Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Doğrudan Fare Travma / Heterotopik Kemikleşme Model Yanık

10K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52880

⸱

6 Ağustos 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry

Bu makalede

Özet

Heterotopik ossifikasyonun bir Aşil tenotomisi ve yanık yaralanması modeli, travmaya bağlı ektopik kemik oluşumunun ekzojen faktörlerin uygulanmadan güvenilir bir şekilde incelenmesine olanak tanır.

Özet

Heterotopik ossifikasyon (HO), kemikte majör travma, yanık yaralanmaları ve ortopedik cerrahi işlemler sonrasında oluşan iskelet dışında kemik oluşumudur. HO'yu incelemek için kullanılan hayvan modellerinin çoğu, kemik morfogenetik proteini (BMP), eksojen hücre yapıları veya BMP sinyallemesindeki genetik mutasyonlar gibi eksojen maddelerin uygulanmasına dayanır. Bu modeller yararlı olsa da, HO vakalarının çoğuna neden olan enflamatuar durumları doğru bir şekilde yeniden üretmezler. Burada, farelerde güvenilir bir şekilde odaklanmış HO üreten bir yanık / tenotomi modelini açıklıyoruz. Bu protokol, toplam vücut yüzey alanının% 30'unun oluşturulmasını, dorsal deride kısmi kalınlıkta temas yanığı ve Aşil tendonunun orta noktasında bölünmesini içerir. Öngörülebilir bir yerde HO'yu indüklemek için yalnızca travmatik yaralanmaya güvenmek, yalnızca içsel fizyolojik süreçlerden ve çevreden endokondral heterotopik kemik oluşumunun zaman seyri çalışmasına izin verir. Bu yöntem, travmaya bağlı HO'da yer alan inflamatuar ve osteojenik yolakların anlaşılmasında etkili olabilir. Ayrıca, HO bu modelde öngörülebilir bir konum ve zaman seyrinde geliştiği için, HO oluşumunu önlemek için erken görüntüleme stratejilerini ve tedavi yöntemlerini geliştirmeye yönelik araştırmalara izin verir.

Giriş

Heterotopik ossifikasyon (HO), osteo-potent hücrelerin iskelet dışında endokondral kemik oluşturmak üzere anormal bir şekilde indüklendiği ektopik kemik oluşumudur. HO oluşum yolunun detayları hala büyük ölçüde bilinmemekle birlikte, kabul edilen bir paradigma üç temel faktör içerir: inflamatuar bir kışkırtıcı olay, izin verilen bir niş ve kemik oluşturabilen mezenkimal kök hücreler. 1-3 HO, majör yanık yaralanmalarının %60'ından fazlasını, savaşla ilgili yaralanmaların %65'ini ve invaziv ortopedik cerrahi vakalarının %10'unu komplike hale getiren yaygın bir komorbiditedir. 4,5 Bununla birlikte, HO'nun nerede oluşacağını tahmin etmek genellikle zordur, çünkü yerel yaralanma bölgelerinde veya başka türlü yaralanmamış olabilecek uzak yerlerde ortaya çıkabilir. Lokasyondaki bu değişkenlik, lokal olarak hedeflenen bir şekilde reaktif kemik oluşumunu önlemek için profilaktik olarak müdahale etmeyi zorlaştırır. Fibrodisplazi ossificans progressiva (FOP) gibi hastaların minör travma veya inflamatuar hakarete yanıt olarak sağlam HO gelişimine yatkın olduğu konjenital HO formları da vardır. Transgenik fareleri kullanan güçlü hayvan modelleri bu fenotipi yeniden üretmiş ve travmaya bağlı HO'da da önemli olabilecek moleküler yollar hakkında bilgi sağlamıştır.6-9 Konjenital olmayan HO'nun patogenezine yönelik translasyonel araştırmalar, tek başına yaralanmadan eksojen osteo-indüktif materyallerin ve/veya hücrelerin implantasyonuna kadar çok çeşitli yapılar kullanmıştır. 10-13

Önceki çalışmamızda, farelerde herhangi bir eksojen materyalin uygulanmasını gerektirmeyen basit ve güvenilir bir HO oluşumu modelini doğruladık. 14-17 Bu model, HO'yu başlatmak için iki temel koşul yarattı: lokal travma ve küresel inflamasyon. Bu, uzak bir yanık yaralanması (küresel inflamasyon) ile birlikte bir Aşil tenotomisi (lokal travma) kullanılarak başarıldı. Fareler her iki tedaviyi de aynı anda aldı ve histolojik, radyolojik ve moleküler yollarla analiz edilebilecek sağlam miktarda HO geliştirdikleri bulundu. İlginç bir şekilde, eşzamanlı yanık yaralanması, gelişimsel zaman seyrini oluşturan ve hızlandıran HO miktarını önemli ölçüde artırdı. 14-16 HO, tenotomi yapılan ekstremitenin kalkaneus, ayak bileği eklemi ve tibia/fibula çevresinde öngörülebilir bölgelerde gelişti. Bilinen bir yerde HO gelişiminin güvenilirliği, ektopik ossifikasyonun erken evrelerinde moleküler ve histolojik özelliklerin odaklanmış olarak incelenmesine izin verdi. 14,17 Bugüne kadar, tenotomi ve eşzamanlı yanık yaralanması olan farelerin (50'den fazla hayvan) %100'ünde HO gelişmiştir. Ek olarak, HO'nun büyüme modelini ve biyokimyasal yapısını incelemek için uzunlamasına 2D ve 3D görüntüleme ve spektroskopik analiz yapılmıştır.15,16

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik bildirimi: Laboratuar Hayvan Araştırmaları Enstitüsü'nden Sekizinci Edition (Ilar, 2011) ve kişi: Bütün hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kılavuzda verilen kılavuzda tanımlanan iyi hayvan uygulamaları ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir Michigan Üniversitesi'nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (PRO0001553) tarafından onaylanmıştır.

1. Fare Cerrahi İşlemleri

NOT: 8-10 haftalık C57BL / 6 fareler. Diğer yaş, arka planlar ve farelerin suşları farklı koşullar veya genetik makyaj test etmek için kullanılır. Prosedürün tenotomi kısmı için, yüz maskesi, saç kaputu ve steril önlük, eldiven ve enstrümanları kullanarak steril koşullar korumak. Cerrahi siteler steril povidon-iyot ve steril draping ile hazırlanmalıdır. 37 ° C resüsitasyon çözümleri bir veteriner ısıtma yastığı kullanılarak ve ısıtarak hipotermi önlemek yönetilmekteydi önceyon.

  1. % 2.5 solunan izofluran kullanarak fare anestezisi. Kolay erişilebilir dorsum ve arka-bacaklarda bırakmak için bir burun konisi kullanın. Mukoza zarının uygun solunum hızı ve renklerini korumak için izofluran yönetiminin hızını ayarlayın ve kas tonusu, ayak tutam ve kornea refleksi kontrol ederek anestezi sağlamak. İşlem sırasında kuru göz yaralanmasını önlemek için farenin gözlerine mülayim oftalmik merhem sürün. Cerrahi alanının altında bir veteriner ısıtma yastığı veya sıcak su sirkülatör kullanılarak yeterli vücut ısısını korumak.
  2. Analjezi için cerrahi subkutan hemen önce, buprenorfin, 0.1 mg / kg yönetme.
  3. Yakından diz topuktan makası kullanarak sol arka pençe cerrahi siteyi tıraş.
  4. Yakından omurga üzerinde başlayan ve dorsal orta hattın solunda traş alanını genişleten yanık karşılamak için bir alan en az 2 cm x 3 cm temizleyerek, fare dorsumuna tıraş.
  5. 3 alternatif povidon-iyot scrubs kullanarak diz arka pençesine dahil, cerrahi siteyi hazırlayın.
  6. Sol Aşil tendonu medial boyunca uzunlamasına bir kesi yapın. Aşil tendonu kolayca görülebilmesi böylece kesi uzatmak; Yaklaşık 0.5 cm.
  7. Keskin doku makas ile orta noktasında tendonun keskin diseksiyon ile Aşil tenotomisi gerçekleştirin. Tendon altındaki doku düzleminde doku makas biri bıçak yerleştirin ve bıçak tendon orta noktasında olduğu kadar düzlem boyunca teşrih. Keskin tendon koparmaya makas bıçakları kapatın.
    NOT: Gastrocnemius, Soleus ve Plantaris tendonlar da dahil olmak üzere tüm arka tendonların dahil olun.
  8. Steril gazlı bez ile basınç uygulayarak hemostaz (orada en az kanama olmalıdır) ve 5-0 vikril dikiş ile cilt kesisi kapatın.
  9. Yaklaşık ölçümü ile 35 g ağırlığında bir alüminyum bloğu ile dorsal kısmi kalınlıkta yanık gerçekleştirints 2 cm x 2 cm x 3 cm 17 sn için fare traş sırtına tatbik edilen bir su banyosu içinde 60 ° C'ye kadar ısıtıldı.
    Not: Bununla birlikte, yani blok için ek basınç uygulamak bilmek bloğun bütün yüzey alanı fare ile temas halinde olması sağlanır anestezi fare üstünde blok dinlenme uygun yanık derinliği elde için yerçekimi izin yerinde bloğu tutan tek güç. Bloğun bir tarafına bağlı bir ince plastik kolu sıcak su banyosundan manipülasyonu, stabilizasyon ve alınması için uygundur. Bu yaklaşık% 30 toplam vücut yüzey alanı 8-10 haftalık C57BL / 6 fare yanık oluşturur. Bu iletişim yanık nedeniyle yara üzerinde yanık derinliği bütünlüğü ve hayvanlar arasındaki tekrarlanabilirlik diğer yöntemlerle (alev veya haşlanma yanığı) üzerinden seçildi.
  10. Gazlı bez ile yanık sitesini kurulayın ve bir TEGADERM pansuman uygulanır.
  11. Isıtılmış canlandırma sıvıları yönetme: Laktatlı Ringer çözeltisi 1 mlintraperitoneal enjeksiyon ve 0.5 ml deri altı enjeksiyonu. Resüsitasyon Bu tek seferlik idare yanık ve tenotomi kurtarma için yeterli.
    NOT: fareler tamamen iyileşti kadar gözetim altında temiz kafeslerde tek tek diğer fareler konut kafesleri evin anestezi fareler iade etmeyin. Tipik geri kazanım 1-6 saat içinde gerçekleşir. Yanık siteleri genellikle 2-4 hafta içinde iyileşir ve temiz konut ortamlarında muhafaza edilmesi durumunda nadiren yara enfeksiyonu ile komplike olur.
  12. Buprenorfin 0.1 mg / kg deri altı enjeksiyonu prosedüre göre, 3 gün süre ile, her 12 saat uygulayın. Uygun aralıklarla seri uCT taramaları ile HO büyüme izleyin. Ektopik kemik büyümesi ilk uCT tarafından belirgin yaklaşık 3 hafta post-op olduğunu.
    NOT: HO geliştirme çoğunluğu post-op 9 hafta tamamlandı. Biz 15 haftada tarama uCT tek uç noktaya göre 15 hafta süreyle iki haftalık HO hacim veya tekrarlanan uCT ile yerde fark tarar gözlenen değil.Deneylerin sonunda, kurumsal kurallarına göre CO 2 inhalasyon sahip tüm fareleri euthanize ve 10 dakika sonra servikal dislokasyon ile ölüm doğrulayın.

2. uCT Toplama ve Analizi

  1. Yüzüstü pozisyonda tarayıcı yatağına anestezi fare sabitleyin. Hareket objeyi nefes önlemek için yatağa sıkıca arka bacaklarda bantlayın. Görüntü kalibrasyonu için fare altındaki hayalet içeren hava, su ve hidroksiapatit ekleyin.
  2. Kemik Analizi yazılımı açın ve proksimal distale arka pençe ucuna kalça eklemi hem arka bacaklarda kapsar faiz (ROI) bir bölgeyi tanımlamak. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir görüntü elde. 80 kV, 500 uA ve 1.300 msn maruz kalma, 48 mikron voksel boyutu 14,15
  3. Uygun alanlara ortalama yoğunluğu üç hayalet odalarının her birinde bir yatırım getirisi çizerek ve girilerek Hounsfield üniteleri (HU) görüntü kalibreyazılımı.
  4. Sol arka bacak tibia paralel ortotopik kortikal kemik yapıları ve HO belirlenmesi için net anatomik görünüm sağlamak için Z ekseni boyunca yani yazılımdaki "kapmak" aracını kullanarak, görüntüyü yeniden yönlendirin.
  5. HO karşılaştı kadar diz başlayarak, görüntü dilimleri boyunca distale ilerleyin. Manuel spline aracını kullanarak, pençe üzerinden veya HO aştı kadar distale devam her 5 inci dilim ektopik kemik etrafında bir ROI yapmak. Genişletmek ve tüm HO içeren tek bir ROI bir araya İB'leri dikiş tahmin etmek aracını kullanın.
  6. 3D yatırım getirisi yapın ve analiz menüsünü seçin. En iyi kemik penceresini göstermek alt ve üst eşik değerlerini ayarlayarak kemik hacmini hesaplayın. Tüm taramalar için aynı sabit eşik değerlerini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmamızda, protokol travma önce yayınlanan fare modeli tarif edilmiştir / HO. 14-17 Bu yanık kısmi kalınlıkta bir Aşil tenotomisinin ve küresel inflamatuar hakaret ile eş zamanlı lokalize kas-iskelet yaralanması oluşturulmasını içerir kaynaklı yanık. Bu seri görüntüleme ile takip edilebilir tenotominin sahasında reaktif kemik güvenilir oluşumu ile sonuçlanır. Bugüne kadar, hem Aşil tenotomisi sürekli ve yanık var (50'den fazla) tüm fareler tenotomi yerinde HO ölçülebilir miktarda geliştirdik. Ektopi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Heterotopik ossifikasyon, travma, yanık ve invaziv kas-iskelet sistemi prosedürlerine maruz kalan hastaların karşılaştığı önemli bir fonksiyonel bozukluğu temsil eder. En fazla risk altındaki nüfus, el yapımı patlayıcılar (IED) gibi mekanizmalardan kaynaklanan büyük patlama yaralanmaları olan modern çatışmalardaki askerlerdir. 18 Geliştirilmiş vücut zırhı ve öne konumlandırılmış tıbbi üniteler, büyük ekstremite yaralanmasının daha iyi hayatta kalmasını sağlar. Ekstremite yaralanmalarının ilk stabilizasyonu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Teşekkürler

μCT görüntüleme ve analizindeki yardımları için Amanda Fair'e, CMI'ye ve Kathy Sweet'e ve UM'deki ORL'ye teşekkür ederiz. Finansman: BL, 1K08GM109105-01 ve Plastik Cerrahi Vakfı Ulusal Bağış Ödülü tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL / 6 farelerJackson Laboratuvarı6648-10 haftalık
Isofluran – FlurisoVET one, Boise, IDV1 501017
Buprenorfin & BuprenexReckitt Benckiser HealthcareNDC 12496-0757-10.3 mg / ml çözelti
BetadineOwens ve Minor, Mechanicsville, VA2047PVP202
5-0 Vicryl sütürlerEthicon, Summerville, NJJ493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm3M1624WYanık bölgesini ve mikroyu düzgün bir şekilde kapatmak için ikiye bölün
; CT - GE eXplore Locus SPGE Healthcare Klinik Öncesi Görüntüleme, Londra, ON, Kanada
Microview 2.2 İleri Kemik Analizi UygulamasıGE Healthcare Klinik Öncesi Görüntüleme, Londra, ON, Kanada

Kaynaklar

  1. Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
  2. Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
  3. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  4. Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
  5. Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
  6. Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
  7. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  8. Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
  9. Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
  10. Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
  11. Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
  12. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  13. Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
  14. Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).
  15. Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
  16. Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
  17. Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  18. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
  19. Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
  20. Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
  21. Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

A il TenotomisiParsiyel Kal nl k YanFare Travma ModeliMikro BT G r nt lemeEktopik Kemik Olu umuTravma Kaynakl HOYan k Yaralanmas ModeliZaman Serisi al masTerap tik Testler
Doğrudan Fare Travma / Heterotopik Kemikleşme Model Yanık
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.