Yöntem makalesi

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

9.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52893

⸱

24 Eylül 2015

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

Bu makalede

Özet

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Özet

Optik çözünürlük ve transmisyon elektron mikroskobu spesifik protein popülasyonlarını tanımlama meydan sınırları hücre biyolojisinde engeller olmuştur. Birçok fenomen basit sistemler, in vitro analizi ile açıklanabilir ve tam anlaşılması için, bilhassa 1 nm ve 0,1 um aralığında, yerinde ek yapısal bilgi mi edilemez. Burada, elektron spektroskopi görüntüleme, protein ve nükleik asitlerin dağılımının eşzamanlı eşleme sağlayan bir transmisyon elektron mikroskobu tekniği ve bir ekspresyon etiketi miniSOG DNA çift iplik kırılım onarımı odaklarının yapısını ve organizasyonunu incelemek için bir araya getirilmektedir.

Giriş

Son yıllarda üzerinde 1 ışık mikroskobu önemli gelişmelere rağmen, hücre biyologlar hala çözünürlükte bir boşluk muzdarip. Bu makromoleküler kompleksleri arasında koordineli etkileşimi içeren temel hücresel süreçleri yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasını sınırlar (örneğin, kromatin yeniden, DNA onarımı, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyonu olarak). Transmisyon elektron mikroskopları (TEM) gerekli çözünürlüğü sağlamak s olsa da, görsel yapıların biyokimyasal kompozisyonu belirlemek mümkün olurken spesifik proteinlerin etiket yapısal yetersizlik nedeniyle bu süreçleri tanımlamak için zorlu olmuştur. Nükleer yapıları ayırt etmeye yardımcı iç membran yokluğunda, çekirdek özellikle zor olmuştur. Elektron spektroskopik görüntüleme (ESI), DNA, RNA ve prot eş zamanlı algılama ve farklılaşmasını izin vererek bu sınırlamaların bazılarını çözerNükleer yapılar 2-5 ein tabanlı.

Elektron spektroskopik görüntüleme:

Elektron mikroskobu yüksek hassasiyet ve çözünürlükte element dağılımları haritası için bir esnek olmayan numune 6 bir elemanın iç kabuk elektronları ile etkileşimleri dağılmış olan elektronların seçer bir görüntüleme spektrometresi kullanabilirsiniz. Enerji elemanı spesifik miktarlarda numune atom iyonizasyonu bir sonucu olarak kaybolur, çünkü bu elektron ayrıldı ve elektron mikroskobu bağlı bir spektrometre kullanılarak görüntülenebilir. Böylece numune ile etkileşimde elektronların spektrumunun analizi örneği 7 element kompozisyonu hakkında nitel ve nicel bilgiler ortaya koymaktadır. Numune geçerken enerji kaybetmek yok elektronlar elektron enerji kaybı "sıfır kayıp zirve" bulunurtayfı. Bu elektronların bolluğu numune kütlesi, yoğunluğu ve kalınlığı ile ilgilidir ve numune ile çarpışan veya numunenin geçişi sırasında enerji kaybı olmadan numune geçmesine elektron oluşur. Bu bilgiler, örnek 8, belirli bir eleman mevcut atomların sayıları mutlak ölçümü için yararlı olabilir.

Biyolojik örnekler heavy metal kullanarak çoğunlukla kötü TEM olay ışın elektronları saptırmak hafif elementlerin, boyama metotları oluşur beri tuzları numunedeki kontrast üretmek için uygulanmak zorundadır. Bu farklı maddeler ve yetersizlik en özgüllüğü mümkündür birden fazla leke görselleştirmek için özgüllüğü olmaması çekirdeğinin çalışmada bilinen elektron mikroskobu değeri sınırlıdır. ESI özellikle hücre çekirdeğinin yapıların çalışma, geleneksel TEM göre önemli avantajlara sahiptir.Bu protein komplekslerinden nükleoprotein kompleksleri ayırmak için ve nükleik asitlerin yoğunluklarına dayalı olarak farklı nükleoprotein kompleksleri çözmek için nitelikteki DNA- ve RNA-içeren makromoleküler kompleksler fosfor açısından zengin doğasını yararlanmak mümkündür. Kalan biyolojik madde azot bolluğu dayalı görüntülü olabilir. Farklı anatomik yapıların içindeki dağılımı ve göreceli bolluk Haritalama sadece bu iki element ve analiz çekirdeğinin hakkında bilgi bir sürü bize sağlar. Örneğin, kromatine ve fosfor bolluğu temsil harita ribozomlar tespit etmek kolaydır. Interkromatin alanı, çekirdek gözenek kompleks ve nükleer organları, diğer yandan kolayca azot harita görüntü tespit edilebilir.

Mini singlet oksijen jeneratörü sistemi (miniSOG)

ESI güçlü bir teknik temsil ederken o alır çünkü yerinde kromatin yapısı okumak içinfosfor ve azot ile elementel kompozisyon karakteristik oranların s avantajı, element bir bileşim, normal protein kompleksleri farklı popülasyonlar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz. Nanometre aralığındaki küçük altın parçacıkları ile etiketlenmiş antikorlar yaygın tek tek moleküller yerini haritalandırmak için kullanılmıştır. Altın partikül genellikle İkincil antikora bağlı olduğu için, bu primer antikor ile tespit epitopa çapında yaklaşık 20 nm'lik bir çevresi içinde görünür. Sonrası gömme örneklerde, antikorlar tek bölümlerin yüzeyinde ortaya epitopu algılar. Bu, elde edilen bilgileri bir antijenin varlığı ispat ve hücrenin belirli bir anatomik yapıya ilişkilendirilmesi mümkün olsa da epitop en reçine ile örtülü olduğundan, tam değildir. Boyunca antijenlere erişime izin, floresan mikroskop için kullanılanlara benzer protokollerini kullanan teknikleri, Ön-gömmenumunenin tamamı derinliği ancak genellikle lipid membranların çıkarılmasını gerektirebilir ve aldehitler ile sabit olamaz bileşenleri kaldırmak antikor hücresine nüfuz sağlamak için gerekli olan permeabilizasyon adımlar. Ayrıca, ultrastrüktür korunması, glutaraldehit için tercih edilen aldehit sabitleştirici, yaygın dolayısıyla paraformaldehit tipik gereklidir epitopları tahrip ve. Bu protein-protein çapraz bağlama az etkilidir. Altın bir nanopartikül ile etiketlenmiş antikorların başka bir dezavantajı, altın zayıf kontrast örnek, ilginç yapısal detayları belirsiz olabilir güçlü bir kontrast oluşturan bir çok elektron-yoğun malzeme olmasıdır.

Bir ifade edilen protein etiketi gibi yeşil flüoresan protein (GFP) ortaya çıkması hücre biyolojisinde soruları cevaplamak için floresan mikroskopi kullanımını dönüştürdü. Küçük bir flüoresan alana sahip bir protein etiketleme in vivo dağılım eşleme sağlar yapısını değiştirebilir permeabilizasyon prosedürlere gerek kalmadan. Mikroskopi elektron bir hücrede protein dağılımlarını eşleştirmek için protein etiketleri kullanarak zarif prensibini çevirmek için, bir sistem ilgi yapısına sinyal yakın üretmek ve TEM kontrast oluşturmak mümkün olduğunu gerekiyordu. Polimerize diaminobenzidinin genellikle bağlayıcı antikor tespit etmek histoloji kullanılan bir leke olduğunu. Bu leke genellikle ikinci antikoruna konjüge edilmiş yaban turpu peroksidazı (HRP) ile bırakılır. Reaksiyon, güvenilir bir sonuç üretir, ancak HRP hücrelerinin 9 sitozolünde katalitik olarak aktif değildir. Kendi çözünürlük NanoGold yöntemi 10 daha kötü olduğunu, HRP, reaksiyon ürünleri de kuşak mevkiden uzağa yayılabilir. Bu sorunları aşmak için, flash / ReAsH sistemi 11 geliştirilmiştir. Bir Tetracysteine ​​motifine sahip olan yeniden birleştirici füzyon proteinlerinin oluşur. Bu motif bağlanmasını sağlarBir biarsenic fluorofor. Heyecan, ilişkili veya FLASH ya da ReAsH etiketli proteinlerin yerinde hemen çökeltilerin a polimere singlet oksijeni ve böylece photoconvert diaminobenzidin (DAB) üretebilir. DAB polimeri, elektron yoğun ve dolayısıyla TEM rekombinant füzyon proteininin dağılımının haritasının için kullanılabilir osmium tetroksit ile boyanmış olabilir.

2011 yılında, Shu ve ark. 10 floresan ve 448 nm mavi ışık ile uyarıldığı zaman birçok singlet oksijen radikallerini oluşturmak mümkün Arabidopsis bir flavoprotein türetilen küçük 106 amino asit füzyon etiketinin oluşan miniSOG sistemini sundu. Bu tekli oksijen radikalleri ve immünolojik etiketlenmiş antikorlar 11 önemli ölçüde daha yakın olan etiketli protein, yüzeyine yakın polimerleri oluşturmak için foto-oksidaz diaminobenzidin için kullanılabilir. Flaş / ReAsH sistem floro getiren gerektirirkenkrom ve Fotoçevrim yapmadan önce hücre içine diaminobenzidinin, miniSOG sistem sadece diaminobenzidin ve ışık gerektiren ve buna ek olarak diaminobenzidin polimerize yaklaşık iki kat etkilidir. Burada, miniSOG DNA tamir odaklarının ultra yapısını eşlemek amacıyla ESI ile bir arada kullanılmaktadır.

DNA tamir odakları (DRF)

Onlar translokasyonlarda ve genetik bilginin kaybına yol açabilir çünkü unrepaired DNA çift iplikli sonları hücreye ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Buna karşılık, bu yaşlanma, kanser ve hücre ölümüne yol açabilir. DNA çift iplikli sonu onarım katılan pek çok protein 12-14 kırmak DNA çift sarmalı etrafında bir araya odaklar birikir. Bunların işlevi kesin olarak bilinmemekle birlikte, bu DNA çift iplik sonu içeren ve DNA çift iplik kırılım onarımı edilir çekirdeğinde sitesini göstermektedir.

DNA tamir foci (DRF) floresan mikroskobu ile karakterize edilmiştir ve DNA hasarı 12,15 için biyomarkerların olarak hizmet vermektedir. Onlar çift iplikli mola büyüklüğüne masif göreli ve son süper çözünürlük mikroskop çalışmaları her 16 odak içinde moleküllerin alt bölümlendirme bazı kanıtlar ortaya dek görece homojen olarak kabul edildi. Bu siteler organize anlamak için, birbirine yatan biyolojik yapıların tüm göreceli görselleştirmek için gereklidir. Bu floresan mikroskobu ile elde ancak elektron mikroskobu 17,18 ile mümkün olamaz. Burada bir yöntem DNA çift sarmallı mola onarım ultrastrüktür keşfetmek için bu kombine yaklaşımın potansiyelini göstermek için miniSOG yöntemi ile elektron spektroskopik görüntüleme birleştiren açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

MiniSOG Hücre hatları 1. Üretim

  1. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile takviye edilmiş düşük glikoz Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çanak U2OS (insan osteosarkoma) hücreler büyümek atmosfer.
  2. Bunlar miniSOG ve mCherry sekansları içeren plazmid transfeksiyon reaktifi yapılar 19 ve imalatçının protokolüne göre, onarım etiketli proteinlerin saflaştırılmış transfeksiyon kalitesi (A269 / 280 oranı 1.8-2.0) ile lipofeksiyon ile% 80 konfluent olduğunda, hücreleri transfekte. MiniSOG ifade plazmid Tsien-Lab sipariş edilebilir: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. İki gün sonra transfeksiyon flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile miniSOG ve MCherry etiketiyle rekombinant proteini eksprese eden hücreler, kriteri. Hücreleri toplayın20 aşırı ifade eden hücreleri önlemek için bir ara madde floresan ile.
  4. Kültür,% 10 FBS ve seleksiyon ajanın G418 (Geneticin) 0.6 ug / ml ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde 10 ml bir 10 cm'lik bir tabak üzerinde pozitif hücreler.
  5. Görünür koloniler plakalar üzerinde ortaya çıkmıştır sonra, MCherry pozitif kolonilerin ekranı ters bir floresan mikroskop kullanılarak ve kalıcı bir kalem ile (plaka alt üzerine) çevrelerindeki daireler çizin. Düşük büyütme hava objektif lens (örneğin, 10x) kullanın ve dikkatli steril 1000 ul pipet içine emme yavaş yavaş koloniler çizilmeye ve steril tekniği kullanarak klonları seçin.
  6. Seçilen koloniler genişletin ve% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenmiş aşama 1.1 açıklanan büyüme ortamı kullanarak onları kısımlarını aşağı dondurma. Steril 18 x 18 mm 2 kapak fişleri onları büyüyen ve bunları teşhir ederek DRF oluşumu için hücreleri testRadyasyon 2 Gy. Stabil bir miniSOG mCherry ifade ışınlanmış hücreler mCherry görüntülenmesinde filtre seti kullanan bir floresan mikroskop ile görüntülendi zaman tamir protein DSBs tipik odak desen özelliği göstermek zorundadır etiketledi.

2. Hücre Kültürü

  1. Kültür U2OS hücreleri stabil miniSOG ifade ve mCherry adımda 1.1 belirtilen şartlar altında onarım proteinleri etiketledi. DMEM 2 ml ihtiva eden bir 35 mm çapında bir cam alt tabak içinde% 80 konfluansa kadar hücreleri büyütün. Plastik ve kullanılan plastik kapak kayma verdiği tutkal kullanılan reçine sulu ve alkollü çözümlere karşı dayanıklı ve dirençli olduğundan emin olun!
  2. Denemeyi gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için bir floresan mikroskop kullanılarak steril bir elmas kalemle çizilerek ektopik proteinleri ifade hücreleri içeren yaklaşık 1 mm 2 küçük bir alanda özetlemektedir. Alternatif bir cam alt çanak t kullanınşapka lamel yerleşik bir ön kazınmış ızgara sistemi ile lamel içeriyor.
    NOT: ESI ve floresan mikroskobik resimler 21 birleştirerek yüksek kalitede bağıntılı mikroskopi kullanılarak ise, lamel kalınlığı immersiyon yağı hedefleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu kalınlık No. 1.5 (0,16-0,18 mm) olması gerekir. Bölge kenarlarına yakın oluşabilecek reçine polimerizasyonu ile sorunları önlemek amacıyla TEM incelenecek için çanak merkezine yakın bir alan seçin (nokta 4,10-4,13 bakınız).

3. DNA Hasarı İndüksiyon

  1. , Gama radyasyonu ile hücrelerin ışın tedavisi, bir radyomimetik ilaç kullanımı, ya da (18,22 veya 23 de tarif edildiği gibi, örneğin,) konfokal mikroskop lazer ışınlama, mikro hasarını teşvik eder.
  2. Bu örnekte, 405 nm sol kullanarak bir sezyum-137 radyasyon kaynağı veya lazer microirradiate gama ışınlama 2 ve 6 Gy ile hücrelerin ışın tedavisi0,5 ug / ml Hoechst ile 20 dakika boyunca hücrelerin duyarlılaştırılması sonra konfokal mikroskop id hal lazer.

4. Numune Hazırlama

  1. 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde ya da karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit DİKKAT 1 ml hücreleri saptamak.
    DİKKAT: Paraformaldehit ve sodyum kakodilat zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın.
  2. 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 ya da fosfat tampon maddesi, pH 7.4, 4 ml hücreler iki kez yıkayın.
  3. 2 ml 50 mM glisin ile sabitleştirilmiş hücreler tedavi, 5 mM aminotriazol ve 30 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ve 0,1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde 10 mM potasyum siyanür DİKKAT (pH kontrol!), Reaksiyona girmemiş bloke etmek için aldehit grupları ve arka plan artırabilir hem grupları tarafından üretilen reaktif oksijen türleri bastırmak için.
    DİKKAT: Potasyum siyanür son derece zehirlidir! WKulak eldiven, bir başlık altında çalışmak ve yeterince zehirli maddeler atmayın. PH belirlenmiş ve doğru olması önemlidir, böylece, reaksiyon pH karşı çok hassastır.
  4. Bağıntılı mikroskopi isteniyorsa, ters bir floresan mikroskop 2D veya 3D adımda 2.2 seçildi alan kaydedin.
  5. 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içine, bir 10 mg tablet diaminobenzidin hidroklorür koyarak 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür DİKKAT çözeltisi hazırlayın. Distile H, konsantre edilmiş hidroklorik asit (11.65 M) 2 O ve 20 ul 980 ul ekleyin ve çözelti, açık kahverengi ve berrak hale gelene kadar karıştırın. 7.0 ile 7.6 arasında bir pH değerine kadar sodyum hidroksit ile pH ayarlanması sırasında, 1 mg / ml'lik bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M fosfat veya 0,1 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde bu çözüm seyreltilir (pH 7,4 önerilir).
    UYARI: diaminobenzidin zehirlidir! Eldiven giyin ve yeterince zehirli maddeler atmayın.
  6. Fotooksidasyon, replace 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ya da fosfat tampon maddesi içinde 1 mg / ml diaminobenzidin hidroklorür çözeltisinin 2 ml'si ile tamponu. Işıktan bu çözüm korumak ve oksijenin çözünürlüğünü artırmak için 4 ° C'nin buz üzerinde soğumasını. (Çözelti içine yerleştirilir ve bir oksijen şişeye bağlı bir hortum kullanarak) bir solüsyonu ile oksijen kabarcıkları geçirmek suretiyle oksijen ile çözelti Doymuş. Tekrar pH'ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
    Not: Bu, pH pH 7.0 ve pH 7.6 arasında olduğunu fotooksidasyon reaksiyon için çok önemlidir.
  7. Dikkatli bir 40x immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış bir ters floresan mikroskop üzerine sabit hücrelerle çanak monte edin ve ilgi alanına taşımak. GFP veya CFP filtre küpleri kullanarak mavi ışıkla miniSOG etiketi Excite. MiniSOG 473 nm 10'da bir omuz ile 448 nm bir uyarım maksimum vardır.
  8. Hatta yeşil miniSOG floresan ha sonra aydınlatma ile devamtamamen kayboldu ve polimerize diaminobenzidin kahverengi fotoğraf oksidasyon ürünü iletilen ışık kanalda çıkana kadar s. Oksidasyon ürünü hücrelerin çoğunda görünür olduğunda, foto-oksidasyon durdurmak için floresan aydınlatma kapatın.
    NOT: Fotoğraf-oksidasyon objektif lens, filtre iletim dalga boylarında ve verimlilik ve aydınlatma kaynağına göre birkaç dakika sürebilir.
  9. Postfix'i 0.1 M sodyum kakodilat, pH% 2 gluteraldehit, 1 ml 7,4 tamponu veya 30 dakika boyunca fosfat tamponu pH 7.4 ile hücreleri.
  10. 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH 7.4 veya 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde 20 dakika boyunca% 0.1% -0.5 ozmiyum tetroksit hücrelerin zarları sabitleyin.
    NOT: Bu zarlarını stabilize gerekli ozmiyum tetroksit mümkün olan en düşük konsantrasyonu kullanılması tavsiye edilir. Polimerleştirilmiş DAB çökeltiler ESI güçlü doğrudan tespit edilebilir bir azot yüksek yoğunluğa da sahip yanaozmiyum boyama miniSOG etiketli proteini tespit etmek için ve ESI zarar verebilecek gerekli değildir. Osmiyum tetroksit çok zehirlidir! Davlumbaz çalışın ve yeterince zehirli atık imha edin.
  11. 30,% 50,% 70,% 90,% 98,% 100,% adım etanol (her biri 5 dakika) ile bir etanol dizi hücreler kurutmak. Daha sonra, bir 1 hücreleri inkübe:% 100 etanol ve akrilik reçinesi (LR White) 1 karışımı ve 100 en azından bir 4 saat hücreleri inkübe edilmeden önce, hücre içine girmesini kolaylaştırmak için 4 saat süre ile bir çalkalama düzenine üzerine tabak koyun % akrilik reçine (LR Beyaz).
  12. Reçinenin polimerize etmek için, bir jilet kat akrilik reçine hızlandırıcılı kenarı ile etiketlenmiş bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapağı kesti. Hızlandırıcı sadece jant kapakları ve tüp içine akmaz emin olun. Daha sonra, dikkatlice yaklaşık LR Beyaz reçine Pasteur pipeti kullanarak üçte iki tüp doldurun. Reçine iletişim zekâ içine almaz özenh jant üzerinde hızlandırıcı!
  13. Çanak hücreleri sızan reçine çıkarmak ve tüpün genişliği neredeyse tamamen çanak cam kaplı gözlem penceresi doldurur ve böylece dik ayakta mikrosantrifüj tüp üzerine baş aşağı çanak yerleştirin.
  14. Daha sonra, tüp ve lamel mühür tüp reçine artık hücrelerin kapsar şekilde tüp ters çevirmek için hızlandırıcı için 1 dakika 2 bekleyin.
  15. 60 ° C'da bir fırın içine tüp ile çanak yerleştirin ve 12 saat için tedavi.
  16. Blok kürünü zaman fırından ekli reçine dolgulu mikrosantrifüj tüp ile çanak kaldırmak ve çanak ependorf tüp ayırın. Sıvı azot ve sıcak su içinde donmuş halde öğütme süreçleri ile ayrılmasını kolaylaştırmak.
  17. Cam alt çanak atın ve dikkatle bloğu kaldırmak için bir jilet ile ependorf tüp açmak kesti.
  18. Kalıcı bir kalem ile blok etiketleyin.
  19. Tri Bir jilet kullanınDaha önce bir elmas veya tungsten kalem ile işaretlenmiştir alanı içerir (veya ilgi hücreleri alanı içeren) 1 ila 2 mm bölgesinde bir şey kalmayacak şekilde blok m.
  20. Bir ultramicrotome içinde blok monte bir düzeltme bıçakla blok Döşeme ve elmas bıçak kullanarak yaklaşık 50 nm ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir.
  21. Yüksek aktarım 300 meş ızgaraları bölümleri Pick up. Bu ızgaralar çok küçük ızgara çubukları ve böylece ilgi alanında daha az hücre kapsamaktadır.
  22. Coat karbon yaklaşık 0.2-0.4 nm TEM elektron ışını altında istikrara kavuşturmak için bir karbon kaplayıcı kullanarak ızgaraları bölümleri.

5. Elektron Mikroskobu

  1. Bir enerji filtresi ile donatılmış bir TEM içine ızgaraları yükleyin. Mikroskop ve üreticinin talimatlarına göre enerji filtresi ayarlama sonra, düşük büyütme modunda bölümlerde hücreleri kontrol (normal iletim) ve karşılaştırmak(adım 4.4 'de elde edilen) uygun olduğunda bunları veri floresan.
  2. Ilginç özellikleri (DNA hasarı parça veya DNA onarım odakları) ile bir çekirdeğe kez enerji filtreleme moduna geçin bulundu ve kalınlık haritası kayıt edilir.
    NOT: Bu prosedür sıfır kayıp ve filtresiz görüntü kaydını içerir. 0.3 kadar kalınlıklar ücretsiz yol (olay demetinin elektron% 30 örnek tarafından dağınık alır) iyi element haritaları oluşturmak için yeterince ince anlamına gelir.
  3. Kullanılan mikroskop enerji filtresi kontrol yazılımı kullanarak elemanları fosfor ve azot Tutanak oranı haritalar. 20 eV bir yarık genişliği ile de, 120 eV enerji kaybı 20 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliğine sahip 175 eV enerji kaybı fosfor haritası sonrası kenar görüntüleri kaydetmek. Ayrıca 35 eV bir yarık genişliğine sahip 358 eV 35 eV ve ön kenar görüntüleri bir yarık genişliği ile 447 eV azot haritalar, kayıt sonrası kenar görüntüler için.
    NOT: görüntülü elemanların içeriğinde bu yana (phosphOrus ve nitrojen) (yakl.% 1), gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile görüntüler oluşturmak için "3 pencere yöntemi" üzerinde "Oran Görüntü" (kalitatif element harita) (elementer haritayı quantitate) tercih nispeten düşüktür.

6. Görüntü İşleme

  1. (Örneğin, Dijital Mikrografik) edinilen resim dosya biçimini işleyebilir bir görüntü işleme yazılımı element oranı haritalar açın. Kırmızı kanal ve bir RGB görüntüsünün yeşil kanal içine fosfor haritası içine azot haritası kopyalayın, daha sonra üst üste ve haritalar hizalayın.
  2. Etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası olarak kompozit görüntü aktarın. Katmanları kullanabileceğiniz bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, Photoshop) görüntü açın.
  3. 8 bitlik veri setine (255 0) ile görüntüdeki minimum ve maksimum değerleri rescaling her kanalın dinamik aralığını ayarlayın.
  4. Kullanarak azot haritadan fosfor içeriği (ÇıkartProtein dağılımını gösteren bir harita nitel üretmek amacıyla "Katmanlar" pencere).
  5. "Dizinlenmiş renkli" içine önceki adımda oluşturduğunuz nükleik asit (fosfor) ve protein (azot) haritaları dönüştürme ve nükleik asit dağılımı ve bir mavi arama tablosu gösteren harita için CMYK renk uzayında sarı arama tablosu oluşturmak olmayan nükleoprotein haritayı göstermek için. Renkler, iki element haritalar arasında maksimum kontrast üretmek için seçilir.
  6. Farklı katmanlar olarak fosfor ve protein dağılımını gösteren haritalar yeni bir görüntü oluşturun ve içe aktarın. Birbirine bindirilmiş iki katmanı görmek için "ekranı" şeffaflık modunu kullanın.
  7. Adım 5.2 elde sıfır kayıp görüntüyü açın. Bu görüntü, geleneksel TEM görüntü benziyor kaydedilen alanın görüntüsünü temsil ancak numune ile çarpışan olmadan numune geçtik elektronları içeriyor. IhracatTIFF görüntüsü olarak bu görüntü.
  8. Bir fotoğraf editörü ihraç sıfır kayıp görüntü açın ve element haritayı gösteren görüntünün üst tabakası içine kopyalayın. "Ekran" şeffaflık modunu kullanarak görüntüyü hizalayın.
  9. İsteğe bağlı eşik segment sıfır kayıp görüntü miniSOG kaynaklanır sinyali. Yukarıda tarif edildiği gibi ayrı bir katman olarak elde edilen görüntü ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ESI

Konvansiyonel TEM görüntüleri ile çekirdeğe (Şekil 1) ESI görüntülerini karşılaştırarak (örneğin, Şekil 7-1) kolayca ayırt edilebilir anatomik yapıların dramatik bir artış ortaya koymaktadır. Kromatin sırtlar sarı görünür ve fare hücrelerinde chromocenters belirlemek oldukça kolaydır. Prefabrik ribozomlar önce fosfor yönünden zengin olan RNA, ek olarak nitrojen açısından zengin bir protein, yüksek miktarda yana çekirdekçikler ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ESI özellikle fosfor bakımından zengin olan alanlar harita yapabiliyor çünkü çekirdeğinde kromatin ve ribonükleoproteinlerin farklı durumları incelemek için mükemmel bir araç olarak hizmet verebilir. Bu derinden bir elektron mikroskobu ile elde edilen ve spesifik olmayan zıt yöntemleri bağımlı değildir olabilir ayrıntı miktarını artırır. ESI bir dezavantajı aynı hızlanan gerilimde geleneksel TEM daha ince kesitler gerektirir. Bu seri bölümleri ile çalışan veya tomografik yöntemlerle 28 kullanılarak aşılabilir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Dr. Roger Tsien'e bize miniSOG yapılarını sağladığı için teşekkür ederiz. TEM konusunda yardım için Dr. Xuejun Sun'a teşekkür ederiz. Oksijen sağlamak için Cross Cancer Institute'tan Lisa Lem ve Peter Shipple. Hilmar Strickfaden, Alberta Kanser Vakfı tarafından doktora sonrası bursuna sahiptir ve Bayrische Forschungsallianz tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri ve Alberta Kanser Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm cam alt tabaklarMatTekP35G-1.5-14-C
Izgaralı 35 mm cam alt tabaklarMatTekP35G-2-14-CGRD Daldırma hedefleri için yapılmamıştır
LR Beyaz: akrilik reçineemsdiasum14381
LR Beyaz hızlandırıcıemsdiasum14385
3,3′-Diaminobenzidin tetrahidroklorür 10 mg tabletSigmaD5905
İnce Çubuk Izgaralar 300 MeshSPI1161123
Tungsten Noktalı Laboratuvar Kalemiemsdiasum41148
Osmiyum Tetroksitemsdiasum19100
Karbon Kaplayıcı 208 karbonCressington
Ultra mikrotom Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobeeski sürümlerle bile çalışabilir
Dijital Mikrograf V.2.30Gataneski sürümlerle bile çalışabilir
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-YapılarıTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
sezyum 137 radyasyon kaynağı "İŞARET 1" ( J.L. Çoban & İlişkili)
ImageJ/FiJiaçık kaynak
http://fiji.sc/Fiji 2 ml Eppendorf tüpleriFisherbrand05-408-146
Elmas Bıçak ultra 35°Diyatom
Kırpma Bıçağı ultratrimAtom
Sodyum koidilat trihidratemsdiasum12300Dikkat Toksik!
Glutaraldehit EM Sınıfı% 8emsdiasum16020Dikkat Toksik!
Sodyum fosfat dibazikemsdiasum21180
Sodyum fosfat monobazikemsdiasum21190
Paraformaldehitemsdiasum19202
Osmiyum tetroksit% 4 çözeltiemsdiasum19150
Ters Floresan Mikroskop Axiovert 200MZeiss
Hidroklorik AsitFisherbrandA142-212
Sodyum Hidroksit Çözeltisi 10MFluka72068
OksijenMedigas
3-Amino-1,2,4-triazolSigmaA8056
Potasyum siyanürSigma207810Dikkat Toksik!
Etanolemsdiasum15058Dikkat Toksik!
Tıraş bıçağı Tek Kenar Karbon Çelikemsdiasum71960Dikkat Keskin!
DMEMSigmaD 5546
FBSYaşam Teknolojileri16000-044
G418Yaşam Teknolojileri11811-023
DMSOSigmaD2650
Transmisyon Elektron Mikroskobu 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Enerji filtresiGatan

Kaynaklar

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041(2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135(2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

miniSOG EtiketiTransmisyon Elektron MikroskobuFloresan MikroskobuLazer Mikro irradiyasyonFosfor HaritalamaAzot HaritalamaKromatin Ultrayap sDNA ift Zincir K r

İlgili makaleler