Yöntem makalesi

Uygulanması İn Vitro İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

DOI:

10.3791/52879

⸱

9 Aralık 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedefe yönelik tedaviler başlangıçta etkili olsa da direnç kaçınılmaz olarak ortaya çıkar. Takip bakımını kolaylaştırmak için bu direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmak için dirençli klinik örneklerin genetik analizi gibi çeşitli yöntemler uygulanmıştır. Bu yaklaşımlar klinik olarak anlamlı keşiflere yol açmış olsa da, ilgili hasta materyaline ulaşmada veya bu örneklerden toplanan genomik verilerin dekonvolüsyonunu çözmede zorluklar, tedaviye giden yolu ciddi şekilde engellemiştir. Bu amaçla, burada birinci basamak tedavilerde ve alternatif klinik yönetim stratejilerinde iyileşmeye rehberlik edebilecek hızlı keşif için bir araç tanımlaıyoruz. Klinik öncesi in vitro veya in vivo ilaç seçimini yeni nesil dizileme ile birleştirerek, direncin fonksiyonel itici güçleri olarak hizmet edebilecek genomik yapısal varyasyonları ve/veya gen ekspresyon değişikliklerini tanımlamak mümkündür. Bu yaklaşım, değişikliklerin kendiliğinden ortaya çıkmasını kolaylaştırarak, bu mekanizmaların hastalarda gözlenme olasılığını artırır. Bu protokolde, yapışık çizgiler kullanarak direnci artıran tek nükleotid varyantlarını ortaya çıkarma potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için yönergeler sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlam sıralama teknolojileri ve gelişmiş veri analitik araçlar ile tümör genomları detaylı moleküler karakterizasyonu belirli kanser türleri 1,2 anahtar genetik değişikliklerin keşfine yol açmıştır. Böyle HER2, BCR-ABL, EGFR ve ALK olarak bu genetik lezyonlar, amaçlayan hedefli tedavilerin geliştirilmesi, önemli ölçüde hastalar 1,2 yaşam kalitesini artırmıştır. Direnç sonuçta ortaya Ancak, bu yaklaşımın özgüllük rağmen, çoğu tek tedavilere klinik yanıt sub-optimal olmuştur. Son zamanlarda, önemli ilerlemeler hedeflenen terapötiklere direncinin moleküler temellerinin anlaşılmasında yapılmamıştır. Şaşırtıcı, bu direniş önemli bir mekanizma sürekli hedef / yolu aktivitesini içerdiğini açıkça hale gelmektedir. Noktada bir olgu olarak, androjen reseptörü (AR), prostat kanserinin tedavisi enzalutamide, AR kendisi aktive edici mutasyonlar muhafaza zenginleşmesine yol açar -directed AR-sinyal outpönleyicisi 3-5 mevcudiyetinde ut. Bu bilgi de WT ve mutant-AR fonksiyonu hem de bastırmaya devam edebilirsiniz üçüncü nesil antagonistleri geliştirilmesi) 1 saldırgan bir kampanya açmıştır enzalutamide dirençli PKa 3 ve 2) terapötik müdahale için hedeflenmiş olabilir AR sinyalizasyon potansiyel aşağı düğümleri tespit . Benzer şekilde, EGFR BRAF ve ABL hedef gibi inhibitörlerinin diğer sınıflara karşı direnç genellikle orijinal addicting kinaz yolunu 1 etkinleştirebilirsiniz mutasyonlara yol açar.

Direniş kaçınılmaz hastaların çoğunda ortaya çıktığını bilgi ile, yaklaşımlar geliştirmek süratle etkin takip tedavilerin gelişimini sağlayacak ışık bu mekanizmaları getirmek. Yaygın olarak kullanılmakta olan bir yaklaşım d mükellef olabilir genetik lezyonlar zenginleşme / tüketilme tanımlamak için göreceli tedavi görmemiş veya -duyarlı tümörlerin klinik refrakter tümörlerin genomiğini analiz etmektirhalı keşif. Onun söze rağmen, hızlı keşif engel bu yaklaşımın iki önemli yükümlülükleri vardır. Öncelikle, genomik sorgulama için tümör malzemeye zamanında erişim sağlamasını tedavi terapi hareket önemli bir engel olarak hizmet edebilir. Tümörler belirgin intra-tümöral heterojenliğini 6,7 sunabilirim çünkü İkincisi, dirençli bir ortamda genetik lezyonların sayısız Dekonvolüsyonun zor olabilir.

Bu zorlukların ışığında, direnç mekanizmaları preklinik keşif bağımlılığı var artmıştır. Bu yaklaşım önce direnç başlangıcından şu bu mekanizmaları ya tedaviden önce veya ayı hastalarda alternatif klinik yönetim stratejilerini yol gösterici olabilir klinik çalışmalarda 1 öne direnç mekanizmalarını tanımlanmasına izin verebilir.

Yaygın olarak kullanılıyor Böyle bir klinik öncesi keşif aracı tarafsız fonksiyonel RNAi ekranları uygulamaktır. Sınavaple, Whittaker ve arkadaşları NF1 kaybı sürekli MAPK yolu aktivasyonu ile 8 RAF ve MEK inhibitörlerinin direnç aracılık ettiğini belirlemek için bir genom ölçekli RNAi ekran uyguladı. NF1 kayıp-fonksiyon mutasyonları RAF inhibisyonuna ve aktivasyonunu 8 vemurafenib dirençli melanoma tümörlerinin in dirençlidir BRAF -mutant tümör hücrelerinde gözlenmiştir Bu bulgular klinik olarak önemli olduğu bulunmuştur. Ancak, bu yaklaşımın başarısı rağmen, birçok klinik açıdan anlamlı hedefler genellikle muhtemelen nedeniyle bu yaklaşımın kaybı fonksiyon-önyargı tespit edilmemiştir.

Bunun aksine, direnç mekanizmalarının klinik öncesi keşfi için daha az eğilimli bir araç NGS bazlı genomik veya transkriptomik profil ile birlikte ilgi bileşiğe uzun süre maruz kaldığında dirençli hücre hatlarının üretilmesini içerir. Bu yaklaşım başarılı kendiliğinden tespit için çeşitli gruplar tarafından uygulamaya konmuşturdirenci 5,9,10 sağlayan tekrarlayan tek nükleotid varyantları veya ifade değişiklikler. Örneğin, AR tekrarlayan F876L mutasyonu son in vitro 3-5 dirençli klonlar ve klinikte 4 öncesinde, bu mutasyonun belirlenmesi için, in vivo olarak 5 ksenograft tümörlerinin keşfedilmiştir. Çok yakın bir zamanda, Bhang ve arkadaşları çoğu, fonksiyonel olarak bağlantılı mutasyonlar düşündüren, önceden varolan bir alt populasyonun bir parçası olan uzun süreli ilaç maruziyeti sırasında ortaya çıkan dirençli klonların çoğunluğunun göstermek için iki klinik olarak anlamlı bir model ClonTracer kullanılan (2015) 11, önceden mevcut olan daha önce muhtemeldir Bu seçim sırasında 11 için seçilen hale gelir.

Daha önce de tartışıldığı tümörlerin genomik profile Tersine, daha az heterojenlik Bu yaklaşımın yararları "homojen" dirençli klonlar, potansiyel sürücüsü daha doğru bir genetik diseksiyon kolaylaştırmak analizi için kullanılan gibidir. FurthermCevher, heyecan, direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak için potansiyel ek olarak, bu yöntem, bu bilgilerin bilinmiyor 10 olduğu biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hücresel etki mekanizmaları ve hedeflerini tanımlamak için uygulanabilir. Net avantajları ve bu yaklaşımın birden kullanımları göz önüne alındığında, burada klinik olarak anlamlı keşifler potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için böyle bir preklinik ekranın başarılı bir şekilde uygulanması ayrıntılı bir protokol mevcut.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İlgi Bileşik (ler) için GI 50 değerlendirilmesi

  1. Uygun ekim yoğunluğu değerlendirmek için ilgi hücre hatları için büyüme eğrisi (ler) oluşturun. Tohumlamadan sonra, çeşitli zaman noktalarında hücre sayısını çizilir (gün 2, 4, 6 ve 8) 0. günde göre Bunlar arasında hücre çizgisinin bir göreceli büyüme oranı sağlayacak ve bu tür başlangıç ​​tohum yoğunluğunu değerlendirmek için kullanılmalıdır izdiham 7 gün içinde 96 oyuklu plakalar içinde ulaşılabilir değildir.
  2. Büyüme eğrileri tespit edildiği zaman, hücre ortamının 100 ul saydam olmayan, şeffaf dipli, 96 gözlü levhalar hücre çekirdeği uygun sayıda GI 50 değerlendirmek. Kullanılan ve 1.1 belirlenen hücre hattına göre hücre sayısını Tohum. Tipik olarak, 24 saat ~ ikiye katlanması zaman, örneğin., HCT116 ile hızla büyüyen hücre hatları için tohum 3x10 3 hücreleri.
    1. Bir deney plakası (gün 1) hazırlayın. Deney plakası için, kültür ortamı i 100 ul istenen yoğunluğa, tohum hücrelerin mavi gölgeli kuyular (Şekil 1). Wells beyaz vurgulanan sadece medyayı içerir.
    2. Bir kontrol plakası (gün-1) hazırlayın. Kontrol plakası için, ayrı bir 96-çukurlu plaka içinde kültür ortamı 100 ul içinde aşama 1.2.1 gibi hücrelerin aynı yoğunluğa tohum. Bileşiklerin sitostatik / sitotoksik doğasını yorumlamada yardımcı olacak bu 'Gün 0' okuma (Şekil 2) analiz edilir.
  3. Ertesi gün (gün 0), kumanda paneli okuyun. Oda sıcaklığına Lüminesan Hücre Canlılığı reaktifi (üreticinin talimatlarına göre tampon maddesi ile karıştırıldı, CellTiter-Glo substrat) dengeye ve homojen bir çözelti elde etmek için içeriği ters çevirerek yavaşça karıştırın. Hücre / medya karışımı 100 ul reaktifin 80 ul eklenir ve hücre lizizine neden 30 dakika boyunca içeriği çalkalayın.
    1. 560 nm 0.1-1.0 sn ve tespit dalga boyunun bir pozlama ayarlanmış bir lüminometre ile rekor ışıma.
  4. (Bileşikleri Test bileşiklerini eklemeÇevrede) plakaları (gün 0) test etmek için,. 10 konsantrasyonlarının toplam 200x son konsantrasyonda DMSO içinde bileşik 4 seri seyreltme (bileşik ve yalnızca bir DMSO, levha bileşik ihtiva eden 9 dilüsyonları) bir 1: sağlayın. Bir başlangıç ​​noktası olarak, 0.03 uM'lik bir 200x düşük doz ve 2.000 uM bir üst dozda (nihai hacim 200 ul) hedefler.
  5. 10x son konsantrasyonda (son hacim 100 ul, ara levha), bir bileşik, orta karışımı yapmak için ortama seri olarak seyreltilmiş bileşikler ekleyin. Deney gününde 3 kullanım için -20 ° C 'de bir bileşik plaka saklayın. En yüksek doz 10 uM (ör., Satırlar B, C ve D, gün 0) (Şekil 1) öyle ki üç kez hücrelere bileşiği, orta karışımı 10 ul ekle. 37 ° C 'de 3 gün boyunca deney inkübe edin. Kullandıktan sonra ara levha (lar) atın.
  6. 3 gün, 1.4 hazırlanan bileşik plakaları kullanılarak 400 ul 1x bileşik orta karışımı hazırlayın. Medya kaldırmak ve otomatik kuru pat tahlil plakaları haricindekilericlaved kağıt havlular 2-3x kalan ortamı çıkarmak için. Mavi gölgeli kuyulara bileşik / medya (/ kuyu 100 ul) ekleyin ve kuyular buharlaşma (Şekil 1) önlemek için çevre medya 100 ul ekleyin. İlave bir 3 gün için 37 ° C 'de deney plakaları yeniden inkübe edin.
  7. 6. günde, adım 1.3 de tarif edildiği gibi, bir lüminesans okuma gerçekleştirerek yaşayan hücrelerin nispi sayısını değerlendirmek.
  8. Bileşiklerin statik / toksik doğa değerlendirmek için gün 0 okuma kullanın. Sitostatik ajanlar hücre siklusu durmasına neden ise Toksik maddeler apoptosis. Bileşik zehirli ise, GI 50 ve Gi direnci deneyleri için 50 x 5 konsantrasyonlarını seçme düşünün (gün 6 okuma günü 0 okuma altındadır). Bileşik durağanlığı (d0 okuma eşit veya daha yüksek) uyaran Ancak, GI 100 ve direnç deneyleri için GI 100 x5 (Şekil 2) düşünün.

2. İlaç Direnci Tahliller kurma

  1. Çalışma zekâ Eğerha sitostatik madde, direnç analizi için 150 mm2 doku kültür tabaklarında (hacim = 30 ml) içinde bir% 30-40 arasında bir kesişme noktasında tohumu hücreleri. Toksik madde ile çalışıyorsanız, bir% 70-80 izdiham tohum.
  2. Sağlam bir yanlış eşleşme onarım (KKK) mekanizması liman hücre çizgileri için, aşama hücrelerin inkübe kanserojen N-etil-N-nitroso üre ile 37 ° C (TRK) 2,1 O / N. Genomik instabilite artırmak için 50 mg / ml TRK (nihai konsantrasyon 50 ug / ml) içindeki bir stok çözeltisi 30 ul hücreleri tedavi edin. Kusurlu bir MMR (Tablo 2 ve 3), TRK veya diğer kanserojen tedavi gerekmeyebilir sahip hücre çizgileri için.
    1. Diğer hücre hatları için, mikrosatellit instabilite 12 kullanılarak NCI kriterlerine göre MMR-eksikliği tespit veya mikrosatellit instabilite deneyleri veya MMR genlerinin 13-15 Epigenomik / genomik profilleme kullanılarak yayınlanan karakterizasyonu dayalı.
  3. Test bileşiği (ler) ile muamele hücrelerikonsantrasyonda faiz adımında 1.8 belirlenen. Tipik bir üç günlük canlılığı deneyi 10 hücre ölümüne neden yüksek derecede toksik bileşikler için, (örneğin, GI 50), düşük doz tedavi ile başlar ve aşamalı olarak dayanıklı kadar konsantrasyon, bileşiğin (Gİ 50 katlarını) her 2-3 hafta geliştirmek direnci gözlenmiştir. Ortamı doldurun ve her 3 d bileşik.
  4. Seçim başladıktan sonra dirençli klonlar ortaya kadar, değişim medya / bileşik 3-4 günde karıştırın. Tedavi edilen hücreler DMSO ile muamele edilmiş kontrol hücreleri akut tedavisi göre ilaç tedavisinde daha büyük bir büyüme / uygunluğu göstermek zaman tanım göre direnç ortaya çıkmaktadır.

3. tek hücre klonlarının izole edilmesi

  1. Hücrelerin canlı kümeleri için faz-kontrast mikroskobu (büyütme 40x) kullanılarak kültür çanak inceleyin.
  2. Bir işaretleme kalemi ile çanak alt Mark tatmin edici klonlar. Ortalama boyutu vardır klonlar (büyük koloniler seçin mayBirden hücrelerinden köken) ve diğer kolonilerden izole. Adım 3.3 özetlenen iki yaklaşımdan birini kullanarak klonları seçin.
  3. Yaklaşım 1: pipet kullanarak (Şekil 3)
    1. Büyüme ortamı çıkarın ve herhangi bir kayan hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile durulayın.
    2. Pipet ucu ile 'toplama' klonlar için rehber olarak siyah işaretleri kullanın (pipet bağlı, P200 tercihen).
    3. 200 ul taze ortam ile 48 oyuklu plakalar içine aktarın klon (yarım bileşik konsantrasyonu hücrelerin uygun kurtarma izin vermek için).
    4. Hücreler 200 ul taze medya / İdeal bileşik konsantrasyonu eklemeden önce 2-3 gün kurtarmak için izin verin.
    5. Her 3-4 günde medya / bileşik değiştirebilir ve klonlar genişletmeye devam devam.
  4. Yaklaşım 2: Klonlama Diskleri Kullanma (Şekil 3)
    1. Aşama 3.2 'de tarif edildiği gibi klonlar işaretleyin.
    2. 5 ml% 0.25 t ihtiva eden bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde 3 mm klonlama diskler yerleştirin2 dakika boyunca rypsin-EDTA.
    3. Çanak medya aspire dayanıklı klonlar içeren ve steril tek kullanımlık forseps kullanarak tripsin batırılmış klonlama diskler ile klonlar bindirme.
    4. Klonlar 37 ° C inkübatör, plakalar asansör ne kadar kolay bağlı olarak, 1-2 dakika boyunca bekletin.
    5. Steril forseps kullanılarak klonlama diskler almak ve 200 ul taze ortam ve bileşik yarı konsantrasyonu ile 48 oyuklu plakalar içerisine aktarılır.
    6. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça klonlama diskler hücreleri çıkarmak ve 37 ° C (kuyularda diskleri klonlama bırakın) O / N inkübe.
    7. Ertesi sabah, 48 oyuklu plakalar ile klonlama diskleri çıkarın ve 200 ul taze bir ortam / bileşik (yarım doğru bileşik konsantrasyonu) ile kuyu doldurun.
    8. Üç gün sonra, bileşik ideal konsantrasyonu ile medya doldurmak.
    9. Medya / bileşik 3-4 günde değiştirmek ve klonlar genişletmeye devam devam.

4. Ar Derecesini Belirlemeİzole Klonların esistance

  1. 10-20 koloni genişletilmiş sonra direnç derecesini değerlendirmek için 1. adımda açıklandığı gibi, GI 50 eğrileri oluşturmak.
  2. Her seçim sürecinde DMSO ile tedavi edilen kontrol popülasyonları içerir. Bu direncin spektrumu geniş olacak çok muhtemeldir (diğerleri tam direnç gösteren oysa bazı kısmi gösteriliyor). İki grup arasında değişebilir direnç mekanizması olarak bu sınıfların her biri bir kaç klon toplayın.

5. nesil Sıralama

  1. 15 ml 2 milyon hücre (kontrol ve dirençli klonlar) (5 dakika boyunca 500 xg) aşağı Spin gDNA ve RNA koleksiyonu hem konik şişeler (dolayısıyla 2 x 2 milyon dolar).
  2. 1x PBS ile iki kez yıkanır ve izolasyon için hazır olana kadar -80 ° C'de pelet dondurma.
  3. Üreticinin protokolüne göre RNA veya gDNA izole etmek için ticari bir özütleme kiti kullanarak.
  4. Yeni nesil dizileme için örnekler gönderinsatıcının protokolünü kullanarak 10.

6. Biyoinformatik örneklerin analizi (tam exome sıralama)

  1. Preprocess en iyi uygulama DNA seq boru hattı 16 göre verileri sıralamak.
    1. Tüm İKD 17 kullanılarak insan genom GRCh37 başvurmak için okur Harita. Samtools 18 ile sıkıştırılmış BAM formatında sıkıştırılmamış SAM biçimlendirilmiş hizalamalarını dönüştürün. Sıralama hizalamaların tarafından Samtools ile koordine. Picard kullanarak okuma grupları ekleyin. (Belirli İKD, Samtools ve Picard komutları için, çizgiler, 1-4 Yardımcı Metin 1)
    2. Tümünü işaretle çiftleri Picard aracı 19 set gelen MarkDuplicates komutunu kullanarak okur. Index Samtools ile bu dosyayı. (Ek Metin 1, satır 5-6)
    3. Tüm okur karşısında uyumsuz üsleri en aza indirmek için, yeniden hizalayın bir Indel realigner 20 kullanan küçük eklemeleri veya silmeleri barındıran bölgelerde lokal olarak okur. (Ek Metin 1, satır 7-8)
    4. Ayrıca Accurac artırmak içinvaryant arama, bir baz kalite puanı kalibrasyon aracını kullanarak ampirik yeniden kalibre baz kalite puanları y. Baz kaliteli kalibrasyon aracı doğru ilk kalite puanı, aynı zamanda okunan bir grup, makine çevrimi, baz pozisyonu ve dinükleotid bağlamında (+ önceki akım bazlar) dahil olmak üzere birçok özellikleri, hesap Kovaryas içine almalıdır sadece. Picard PrintReads ile tekrar kalibre BAM oluşturun. (Bu adım için belirli komutlar için, çizgiler, 9-10 Yardımcı Metin 1)
    5. Adımları tekrarlayın 6.1.1 sıralı her numune için (Ek Metin 1, satır 1-10) 6.1.4 ile.
  2. Eşleştirilmiş varyantı, 21-23 tool19 çağıran kullanarak her klon tek nükleotid değişimi (SNV) tanımlayın. Her klon sıralı için koşmak eşleştirilmiş varyant eşleşti "normal" olarak ebeveyn klon kullanarak çağırıyor. (Ek Metin 1, satır 11)
  3. Tekrarlayan, yüksek kaliteli varyantlarını Filtre ve bir varyant açıklama aracı 24 ile açıklama için hazırlar. Va DeprioritizeTüm dirençli klonlar için yaygın riants. (Ek Metin 2 R komut bakınız)
  4. Bir açıklama aracı 25, 26 ile varyantları açıklama. Birçok varyant açıklama araçları veri yükledi ve bir uzak sunucu tarafından işlenecek izin beraberindeki bir web uygulaması var.
  5. Yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin edilen türevleri öncelik fonksiyonel etki tahmin aracını 27-29 kullanın. Varyant açıklama gibi çeşitli araçlar bir web arayüzü aracılığıyla fonksiyonel etki tahmini için kullanılabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Direnişin önemli fonksiyonel sürücüleri keşfetmek için potansiyelini maksimize etmek için, genişleme, fenotipik test ve sıralama için tek bir hücre klonlar seçin. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, HCT116 hücreleri, tedaviden (kesikli siyah daireler) boyunca büyümeye devam etti dirençli klonların kendiliğinden ortaya çıkmasına yol sitotoksik Bileşik # 1 ile uzun bir süre işlemden geçirildi. Bu klonlar 1 Şekil 3'te vurgulanan ve daha sonra fenotipik analiz için genişletilmiş yaklaşım # kullanarak aldı. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, tüm klonlar, bir ilişkisiz sitotoksik bileşik, Velcade duyarlılık göstermesine karşın, dirençli klonlar, 1-3 Tüm 1. bileşik önemli bir direnç gösterdi ve yakın analog bileşiği, # 2 (daha canlılığı / büyüme). Fenotipik direnç onayı takiben, gDNA izole edilmiş ve tam exome sıralama analizine tabi. Biyoinformatik araçları bu yapısal varyantları üzerinde daraltmak için uygulanan bu1) tekrarlayan ve 2), fonksiyonel etkisi (Şekil 5A) için potansiyel var. Bu iki kriterlerini karşılayan yapısal varyantları, bağımsız bir sıralama aracı ile doğrulanmıştır. Şekil 5B'de, bütün exome sıralaması, Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak teyit edildi kullanılarak belirlenmiştir heterozigot missens mutasyonu gösterildiği gibi (üst panel, WT sekansı; alt panel, mutant sekansı). Sekans doğrulandıktan sonra, başlangıçta direnci deneyi için kullanılan ebeveyn hücre hattı işlevsel mutasyon rolünü teyit etmek üzere mutant cDNA ifade gen tekniği ile yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, WT cDNA'nın aşırı ifadesi direnci vermek için başarısız ise, direncinin bir sürücü olarak bir yapısal versiyonunun işlevsel rolünü teyit 1. bileşik mutant cDNA önemli ölçüde tanınan fenotipik direnç ifade zorladı. Bu deney için kullanılan bütün reaktifler Tablo 1 'de özetlenmiştir trong>.

figure-results-1
Tahlil ve kontrol plakaları 1. Düzeni Şekil. Mavi gölge, bileşik tedavi kuyuları. Beyaz gölge, sadece orta. Bileşikler seri şekilde 1 seyreltilir: 4 ve üç kez (BD ve EG) uygulanırlar. 2 bileşikleri, plaka başına uygulanabilir.

figure-results-2
2. Temsilcisi canlılığı eğrileri Şekil. Kırmızı noktalı çizgi gün 0 yazma okuma. X-ekseni sağ ve y-ekseni bileşiğin artan dozları gösterir DMSO kontrol oyuklarına canlılığı göreceli temsil eder. GI% 100 gelişme inhibisyonu elde etmek için kullanılan 100 = dozu GI DMSO kontrolü% 50 canlılığı azaltmak için kullanılan 50 = doz.

_upload / 52879 / 52879fig3.jpg "/>
Şekil 3. genişleme için dayanıklı klonların toplamak için iki yaklaşım. Yaklaşım 1- kullanım pipet pick up ve 48-kuyucuğu iyi tanımlanmış klonları aktarmak için. Yaklaşım 2- kullanımı klonlar kaldırın ve 48 oyuklu plakalara transfer klonlama diskler tripsin batırılmış.

figure-results-3
In vitro içerisinde 1 bileşik HCT116 klonlan için elde edilen direnç Şekil 4. teyidi. (A) Bileşik 1 dayanıklı HCT116 klonlan, sürekli üç haftalık seçmeyi takiben ortaya çıktı. Kontrol ve dirençli klonların (B) Canlılık, çeşitli bileşikler ile 72 saat muameleden sonra test edildi. Bileşik 2 Bileşik # 1 yakın bir analogudur. Velcade bir kontrol sitotoksik madde olarak kullanılmıştır. Veriler üç biyolojik çoğaltır ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir.


Bileşik 1. dayanıklı HCT116 klonlar gen A eşsiz, tekrarlayan mutasyon Şekil 5. Kimlik (tek nükleotid varyantları, SNVs). (A) İş akışı tüm dirençli klonların mevcut SNVs belirlemek ve yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin etmek MutationAssessor tarafından. Sanger dizileme ile gen A mutasyonunun (B) onay.

figure-results-4
Mutasyona uğramış gen A haiz direnç Şekil 6. Yeniden ifade vitro içerisinde 1. bileşik. Mühendislik HCT116 hücre hatlarının Canlılık bileşik 1. 72 saat tedaviden sonra test edildi. HCT116-WT veya mutant hücre çizgileri stabil bir şekilde, sırasıyla, WT veya gen A mutant cDNA'larını ifade edilir. Veriler ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir oÜç biyolojik çoğaltır f.

Örnek Adı Amino asit Birincil Doku Zigosite
Cı-33-A p.E768fs * 44 rahim boynu Heterozigot
Cı-33-A p.S860 * rahim boynu Heterozigot
KML-T1 s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
CP66-MEL p.C822F cilt Heterozigot
CTV-1 p.0? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
EFO-27 p.Q130fs * 2 yumurtalık Heterozigot
EFO-27 s.? yumurtalık Heterozigot
HCC2218 p.E467K meme Heterozigot
J-RT3-T3-5 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
LNCaP s.? prostat Homozigot
LoVo s.? kalın bağırsak Homozigot
MOLT-13 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
NALM-6 s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
NCI-H630 p.R680 * kalın bağırsak Heterozigot
Skut-1 p.L787fs * 11 Endometrium Homozigot
Skut-1B pL787fs * 11 Endometrium Homozigot
SUP-T1 s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot

Tablo 1. MSH2 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir.

Örnek Adı Amino asit Birincil Doku Zigosite
CCRF-CEM p.R100 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozigot
CCRF-CEM s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozigot
CW-2 p.Y130fs * 6 kalın bağırsak Homozigot
DU-145 s.? Homozigot
GR-ST s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
HCT-116 p.S252 * kalın bağırsak Homozigot
IGROV-1 p.S505fs * 3 yumurtalık Homozigot
MN-60 s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
NCI-SNU-1 p.R226 * mide Homozigot
P30-Ohk s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozigot
PR-Mel s.? cilt Homozigot
REH s.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue
SK-OV-3 p.0? yumurtalık Homozigot
SNU-1544 p.S2L kalın bağırsak Heterozigot
SNU-1746 p.E523K kalın bağırsak Homozigot
SNU-324 p.C233R pankreas Heterozigot
SNU-324 p.V384D pankreas Heterozigot
SNU-478 p.V384D pankreas Heterozigot
prostat Homozigot

Tablo 2. MLH1 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre çizgisi (ler) in seçimi: Genetik durumuna ve genomik instabilite karakterizasyonu

Kuşkusuz, başarılı klinik olarak anlamlı direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak tek ve en önemli faktör ilk hücre çizgisi seçimidir. Iki faktör dikkate alınmalıdır. Birincisi, hastalığın tanımlanması, genetik özelliklerini barındıran, aynı soy / alt tipinin hücre çizgisi (ler) i seçmek hedefliyoruz (örn., Melanom BRAF V600E). Endikasyonlar 33,34 çeşitli hem hücre hatları ve primer 30-32 / metastaz tümörlerin kamuya açık transkriptomik ve mutasyon veri Sorgulama seçim sürecini kolaylaştırır. Klinik olarak ilgili genetik değişiklikler hücre hatlarının tespiti doğru olmasına rağmen, bazı durumlarda bu durum böyle bir tarama işleminin zorluğu ve uzunluğu gibi faktörler nedeniyle mevcut hücre çizgilerinin eksikliği ya da mümkün mümkün olmayabilir.

kolaylığı veya istenilen hattı kullanarak tarama direnç fizibilite olduğunu. Örneğin, bu tür proliferasyon ve içsel mutasyon oranları gibi faktörler büyük keşif hızına etkileyebilir. Bu amaçla, hücre çizgileri kendiliğinden direncinin ortaya çıkması 35 hızlandırılabilir umuduyla DNA MMR mekanizmalar hızlı büyüme kinetikleri ve noksan olan kullanılabilir. KOZMIK veri tabanına dayanarak, pek çok aday hücre çizgileri, iki 'sıklıkla mutasyon geçiren MMR genleri, Msh2 ya MLH1 birinde eksikliği mevcuttur (Tablo 2 ve 3). Ilgi hücre çizgileri, alkile edici ajan olarak MMR fiziksel ya da DNA reaktif kimyasal bir mutajen ile akut tedavisinde rulman kusurları mevcut olmayan, alternatif olarak, N-etil-N -nitrosourea (TRK), genomik instabilite geliştirmek için de kullanılabilir. Her ne kadar olabilir önemli ölçüde s her iki yaklaşımdirençli klonlar ulaşmak ve takip sıralama için zaman Horten, sıkı fonksiyonel test işlevsel olmayan daha büyük bir sayı olarak aday genler üzerinde yapılmalıdır, yolcu mutasyonlar ortaya çıkması muhtemeldir. SNVs işlevsel ilgili mutasyonları tanımlamak için şansını maksimize etmek emretti rütbe olabilir. Birincisi, seçme bağımsız klonlar Tekrarlayan olan bu mutasyonlar bu mutasyonlar direniş sürücüler olasılığını artıracaktır. Durumunda tekrarlayan mutasyonlar ilacın aksiyon mekanizması uygun SNVs odaklanan tespit değildir (örneğin, bir ilaç ya da ilaç hedefi hedef bilinen bir alt baş efektör) anlamlı olabilir. Sonuçta, altın standart her zaman ilaca duyarlı ebeveyn hücrelerde ektopik cDNA ifadesi ile aday SNVs bir direnç veren aktivitesinin deneysel değerlendirilmesidir.

RNA sıralama vs DNA

Bir kez dirençli klonlar, oluşturulan DNA ve / veya RNA edilmiştirihtiyaca bağlı olarak dizilebilir. DNA dizi analizi, exome veya tüm genom dizileme de böyle SNP, indellerin olarak germ ve somatik varyantları, tanımlanmasını sağlayacak ve sayı varyantları kopyalar. Üreten bilinen kodlama bölgelerden gelen okur üzerinde daha maliyet-dostu exome sıralama odaklanır Oysa, bütün genom dizileme gibi arttırıcı veya miRNA'lar 36 olarak kodlayıcı olmayan elemanların mutasyonların belirlenmesi kolaylaştırabilecek tüm genom dizileme için veri üretecektir. Gen ekspresyonu verileri DNA dizilemesi sırasında teraziye olmadığı için, ancak, hangi mutasyon (lar) bir fonksiyonel sürücüsü olması muhtemeldir tahmin etmek zordur. Bu bağlamda, RNA dizi analizi, her ne kadar daha fazla maliyetli olarak, bu bir avantaj sunar. Mutasyon arama yalnızca İfade edilen RNA türleri üzerinde gerçekleştirilen olması ilgi mutasyonu fonksiyonel bir sürücü olması olasılığını da artırmaktadır. Izlem fonksiyonel test, aynı zamanda RNA sıralama için mutasyon daha odaklı bir anket sağlayan ek olarakAyrıca direniş gibi güçlü sürücüleri hizmet verebilir gen füzyonları dahil gen ifadesi değişikliklerini, alternatif bağlantı ve yeni kimerik RNA türlerinin, tespit edememek ekledi avantajı sunuyor.

Biyoinformatik boru hattı

Örnek komutları gösterim amaçlı verilmiştir, fakat daha ayrıntılı belgeler ve öğreticiler Enstitüsü 16 Geniş temin edilebilir ve NGS analizi başlamadan önce iyice okunmalıdır. Aşağıdaki komutlar tüm araçlar ve referans verileri önceden yüklenmiş olduğu bir sistemde bir UNIX kabuk ortamı için tasarlanmıştır. Bu komutlar ayrıca fastq dosyaları içeren paired-end dizisi "ebeveyn" ve "dayanıklı" satıcıdan alınan ve "data" dizininde konuldu adında iki örnek okur varsayıyorum. Çoğu durumda bu komutlar adapte edilmelidir veya ek komut satırı arg kullanarak belirli bir uygulama için optimizeuments (örneğin, bwa komutuna "-t 8" ekleyerek 8 CPU çekirdeği arasında okuyuculu çalışmasını sağlar). Bam dosya başına yalnızca bir örnek belirli araçlar için dosya formatı gereksinimlerine uymak için, olsa bile (biyolojik örnekler için hizalamalarını atamak) Okuma grupları, sık sık BAM dosyalarına eklenmesi gerekir. Grup parametreleri RGID, RGSM, RGPL, RGPU okuyun ve RGLB keyfi örnek adını açıklayan dizeleri, sıralama platformu ve kütüphane strateji olabilir.

In vivo deneyler vs in vitro

In vitro seleksiyon tarafından belirlenen çeşitli direnç mekanizmaları klinik olarak anlamlı olduğu doğrulanmış olmasına rağmen, mekanizmalar, klinik direnç alakalı ya da baskın mekanizmaları hizmet olmayabilir bir olasılık söz konusudur. Bunun bir nedeni, tedaviye direnç sürüş mikro çevre için önemli bir rol, deneysel protokol / ayar d yoksun olan bir bileşeni de içerebilirŞimdiye kadar iscussed. Gerçekten de, bazı çalışmalar tümör hücrelerinin stroma 37,38 ile sağlanan direnci doğal mekanizmalar ima stromal hücrelerin varlığında kültürlenir zaman tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip anti-kanser maddeler etkisiz hale olduğunu göstermiştir. Böyle stroma kaynaklı kazanılmış direnç mekanizmalarını tanımlamak için, bir in vitro ko-kültür veya in vivo tümör direnci deneyleri performans düşünebilirsiniz. Eski tahlil oldukça karmaşık olduğundan, pek çok direnç sürüş stromasında potansiyel rolünü ele ilaca dirençli tümör xenografts üreten başvurdular. Bu tür çalışmalar, stroma gerçekten de ikinci bir rol oynayabileceğini ima in vitro seçime direnci nisbetle iki özdeş 5 ve eşsiz 39 mekanizmaları ortaya çıkardı. Ancak, bir böyle dirençli tümörleri üretmek için sürebilir sürenin uzunluğu ve takip genomik analiz-complexitie karmaşıklığı dikkatli olmalıdırintra-tümöral moleküler ve hücresel heterojenliği nedeniyle s.

Hedef tanımlama

Ilaç direnç mekanizmalarının açığa çıkarmak için ek olarak, bu NGS bazlı genomik profil yaklaşım aynı zamanda, kimyasal probların hücresel hedefleri tespit etmek uygulanabilir. Tarihsel olarak, birden fazla tarafsız yöntemler Kantitatif proteomik ile birleştiğinde afinite temizliği, maya genomik yöntemler, RNAi tarama ve bilgisayar çıkarım 40 yaklaşımlar da dahil olmak üzere biyolojik aktiviteleri, düşük molekül ağırlıklı kimyasal maddelerin hücresel etki mekanizmaları ve hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bileşiklerin fonksiyonel hücresel hedeflere içgörü sunabilir direnci sağlayan fenotipik dirençli hücre popülasyonlarının, benzersiz tekrarlayan tek nükleotid değişimleri (SNVs) veya ifade değişikliklerinin tanımlanması NGS merkezli genomik veya transkriptomik profilleme kullanarak ilaç direnç mekanizmalarının aydınlatılmasında bir uzantısı olarak. TOnun görülen direnç mekanizmalarının bir alt kümesi, küçük molekülün, doğrudan protein hedefleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, tekrarlayan içerebilir fikrine dayanmaktadır. Son zamanlarda, birçok rapor, özellikle 9,10 sondalar küçük molekülün hücresel hedefleri ortaya çıkmasına, büyük ölçekli kanser hücre hattı hassasiyeti profil dahil olmak üzere diğer yaklaşımlarla birleştirerek, yaklaşım programı onayladı.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazı için Yayın ücretleri H3 Biyotıp tarafından ödenir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, H3 Biomedicine'deki meslektaşlarımıza makale hazırlığı sırasındaki geri bildirimleri için teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
48 kuyulu plakalarFisher Scientific07-200-86 Genişleyen klonlar
96 oyuklu plakalarFisher Scientific07-200-588GI < alt > < / alt> eğrileri oluşturma
CellTiter-GloPromegaG7572Canlılık testi
Klonlama diskleri (3 mm)SigmaZ374431Klonların toplanması
Steril forsepsUnomedikalDF8088SKlonların toplanması
RNeasy Plus RNA ekstraksiyon kitiQiagen74134RNA Kan
ve Doku İzole Etme DNeasy ekstraksiyon kitiQiagen69581İzolasyon gDNA
GATKThe Broad InstituteIndel yeniden hizalayıcı
MuTectThe Broad InstituteEşleştirilmiş varyant çağırma aracı
OncotatorThe Broad InstituteVaryant açıklama aracı
MutationAccessorThe Broad Enstitüİşlevsel etki tahmin aracı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
  2. Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
  3. Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499(2013).
  4. Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
  5. Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
  6. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  7. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
  8. Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
  9. Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
  10. Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
  11. Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
  12. Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
  13. Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
  14. Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
  15. Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71(2013).
  16. GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
  20. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
  21. Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  22. Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  23. Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  24. Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
  25. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).
  26. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
  27. Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  28. Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
  29. Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20(2013).
  30. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  31. Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
  32. Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
  33. Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
  34. Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
  35. de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
  36. Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
  37. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
  38. Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
  39. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  40. Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

n Vitro Se ilimT m Ekzom DizilemeSpontan Mutasyon Ortaya kGI 50 BelirlemeKlonal zolasyonSitotoksik Bile ik UygulamasYap sal Varyant AnaliziSanger Dizileme Do rulamasFenotipik Diren Onay

İlgili makaleler