Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler ¹ temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi ^2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur.

Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon ¹⁰ immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü ^11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom ¹⁵ kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi ¹⁶ fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin ^17,18.

Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi ¹⁹ kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık ^20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan ²⁴ indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya ^24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR ²⁵ füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto ^24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin ²⁵ bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların ^20,23,24 kontrol edilebilir. TTA'nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda ^27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA ²⁸ (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin ^29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA ²⁸ bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) ³⁰ TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri ^31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir.

Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.

Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim

1. Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco's GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek.
2. % 5 _CO2 içinde 37 ° C 'de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücrelerin tekrar süspansiyon. Yeni 75 cm ² hücre kültürü şişesi içine pipetle 1 ml 14 mi ortamı eklenir.
3. Hemasitometre kullanarak hücre sayısını analiz.
4. Oyuk başına 2 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum HEK293 hücreleri, 24 saat süre ile inkübe edilir.
5. Transfeksiyon için transfeksiyon reaktif üreticisi tarafından sağlanan protokolünü kullanır. Transfeksiyon ayıracı kullanılarak pEGFP-C2 ya da pEGFP-C2-CaeB olan hücreleri transfekte. Kullanmak transfeksiyon extra pure ısınmak için önceent ve RT için gerekli ortam. DNA transfeksiyon reaktifi: 1 oranını 3 kullanın.
   1. Ayrıntılı olarak, bir pipet ile doğrudan serumsuz DMEM ortamı içinde 50 ul transfeksiyon reaktifi 1.5 ul. Kompleks oluşumu için, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden karışıma kodlayan DNA, GFP ya da GFP-CaeB 0.5 mg pipet ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
   2. Bir damla damla bir tarzda, reaksiyon karışımı ekleyerek hücreleri transfekte ve 24 saat boyunca% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
6. 1 mg ekleme /% 5 _CO2 içinde 37 ° C 'de GFP-pozitif klonların seçilmesi için geneticin'e ml.
7. : 1 oranında 6 gün sonra, 1, orta ve HEK293 süpernatan barındıran bir 96-çukurlu plaka içinde sıralama akış sitometrisi ile, tek hücrelerin izole eder. 4966 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edildi kültürlenmiş konfluent HEK293 hücrelerinden HEK293 süpernatant oluşturur.
8. Ertesi gün, ortam 1,5 ihtiva eden kültür ortamı yerine0 mg / ml genetisin. Haftada bir kez medya değiştirin. Hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için, bir 24-çukurlu plaka aktarın. 1.5 mg / ml genetisin içeren ortamda 5: 1 arasındaki bir oranda, haftada iki kez hücreleri alt yetiştirirler. Son olarak, bağışıklık beneklenme analizi ile GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi analiz etmek ve akış sitometrisi.

Bağışıklık beneklenme analizi ile kararlı hücre kuşaklarının 2. analizi

1. Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
2. % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 ⁴ hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
3. PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0 gözenek boyutu.Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde 45 um).
4. PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
5. MPT 4 ml anti-GFP antikorunun 4 ul seyreltilir ve 4 ° C'de membranlar O / N inkübe edin.
6. 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
7. MPT 4 ml yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor, 0.8 ul membranlar inkübe edin.
8. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (2.6 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.

3. Bir Akış Sitometreyi Kullanarak Hücreleri analiz edin.

1. PBS hücrelerin tekrar. Ileri sc ayarlamak için negatif kontrol olarak HEK293 hücreleri kullanınardıl (FSC) ve yan dağılım (SSC) hücreleri ölçekte böylece. Hücre çiftleri, agrega ve hücre artıkları dışlayarak canlı hücrelerin üzerinde bir kapı çizin.
2. Lekesiz hücreler çok FL1 kanalı (488 nm argon lazer) için histogram soldaki böylece photomultiplier tüp (PMT) kazanç ayarlayın.
3. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinin floresan yoğunluğu analiz etmek FL1 kanalının histogram açıp kapı nüfus 10.000 olayları kazanır.
4. Ticari FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz.

Uyarımlı Ekspresyon Vektör Sistemi ile Sabit bir Hücre Serisinin 4. transfeksiyonu

1. Tohum HEK293 hücreleri / oyuk 1 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde GFP ya da GFP-ifade eden CaeB.
2. 19 saat sonrası tohumlama, regülatör plazmid ve tepki plazmid ya kodlayan Bax veya aktive kaspaz 3 ile hücreleri co-transfect.
   1. Stabil HEK293 hücrelerinin birlikte transfekte edilmesipWHE125-P regülatörü plazmid 100 ng (Şekil 2) ve yanıt plazmid pWHE655-hBax ya pWHE655-revCasp3 (Şekil 3) ve polietilenimin 0.4 ul, 100 ng.
   2. Opti-MEM ortamı 75 ul DNA ve polietilenimin transfeksiyon reaktifi, her hazırlama ve oda sıcaklığında tam olarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Kompleks oluşumu için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca her iki karışımları birlikte inkübe edilir.
3. Polietilenimin / DNA solüsyonu damla damla hücrelere ilave edin ve% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.

Apoptoz 5. İndüksiyon

1. Post-transfeksiyon 5 saat, kültür ortamına 1 ug / ml doksisiklin ilavesiyle pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükler. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de 18 saat inkübe hücreleri.

İmmünoblot Analizi Ana Hücre Apoptoz 6. Analizi

1. H öncesinde hücrelerin kontrol edinışık mikroskobu altında arvesting hücre ölümü indüksiyonu için kontrol edin. Apoptotik hücreler ölüyor hücreyi çevreleyen apoptotik cisimlerin varlığıyla algılanabilir vardır.
2. Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C 'de 5 ila 95 ° C'de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri.
3. % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 ⁴ hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın.
4. Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0.45 um gözenek boyutu).
5. PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar.
6. 4 μ seyreltinMPT 4 ml anti-ayrıldı poli ADP-riboz polimeraz (PARP) antikorun L ve 4 ° C de O / N inkübe edin.
7. 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları.
8. 4 mi MPT içinde seyreltilmiş 0.8 ul yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile membranlar inkübe edin.
9. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (6.7 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın.
10. 7 mi Western Blot Sıyırma Tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek suretiyle bağlanan antikorlar çıkarın.
11. PBS ile üç yıkamadan /% 0.05 (6.7 de tarif edildiği gibi), Tween 20 sonra, 4 ° C'de MPT O / N 4 ml anti-aktin antikor 4 ul membranlar prob.
12. (6.7 de tarif edildiği gibi) MPT üç yıkama aşamasından sonra, ho, 0.8 ul membranlar inküberseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor MPT 4 ml seyreltilmiştir.
13. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra,% 0.05 / PBS ile membranlar 6.7 de tarif edildiği gibi Tween 20 (üç defa yıkamak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için bir film gelişimi için standart donanım uygulayın.
    Not: Tüm bekletme işlemleri, belirtilen süre ve sıcaklıkta, bir plaka karıştırıcısı üzerinde gerçekleştirilmiştir.

İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Ancak, bu deney belirleyemiyor. Bu nedenle, stabil bir şekilde transfekte edilmiş HEK293 hücre çizgileri aynı zamanda akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, her iki hücre hatlarının hücre üzerinde% 90 GFP olarak ifade edilmiştir. Bu nedenle, bu kararlı hücre çizgileri daha CaeB fonksiyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bir sonraki adımda, CaeB anti-apoptotik aktivitesi klivaj olmuş PARP karşı bir antikor kullanılarak bağışıklık beneklenme analizi ile test edilmiştir. Nükleer PARP'nin proteolitik bölünme DNA onarım faaliyeti inaktive ve Termi tipik bir belirtecidirapoptoz nal aşamaları. PARP yarılması GFP ekspresyonu ne de GFP-CaeB hiçbiri hücreler için toksik olduğunu gösterdi HEK293-GFP veya HEK293-GFP-CaeB hücrelerde algılanmaz. Hücreler staurosporin ile muamele edildi, ancak, iç apoptoz güçlü bir indükleyicisi, PARP bölme (Şekil 5) tespit edilmiştir. Önemli olarak, HEK293-GFP CaeB hücreleri Coxiella burnetii'nin tip IV salgılama sistemi efektör protein CaeB 7, anti-apoptotik etkinliği gösteren, PARP bölünme indirgenmiş görülmez.

Adım CaeB apoptotik yolun müdahale hangi analiz etmek, Tet-On sistemi kullanıldı. Ayrıntılı olarak, HEK293-GFP veya HEK293-GFP CaeB hücreler düzenleyici bir plazmid konstitütif bir doksisiklin kumandalı çift bastırıcı / aktivatör setup (Şekil 2) ve bir pTRE yanıtı plazmid kodlayan, ya tam uzunlukta, insan Bax ya da aktive edilmiş formu içinde eksprese ile transfekte edilmiştir İnsan kaspaz 3, (revCasp 3 olarak adlandırılanŞekil 3). Uyarıcı olmayan koşullar (Şekil 6) altında PARP-bölünme olmaması ile gösterildiği gibi, bu sistem sıkıca düzenlenir. Transfekte edilmiş hücrelere doksisiklin eklenmesi Bax ekspresyonu veya revCasp 3. CaeB daha sonra ifade ve Bax aktivasyonu tarafından üretilen apoptotik sinyal CaeB ekspresyonu bloke edilmelidir Bax alt apoptotik yolu ile uğratır sonuçlandı. Gerçekten de, HEK293 hücreleri stabil şekilde eksprese eden, GFP-CaeB HEK293-GFP hücreleri belirgin bir PARP-bölünmesini sergilemiştir derinden, doksisiklin kontrollü Bax ekspresion neden olduğu apoptosisi inhibe eder. Bu sonuç göstermektedir Bax aktivasyonu akış aşağısında CaeB blok apoptosis. Apoptotik yolun bir geç olay - Daha sonra, CaeB kaspaz 3 aktivasyonu müdahale edip analiz edildi. Efektör kaspaz 3 kez activ belirten HEK293-GFP hücreleri, hem de HEK293-GFP CaeB hücreleri, sergi, PARP bölme (Şekil 6),ated, CaeB meydana gelen apoptozu engel olamaz. Birlikte alındığında, bu veriler CaeB Bax ve kaspaz 3 aktivasyonu arasındaki hareket ettiğini göstermektedir.

Şekil tetrasiklin düzenleyici sistemin 1. şematik bakış. Tet-On sistemi iki farklı plazmidler, düzenleyici ve müdahale plazmid oluşmaktadır. ve Tet duyarlı ters transaktivatörü (rtTA açık daire) düzenleyici plazmid Tet duyarlı transsilencer (dolu daire TTS) kodlar. Her iki protein de yapısal olarak güçlü ve konstitütif uzama faktörü-1 a promotörü (P EF-1 a) kontrolü altında ifade edilmiştir. TTS ve rtTA kimerik (sırasıyla, susturucu ve aktivatör) bir ökaryotik transkripsiyonel düzenleyici etki kapsayan, transkripsiyon faktörleri ve bakteriyel bir tetrasiklin bastırıcı (TetR) 'dir. TetR DNA, yedi Tet bağlanma aracılık (teto) dizileri içerir. teto birlikte Tet-duyarlı element (TRE) oluşturulması, uyarılabilir az sitomegalovirüs promoteri (CMV P) akıntı yukarısında konumlanır. Olmayan koşullar uyaran altında TTS ekspresyonunu önleme TRE bağlıdır. Doksisiklin ek (Dox; dolu elmas) sonra rtTA Dox bu şekilsel değişikliklere ve aktivasyonuna yol ile etkileşime girer. Aktif rtTA böylece apoptosis indüksiyonu ve hücre ölümüne yol açan, ilgili hedef genler Bax ve kaspaz 3 transkripsiyonunu sağlayan yanıt plazmid üzerinde TTS değiştirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Düzenleyici plazmid pWHE125 Şekil 2. şematik bakış. Bac içinde yayılması için gerekli Elemanlarıbakterilerin, bir replikasyon kaynağı (ori pBR) ve ampisilin bir antibiyotik direnç kaseti (Amp R) dahil olmak üzere, ve bu, insan sitomegalovirüsü, güçlü yapısal hemen erken promoteri / güçlendiricisi gibi Tet-transregulators, ekspresyonu (P, / E hCMV), çocuk felci-virüs (PV-IRES) ve Simian virüsü 40 (SV40 poliA) görüntülenir bir polyA-site bir iç ribozom bağlanma yeri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yanıtı plazmid Şekil 3 şematik bir bakış. Elemanlar bir replikasyon orjini (ori pBR) ve bir antibiyotik direnç kaseti (Amp R) dahil olmak üzere, bakteri, çoğalma için esas teşkil eden ve bu transgen expressi olarak ökaryotlarda, indüklenebilir ekspresyon içinTet-bağımlı minimal promotör TREtight (P TREtight), faiz, insan Bax (hBax) geninin ve Simian virüsü 40 (SV40 poliA) bir polyA site ile kaset üzerinde tasvir edilmiştir. transgen ifade kaseti tavuk HS4 izolatör çekirdek dizisi (HS4 çekirdek) iki kopya tandem direkt tekrarları ile çevrili. Ayrıca, bir fare fosfogliserat kinaz 1 yükseltici (P mPGK) oluşan bir G418 direnç kaseti, bir neomisin direnç geni (G418 R) ve insan timidin kinaz polyA sitesi (TK poliA) mevcuttur. büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakam.

Şekil 4. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB stabil bir şekilde yeşil floresan proteini ifade eder. (A) HEK293-GFP ve tüm hücre lizatlarıHEK293-GFP-CaeB hücreleri kararlı ifadeyi göstermek GFP için imünoblotlanır bulundu. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücreleri (B) Temsilcisi akış sitometri (FACS) analizi GFP yoğunluğunu göstermek için gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil staurosporin kaynaklı apoptoz. HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde GFP-CaeB ifade 5. Etkileri içsel apoptozu indükleme 6 saat boyunca 4 uM staurosporin ile tedavi edildi. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP bölünme HEK293-GFP hücrelerine kıyasla HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde azalma oldu. Bir büyük halini görmek için tıklayınızBu rakamın.

Teton sisteminin Şekil 6. Kullanım CaeB etki noktası daraltmak için (A). Apoptosis, HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde Bax ekspresyonu ile indüklenmiştir. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP boşluğuna HEK293-GFP hücrelere kıyasla HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde indirgendi. (B) Apoptoz HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinde revCasp 3 ekspresyonu ile indüklenmiştir. Apoptoz yarık PARP bağışıklık beneklenme analizi ile analiz edilmiştir. PARP bölünme HEK293-GFP-CaeB ve HEK293-GFP hücrelerinde karşılaştırılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.