntülendi (Şekil 2 AC). Çünkü lipit kompozisyonu, SM / Chol-zengini L _o ve DOPC zengin L _d fazlar gözlenmiştir. AFM görüntüleme yükseklik profili zar yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Yükseklik profili bakarak, iki tabakalı kalınlığı temin edilebilir membranın (Şekil 2B), veya L _o / L _D fazlar arasındaki yükseklik farkından kusurların varlığında ölçülebilir. B...

Discussion

DOPC oluşan SLBs: SM: Kol (2: 2: 1), kalsiyum klorür ile indüklenen vezikül adsorpsiyon ve yırtılması sonrasında mika oluşmuştur. Bu lipit kompozisyonu L _D ve L değeri _O fazlar ayrıldı. _Ğ fazı sfingomyelin ve kolesterol açısından zengin ve L, _D aşaması ^11'den daha az sıvı / daha viskoz (Şekil 1A) olarak bulunmuştur. L _d aşamasından L _o ayrılması çevreleyen (Şekil 1B, C) ​​yukarıda yükseltilmiş dairesel yapılar ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoil- sn< / em>-glisero-3-fosfokolin	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Kapalı şişelerde liyofilize toz olarak gelir. Açıldıktan sonra tüm tozu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. °C. .
Sfingomyelin (Beyin, Domuz)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Büyük sızdırmaz plastik kaplarda liyofilize toz halinde gelir. Açıldıktan sonra bir spatula toz tozunu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. °C. .
Kolesterol	Avanti Polar Lipidler, Inc.	700000P	Büyük sızdırmaz plastik kaplarda liyofilize toz olarak gelir. Açıldıktan sonra bir spatula toz tozunu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. °C. .
Sodyum klorür (NaCl), %99,8	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potasyum klorür (KCl), %88	Sigma	P9541
Sodyum hidrojenfosfat (Na2< alt>HPO4), %>99	AppliChem GmbH	A1046
Potasyum dihidrojenfosfat (KH2PO4), %99	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2), moleküler biyoloji sınıfı	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, moleküler biyoloji sınıfı	AppliChem GmbH	A3724
Cam lamel, 24  x  60&nbşk; mm, 1  mm kalınlık	Duran Group	2355036
Punch ve Kalıp Seti	Hassas Marka Ürünleri, Inc	40105
Optik Yapıştırıcı	Norland Products, Inc.	NOA 88	Uzun dalga boylu UV ışığı altında kürlendiğinde sertleşen sıvı yapıştırıcı.
[header]
Mica,	NSC Mica Exports Ltd.'yi engelliyor.		Bunlar, alanı en az 1 inç kare olan ve kalınlığı 0,006 inç ile 0,016 inç arasında değişen mika parçalarıdır. Nakliye için şirket tarafından belirli bir boyuta kesilirler. Küçük mika diskler, zımba ve kalıp seti kullanılarak mika bloklarından delinebilir. Mika'yı her zaman eldiven veya cımbızla tutun.
Laboratuvar Ekipmanları Gres	Delici Chemie AG	Glisseal N
Lipozom Ekstruder	Avestin	LiposoFast-Basic	Alternatif olarak Northern Lipids, Inc.'in tekliflerine de bakabilirsiniz.
Yapışkan Bant	3M	Scotch(R) Magic (TM) Bant 810 (1 inç)
Banyo Sonikatörü	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	Isıtma yok, Frekans: 35 kHz, Ultrasonik Tepe Çıkışı: 160 W, HF Güç: 40 W. (Veri sayfası)
Silisyum Nitrür AFM Konsol	Bruker AFM Probları	DNP-10	Her konsolun dört ucu vardır ve nominal uç yarıçapı 20 nm'dir (mümkün olan maksimum 60  nm). Spesifikasyonlara bağlı olarak, 18 kHz rezonans frekansı ve 0,06 N/m nominal yay sabiti ile D ucunu kullanıyoruz.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II, Zeiss Axiovert 200