Tetanik Uyarım tarafından Yerel CA1 γ Titreşim Üretimi

Beyin ağ salınımlar davranışsal devletlere ilişkili farklı frekans bantlarında içinde meydana gelir. Kemirgenlerde, hipokampal θ salınımlar (5-10 Hz), keşfedici davranışlar ^1,2 sırasında gözlenen γ salınımlar yaparken - algı ve dikkat ^3,4 dahil olmak üzere çeşitli bilişsel süreçler, (20 80 Hz) ortak. Senkron γ ağ etkinlik, aynı zamanda, epilepsi ve şizofreni ^5,6 gibi bozuklukların patolojisinde rol oynar. Örneğin, γ salınımlar kortikal epileptik odağın ^5,7,8 alanlarına karşılık düşünülmektedir ve pharmacosensitivity veya direnç, epilepsi araştırma ⁹ soruşturmanın iki önemli alanlar belirteç olarak kullanılabilir.

hipokampal beyin dilim yaygın ağ etkinliğini ^10-12 araştırmak için kullanılan bir modeldir. Çeşitli protokoller, tipik olarak beyin dilimleri γ osilasyonları üretmek için geliştirilmiştir ibu tür düşük Mg ^{+ 2,} 4-aminopiridin (4AP), bicuculline ve kainik asit ^12-17 olarak nvolve farmakolojik modülasyonu. Farmakolojik tetiklenen salınımların eksiklikleri uyuşturucu uygulamasından sonra rasgele ve güvenilir üretilen veya zamanla stabil olmadığını vardır. Elektrikle γ salınımlar bu sorunların çoğunun üstesinden de geçici epizodik kayıt ve analiz için izin uyarıcı etkinliğe kilitli avantajı var tetikledi. İşte bir protokol hipokampal dilim stratum Oriens bir tetanik stimülasyon sunarak CA1 γ salınımlarını üretilmesi için tarif edilmiştir.

Fareler üzerinde tüm deneyler Florey Enstitüsü hayvan etik kurul tarafından onaylandı.

Beyin Dilimler Kesme 1. Kur

1. (MM) 125 Kolin-Cl, 2.5 KCI, 0.4 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO ₃ oluşan bir kesim çözüm hazırlayın, 20 D-glikoz karbojen gaz (% 95 O ₂ -5 ile doyurulmuş (mM olarak) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 _CaCl2, 2 _MgCl2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO ₃ oluşan% _CO2) ve yapay serebrospinal akışkan (CSF) kayıt çözeltisi, 10 D-glikoz, doyurulmuş karbojen. Soğuk tutmak için buz üzerinde kesme çözümü yerleştirin.
2. Kesme çözeltisi yaklaşık 400 ml Freeze ve bir buz bulamaç oluşturmak için donmamış kesme çözeltisi, 100 ml ile karıştırılır. Karbojen Kabarcık (% 95 _O2 -5% _CO2), küçük c ile yaklaşık olarak 0.5 L / dakikalık bir akıştaaliber boru ya da sinterlenmiş cam kabarcık sürekli ama nazik bir akış üretir.
3. Beyin dilimleri yerleştirileceği yükseltilmiş bir naylon ağ parçası ile 250 ml'lik bir beher hazırlayın. Kabarcıklar doğrudan dilim tutarak alanı bozmaya olmadığını sağlanması, karbojen ile yaklaşık 2 cm örgü ve kabarcık kapak aCSF ile doldurun. Orada naylon mesh hiçbir hava kabarcıkları vardır, bu nedenle herhangi varsa bunları kaldırmak da önemlidir. Bu tutma bölmesi olacak ve oda sıcaklığında tutulur (20-25 ° C).
4. Makas büyük bir çifti, makas, küçük ve büyük mikro spatula ve forseps büyük ve küçük çift küçük bir çift de dahil olmak üzere diseksiyon aletleri düzeni ve buz üzerinde onları soğuk. Alüminyum folyo meydanında buz üzerinde vibratome doku kesme blok yerleştirin. 6 cm filtre kağıdı, bir tek kenar jilet ve hem de kesilmiş çözeltisi harç ile doldurulmuş bir 25 ml beher 2 adet elde edilir.
5. Buz ile ikinci bir kap doldurun ve doku PAP bir parça koymaker ve buz üzerinde üstüne bir 12 cm kültür çanak yerleştirin. Karbojen ile çözüm buz bulamacı ve kabarcık kesme kültür çanak doldurun. Bu beyin diseksiyonu yapılmalıdır ile hangi kapsayıcıdır.
6. Vibratome hazırlayın. Taze çift kenarlı jilet çıkarmak ambalajından (taze bıçak her zaman kullanın) ve% 80 etanol daha sonra deiyonize su ile sprey. Bu koniklik başladığı noktada bir 3 ml'lik plastik transfer pipet kesin. Bu beyin dilimleri aktarmak için kullanılır. Bend yaklaşık 45 ° ve 1 ml şırınga takmak tarafından üssünde 27 G iğne. Bu kesim sırasında dilimleri işlemek için kullanılır.

2. Beyin Dilimler Kesme

1. % 2 izofluran veya yerel onaylı yöntemle - Fare (P18 P16) anestezisi. Indüksiyon sonrasında, makas büyük bir çifti ile hayvan başını kesmek ve kabarmış kesme çözüm bulamaç içeren 12 cm kültür çanak içine kafasını bırakın. Bulamaç tamamen için başını sokmak gerekirhızlı soğutma.
2. Bir yandan cildi ileri burnuna doğru bağ dokusu soyulması ile baş önünü tutun. Bağ dokusu kesilmiş küçük makas kullanarak altta yatan kafatası ortaya çıkarmak için. Sonra kafatası ve boyun dorsal yönünü örten kasları kaldırın.
3. İlk büyük forseps ile kafatası ön güvence altına alarak kafatası beyin çıkarın ve ardından küçük bir makas (Şekil 1, A1 ve A2 etiketli kesimler) kullanarak foramen magnum kemik iki tarafında aracılığıyla iki yan keser.
   1. Gözler arasında başka bir kesim (bregma sadece ön) (Şekil 1, kesme etiketli B) daha sonra dikkatlice öne sagital sütür boyunca kesilir olun ve beyin (Şekil 1, kesme etiketli C) ortaya çıkarmak için kesilmiş kafatası bölümleri yansıtır.
   2. Bir kültür çanak üzerine beyin ve yerde kepçe küçük bir spatula kullanın. Karter farkında olunihtiyacınız olacak beynin alt yönü üzerinde ial sinirler bu küçük boyutlu mikro spatula kullanılarak yapılabilir, kesilmiş olması. Kullanımı daha büyük spatula kesim çözüm bulamaç ile dolu 25 ml'lik behere beyin aktarın.
4. Dilimleme beyin yarımkürede hazırlanıyor.
   1. Sonra taze kesme çözüm bulamaç ve kabarcık ile doldurmak bir taze kültür çanak alt 6 cm filtre kağıdı bir parçası yerleştirin. Filtre kağıdı üzerine aşağı beyin, ventral tarafı konumlandırmak için büyük spatula kullanın. Yeni ve temizlenmiş tek kenar jilet alın ve daha sonra, beyincik kaldırmak orta hat boyunca bir kesim iki hemisfer içine beyin ayırmak için yapmak beyin kesti.
5. Vibratome doku bloğu hazırlanması.
   1. , Soğutulmuş vibratome doku bloğu alın yüzeyi kurumaya, ve ortada siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla koyun ve beynin yaklaşık boyutuna yayılır. Birini işlemek için küçük bir spatula kullanınBüyük mikro spatula üzerine beyin hemisfer beynin medial tarafı aşağı böylece.
   2. Mümkün olduğunca çözümün kadar çıkarmak için filtre kağıdının ikinci parçası üzerinde beyin arayüzünde spatula kenarına dokunun. Tutkal üzerine rehberlik küçük spatula ile büyük spatula kapalı beyin kaydırın.
   3. Beyin tamamen batırılır sağlanması, vibratome odasına kesme blok Güvenli ve kesim çözüm bulamaç ve kabarcık ile odasını doldurun. Beynin ventral yüzü bıçak bakacak şekilde kesme bloğu döndürün.
6. Beyin dilimleme.
   Not: Her vibratome yüzden üreticinin talimatlarına uyun benzersizdir.
   1. 450 mikron dilim kalınlığı ayarlayın ve yaklaşık 0.3 mm / s hızında beyin üzerinden hareket ederken bıçak titreşimli emin olun. Kortikal yüzeye ventral taraftan beyin ile tamamen kesti, bu olabilir b tüm beyin sagittal dilimleri üretecekelektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan e. Dilimler mediale yanal olarak imal edilecek ve tipik 3-4 dilim her yarımkürede kesilebilir.
   2. Dilim asansörlerin baz dilim geri aşağı yumuşak basına bükülmüş 27 G iğne kullanın. Her dilim kesilir, onlar kadar 8 saat yaşayabilir tutma odasındaki platforma taşımak için transfer pipet kullanın.

3. Ekstraselüler Elektrofizyoloji Kayıtlar

1. Kayıt odasına dilim montajı.
   1. 2 ml / dak ve 32 ° C'ye kadar ısıtıldı - transfer pipeti kullanarak, CSF 1 akan ile perfüze dalgıç bir kayıt odasına bir beyin dilim yerleştirin. kayıtları için kullanılan CSF Mg2 ⁺ konsantrasyonu, 4 mM ila 2 mM ila arttıkça tutma odası içinde farklıdır.
   2. (- 3 mm aralıklı 2 de yayılmış naylon ipliklerini yarı dairesel paslanmaz çelik), bir "harp" ile dilim sabitleyin. YerArp ipliklerini CA1 paralel böylece. 32 ° C'de 10 ml / dak - 8 perfüzyon hızını artırın.
2. Bir mikroskop yer, bir uyarıcı elektrot ve CA1 (Şekil 2A) 'in stratum radiatumunun yüzeyi üzerinde bir kayıt elektrotu (ACSF kayıt solüsyonu ile doldurulmuş, cam elektrot) altında. Kayıt elektrot yerleştirmek sonra ilk uyarıcı elektrot yerleştirin.
3. Schaffer 120 ile teminatların teşvik - 150 uA genliği ve 0.1 msn süre test darbesi ve dilim sağlığı (Şekil 2B) belirlemek için ortaya çıkan alan, uyarıcı sonrası sinaptik potansiyel (fEPSP) dalga formunu gözlemleyin. dilim yüzeyinden 100 mikron bir fEPSP küçük lif voleybolu ve büyük genlikli ile kayıt almak için - uyarıcı ve kayıt elektrotları yaklaşık 50 dilim taşındı gerekebilir. Schaffer teminat fEPSPs basmakalıp ve dilim sağlığı iyi bir gösterge sağlamak uyarılmış. Healthy dilimler tipik olarak en az 0.3 amplitüd oranı fEPSP için bir fiber voleyle göstermektedir.
4. Elektrotlar Repozisyonlama.
   1. Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak, startum Oriens'in ortasına uyarıcı elektrot taşıma ve Şekil 3A'da gösterildiği gibi, mümkün olduğu kadar kayıt elektrot yakın olarak piramidal hücre tabakası kayıt elektrot hareket ettirin. 150 uA testi darbesi yaklaşık olarak 1 mV - 120 fEPSP yanıt genliği, böylece 100 um - uyarıcı ve kayıt elektrotları yaklaşık dilim içine 50 itti gerekebilir.
5. Γ titreşimleri oluşturuluyor.
   1. Γ titreşimler 200 Hz teslim 20 x 0.1 msn bakliyat bir tren ile doku teşvik oluşturmak için. Her 5 dakikada teslim Bu tetanik uyaran tekrarlanabilir yanıtları verebilir.
6. Aşağıdaki kayıt parametrelerini kullanın.
   1. Giriş gerilimi aralığı maç çıkış sinyalinin kazancını Scaledijital dönüştürücü analog. Maksimum beklenen sinyal gezi giriş gerilim aralığı% 30 az kullandığından emin olun. Sinyaller klip olabilir yüksek olarak kazançları ayarlarken dikkatli olun. alan kayıtları için gerekli tipik bant genişliği temel sürüklenme çıkarmak için 0.1 Hz AC bağlantı ile 500 Hz olduğunu.
   2. Sinyal yumuşatma önlemek için düşük geçiş filtresi köşe frekansı 5 kat daha hızlı - en az 4 Digitize.
7. Veri analizi.
   1. 5 Hz yüksek geçiren filtre verileri herhangi bir temel vardiya kaldırmak için. 10 ms arasında en az bir olay ayrımı, zirve ve 7 ms regresyon aralığı, ~ 100 mV / ms bir eşik tipik bir etkinlik süresi ve% 100 arasında bir ayırma vadi ile, bir türevi eşik kullanılarak ani belirlenmesi. İlk tespit başak için geçen zaman stimülasyon dışlayıcı bitiminden sonra oluşmaya olarak gecikme hesaplayın. Bu analiz, sivri, gecikme arası etkinlik aralığının sayıda karakterizasyonu için izin verir ve süresi hesaplanıraşağıdaki gibidir:
   2. Her süpürme için salınım başına başak sayısı belirlenir olarak sivri sayısını hesaplayın.
   3. Salınım gecikme hesaplayın. Her salınım için, stimülasyon dışlayıcı sonundan itibaren ilk tespit başak zamanı çıkarma.
   4. Ortalama arası Olay aralığını (ISI) hesaplayın. Birden tespit sivri ve ortalama arasındaki süreyi belirleyin.
   5. Salınım süresini hesaplayın. Her salınım içinde ilk ve son tespit edilen başak arasındaki süreyi ölçün.

Stratum Oriens'in tetanik stimülasyon sağlam ve tekrarlanabilir γ salınımlar (35.4 ± 2.2 Hz) ürettiğini, Şekil 3B bakın. Salınımlar CA3 gelen girdiler bükük 32 G iğne kullanılarak CA2 bölgede dilim keserek kesildi yerel CA1 ağı içinde üretilen olduğunu göstermek için. salınımlar yerel olarak oluşturulan belirten, (kesilmemiş dilim 5.89 ± 0.8 sivri, n = 6;; kesme dilimleri 6.16 ± 1.1 ani n = 6 p = 0.85) kesim dilimleri salınım özelliklerinin kesilmemiş dilim farklı değildi.

Bu yöntemin önemli bir avantajı, kayıt stabilitesidir. Tetanoz, 5 dakikalık aralıklarla verilen zaman salınımlar (15 dakika vs 30 dk başak sayısı p = 0.26), herhangi bir dilim için en az 30 dakika boyunca stabil idi. Bir salınım ve diğer parametreler dahilinde sivri toplam sayısı dilimleri arasında farklılıklar vardır. Dbazal özellikleri farklılıklar önemsiz faktörler böylece deneyler eşleştirilmiş halı çalışmaları yapılabilir. Içi dilim karşılaştırmaları değişkenlik için endişe olabilir ve yeterince güç verme karşılaştırmalar aşılabilir.

Daha sonra, bu tetanically uyarılmış CA1 γ salınımlarının üretimi için gerekli olan, iyon kanalları ve reseptörleriyle incelenmiştir. Α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) farmakolojik blokajı 20 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) (Şekil 4a, b), GABA ile reseptörleri 20 uM bicuculline (Şekil 4C) olan bir reseptör, İH akımı 20 uM 4- (N-etil-N-fenilamino) -1,2-dimetil-6- (metilamino) pyrimidinium klorür (ZD7288) (Şekil 4D), ve T-tipi Ca 100 uM Ni2 + (Şekil 4E) ile 2 + kanal bağımsız bir şekilde oluşturulan sivri sayısını azaltan her vardı(P <0.05; CNKX n = 6; bicuculline n = 7; ZD7288, n = 6; Ni2 + n = 6). Düşündüren (kontrol, 8.3 ± 2.2 sivri n = 5;, AP5, 5.9 ± 3.1 sivri p = 0.22) (2R) -amino-5-phosphonopentanoate (AP5, 20 uM) uygulanması sivri sayısını etkilemedi NMDA reseptörleri, bu terkipte γ osilasyon üretimi dahil değildir.

Bu hazırlık ilaçların ağ ölçeği eylemini belirlemek için idealdir. Retigabin potasyum kanallarını açar ve membran uyarılabilirliğini 18-20 azaltan bir klinik kullanılan anti-epileptik ilaçtır. Retigabinin Banyo, (Şekil 5) salınım doza bağımlı bir sivri sayısının azaltılmasını ve süresini üretti.

Şekil 1. Kafatasının şematik ve yeniden kesim yerini gösteren cilt örten beyin Dana. A1, A2, B ve C beynin çıkarılması için kafatasını açmak için yapılması gereken kesim yerleri işaretleyin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

CA1 Schaffer içinde uyarıcı ve kayıt elektrotları Şekil 2. Yerleştirme testi dilim sağlığına teminatların. (A) uyarıcı elektrot (Stim) ve kayıt elektrot (Rec). (B) 120 uA stimülasyonu (* ile işaretlenmiş lif voleybolu) tarafından uyarılmış bir fEPSP temsili bir örneği yerleşimini gösterir. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.

Tetanically gener Şekil 4. farmakolojik karakterizasyonubir- γ salınımlar. (A) CNQX etkisini gösteren Temsilcisi iz. (B) CNQX etkisini gösteren grafikleri (20 uM, n = 6), (C), bicuculline (20 uM, n = 7), (D), ZD7288 (20 uM, n = 6) ve (E) Ni 2+ (100 uM, n = 6) sivri sayısı. Veriler eşleştirilmiş karşılaştırmalar olarak sunulmuştur. * P <0.05, ** p <0.01 ve *** p <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ağ özelliklerine Şekil 5. Retigabin etkileri. Kontrol koşulları ve (B) ve uyarılmış salınımlar (A) azaltılmış ağ etkinliği gösteren temsili örnekler <retigabinle ile strong> (C). Salınım başlangıcı ve (G) arası başak aralığı (ISI) ile (D) başak sayısı, (E) salınım süresi, (F) gecikme gösterilen etkilerin özeti. Veriler eşleştirilmiş karşılaştırmalar olarak sunulmuştur. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.