Method Article

Basit ve Bilgisayar destekli Fareler için Koku Testi

DOI:

10.3791/52944

⸱

June 15th, 2015

 , 
1Unit of Anatomy, Department of Medicine, University of Fribourg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerde basit ve tarafsız bir koku alma testi sunuyoruz. Bu protokol ile koku ayrımı, tercih, kaçınma ve suya kıyasla yeni bir kokuya duyarlılık tek davranışsal seanslarda değerlendirilebilir. Bu yöntem tek bir deneyci için endikedir ve analiz bilgisayar destekli video işlemeye dayanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koklama yüksek türler arasında muhafaza edilir ve üreme ve hayatta kalma için gereklidir.

İnsanlarda, olfaction da yaşlanma ile etkilenir duyu biridir ve nörodejeneratif hastalıkların güçlü bir belirleyicisidir. Böylece, olfaction testi erken nörolojik açıklarının tespit etmek için bir non-invaziv tanı yöntemi olarak kullanılmaktadır. Koku ağ duyarlılık altında yatan mekanizmaları anlamak için, kemirgenlerde koku araştırmalar son on yılda ivme kazanmıştır.

Burada, biz önceden yiyecek veya su kısıtlaması gerek kalmadan farelerde doğuştan koku algısı ve duyarlılık çok basit, zaman verimli ve tekrarlanabilir koku test yöntemi sunuyoruz. Testler farelere tanıdık bir ortamda gerçekleştirilir, kokular ve odorant maruz kalma 2 dk oturumu sadece gerektirir. Analiz ImageJ bilgisayar destekli komutları kullanarak, post-hoc yapılır ve bu nedenle olabilirBir araştırmacı tarafından başından sonuna kadar yürüttü.

Bu protokol, herhangi bir özel donanım veya kurulum gerektirmez ve koku algı ve hassasiyeti test ilgilenen herhangi bir laboratuvar endikedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olfaction memelilerde en gelişmiş ve önemli duyu işlevlerinden biridir. Koku aktivitede herhangi bir değer düşüklüğü kötü durum senaryosu gıda alımını, sosyal davranış ve hatta hayatta kalma etkileyebilir. İnsanlarda, koku bozulma 1 bağımlı yaş ve nörolojik bozukluklar 2 güçlü bir belirleyicisi olarak kabul edilir - 6. Pennsylvania Üniversitesi tarafından geliştirilen koku kimlik testi şu anda erken nörolojik defisit 7 değerlendirmek ve yüksek olasılıkla demans 8,9 ilerlemesini tahmin edebilirsiniz en çok kullanılan non-invaziv ve ölçülebilir, tanısal testlerin birini temsil eder.

koku alma sistemi ve kemirgenler koku duyusunun öne erişilebilirlik, altında yatan mekanizmaları koku fonksiyonları 10 adresleme araştırma yoğun bir çizgi yol açtı. Daha önce sinyal alınmasından fonksiyon kaybının göstermiştirya Notch1 koku kaçınma 11 etkiler. Bu protokolde koku performansı incelemek için nöronların veya glia sinyalizasyon ligandı, Jagged1 eksik fareler, kullanın.

Doğuştan koku alma algısı olarak üç parametre, koku ve koku hassasiyeti 4 arasındaki ayrım olarak tanımlanır. Kemirgenlerde Koku kontrol çeşitli şekillerde yapılabilir ve bazı davranış çalışmalarda belli bir buhar konsantrasyonlarda ve hassas bir zaman dilimi 12 hayvana bir kokunun sağlanması olfactometers yararlanabilirler - 14. Bununla birlikte, bu enstrümantasyon pahalı ve sadece uzman tesislerde mevcut olabilir. Bizim çalışmamızda, uçucu koku kullanılarak gerçekleştirilen bir basit, hızlı ve yeniden üretilebilir bir koku test protokolü, sağlar. testler cezbedici veya itici koku tedbir algısını açıklanan ve koku ve su 11,15,16 arasındaki ayrımcılığı değerlendirir. W, aynı kurulumu kullanarake farklı konsantrasyonlarda 16,17 bir koku hassasiyeti ölçebilirsiniz. Page ve arkadaşları 18 çalışmalarından esinlenerek post-hoc bilgisayar destekli görüntü işleme, deneysel Körlemenin ve tüm deneyi yürütmek için bir tek kişi için izin gerek kalmadan tarafsız sonuçlar sağlar.

Bu protokol, farelerde koku alma davranışı incelemek için bir başlangıç ​​noktası sağlamak için tasarlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvan prosedürleri bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması konusunda AB Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu olan ve (Canton of Fribourg, İsviçre) yerel Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlanması

  1. Deney hayvanları
    1. Yetişkin erkek vahşi tip ve yaş 3-5 ay transgenik farelerin (C57BL / 6 background) üzerinde deneyler yapın. farelerin üç grup vahşi tip yavru kontroller karşılık (grup A, Jagged1 flox / flox 19) ve iki koşullu KO fare hatları (B grubu, Jagged1ncKO ve C, Jagged1gcKO).
    2. 12 saat kontrollü aydınlık / karanlık döngüsü ile havalandırılmış bir odada standart laboratuvar koşullarında Ev fareleri, ve yiyecek ve su ad libitum sağlar.

2. Deneysel Kurulum

  1. Deneysel arena
    1. Deneysel arenada için, temiz bir steril fare kafesini kullanın (36 cm uzunluk x 20,5 cm genişlik x 13.5 cm yükseklik) (Şekil 1A).
    2. 3 cm yüksekliğinde taze yatak, bir numaralı kafes her fare atayın. Kafesleri yeniden ise, koku hassasiyeti testinde olduğu gibi, koku ve fareler arasında çapraz bulaşmayı önlemek için aşağıdaki önlemleri alacaktır.
      1. Su tarafı işaretleyin.
      2. % 70 etanol, her tarafı için biri ile püskürtülür iki doku kağıtları ile kafesleri dar duvarları temizleyin.
      3. Farelerin genotip göre kafesleri yığmak ve laminar kaputun altında geçici olarak saklamak.
  2. Kamera
    1. Kafes (Şekil 1A) altından 58 cm amacı ile özel bir tripod üzerinde kamera monte edin. Tripod ve kafesin konumunu düzeltmek ve kamera kafesinin üst merkezli olması için izin vermek için işaretleriyle sınırlandırmak.
    2. X 240 piksel, MOV dosyaları olarak saniyede 15.08 kare 320 piksel Video kaydetme.
  3. Kokular
    1. Scen yeniden süspansebelirtilmedikçe, TH, bir çözücü içinde ki bu çözünürdür.
    2. Tercih testi kullanım fıstık ezmesi için. Yer fıstığı yağı, fıstık yağı (ağ / hac% 10) yeniden süspanse edin.
    3. Kaçınma testi kullanımı saf 2-metilbutirik (2 MB) asit (% 98) için.
    4. Duyarlılık testi için, aynı fare kolonisi ve arka plan (C57BL / 6) kadın idrar kullanın.
      1. Kolaylık sağlamak için koku testi 1-2 gün önce idrar toplamak. Dizginlemek ve kafes ızgara üzerinde karnı ile kaputun altındaki fareyi tutun. Kafes ızgara altında idrar damla toplamak için plastik bir petri yerleştirin.
      2. 1.5 ml tüp içinde her kadın idrar toplayın ve hayvanlar arasındaki değişkenliği normalleştirmek için tüm idrar örnekleri karıştırın. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
      3. Deney gününde, idrar çözülmesi ve 10 bir seyreltme faktörü ile iki kere damıtılmış su içinde 4 seyreltileri, yerine (1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000).

3. Koku Testi

Not: Güçlü cezbedici (fıstık ezmesi ve kadın idrar) veya güçlü kovucu (2-MB asit) 15 olarak algılanmaktadır kasten seçilmiştir Bu protokol kokuları içinde. Bu koku davranışı ile herhangi bir müdahale olasılığını ortadan kaldırmak için kaçınma testi öncesinde keyifli kokulara tercih ve duyarlılık testleri yürütmek önemlidir. Bununla birlikte, bu kağıt, tercih ve kaçınma testinde basitlik, hem algı test altında açıklanacaktır. Her davranış oturumu alışma aşaması ile başlar.

  1. Alışma Faz
    1. Temiz atanan kafeste hayvan koyun ve 5 dakika (Şekil 1B) için inceleyelim. Deneysel kafesin çevre evde kafes tanıdık olduğundan, bu kısa süre alışma izin vermek için yeterlidir.
    2. Duyarlılık testi bir günde tamamlanması durumunda, uygulamanıza önce sadece bir kez alışkanlık gerçekleştirmekEn yüksek sulandırılmış koku n. Duyarlılık testi farklı günlerde yapılır, her gün yeni bir temiz kafes bir alışma aşaması gereklidir.
  2. Algı Testi
    1. Alışma sonra kamerayı etkinleştirmek ve hemen altındaki (Şekil 1C) yaklaşık 10 cm kafesin zıt duvarlarına hoş koku (fıstık ezmesi) 60 ul ve nötr koku (musluk suyu) 60 ul pipetle.
    2. Fare 2 dakika (Şekil 1D) için kokuları inceleyelim. Bundan sonra, fotoğraf makinesini kapatın.
    3. Bu noktada, bir sonraki fare alışkanlık aşamasından devam edin. Kovucu koku 60 ul (2-MB asit) ve su içinde 60 ul uygulanarak aynı şekilde tam olarak Uzak Durma testi gerçekleştirir.
  3. Hassasiyet testi
    1. 1: aşağıdaki sırayla bir kadın idrar artan konsantrasyonlarda erkek farelerin gözde eşik değerlendirir 10,000; 1: 1,000; 1: 100; 1:10 ve saf idrarı.
    2. Alışma sonra, daha önce 3.2.1'de açıklandığı gibi deneyci tarafından pipetle yüksek seyreltme her fare maruz bırakmaktadır.
    3. Bir video kamerada 2 dk zaman diliminde, su karşı idrar keşif davranışlarını kaydedin. Tüm farenin kohort yüksek seyreltme (1: 10,000) açısından test edilir sonra, yukarıda belirtildiği gibi, idrar, daha yüksek bir konsantrasyona maruz kalmaktadır.

4. Post-hoc Veri Analizi

Not: açıklanan tüm davranış testleri veri analizi talimatları izleyerek post hoc işlenir.

  1. Windows sistemler için ImageJ MOV dosyaları açın
    1. Http://www.apple.com/quicktime/download özelleştirilmiş ayarları kullanarak Java için Quick Time yükleyin.
    2. ImageJ sitesinde (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html) den Quick Time eklenti yüklemek.
    3. Kütüphane EXTENS içine: ( Program Files QuickTime QTSystem C) QTJava.zip İthalatImageJ iyon (.ImageJ jre lib ext).
    4. Plugins klasörüne kopyalayın de QTJava.zip ve QTJava.jar olarak yeniden adlandırın.
    5. Makro klasöründe bağlı altı komut takın (ImageJ plugins Makrolar).
    6. Açık ImageJ sonra yakın ImageJ derlemek ve Quick Time eklentisi çalıştırmak ve.
    7. Quick Time kullanarak> ImageJ yeniden açın ve Dosya> Al'ı kullanarak MOV dosyasını açın.
  2. Video Ayar
    1. Video dosyası ImageJ açıldığında, deneyi kafes (T0) içine Koku moleküllerini pipetle olan zaman sabit bir 2 dakika keşif elde etmek için video kesti. (Yığınları ToolsSlice sökücü ImageJ Image) 1 artışlarını kullanarak önceki çerçeveleri T0 tekabül çerçeveyi belirlemek ve kaldırmak. 2 dk keşif aşan tüm kareleri silmek için aynı komutunu kullanın.
    2. Kafes merkezli olduğundan emin olun ve gerekli kullanım Image> Transform eğer> Döndür komutunu hizalamak için.
  3. Bakınızo İşleme
    Not: video işleme tamamen bilgisayar destekli ve bu kağıdı eşlik eden makrolar komutları kullanır.
    1. 127 piksel x 218 piksel boyutu kafes üzerine alanını kısıtlamak amacıyla Plugin> Makrolar> Çalıştır komutu Adım 1 makroyu çalıştırın. Kafes (Şekil 2, Adım 1) üzerinde sabit bir dikdörtgen getirin.
    2. Adım 2 makro (Şekil 2, Adım 2) kullanılarak faiz (ROI) bölgede kafes alanını kırpın.
    3. Bir eşik sinyali atama despeckling ve sinyal değişimini filtreleyerek kökenli fare görüntüsünü çıkarmak için Adım 3 makro kullanın. Z ekseni arsa çıkış değerleri 2 dk keşif sırasında "su haznesinin" nin ROI içinde hareket fare gölge yoğunluğuna karşılık, ortalama gri değerlerini gösterir. Bir elektronik tablo dosyasına ROI (Şekil 2, Adım 3) 'e göre adlı bir çalışma sayfasına sonuçları kopyalayın.
    4. Adım 4 makro kullanınROI "koku odasına" fare ortalama gri değerleri ayıklamak. 4.3.3 aynı elektronik tablo dosyasındaki ROI (Şekil 2, Adım 4) 'e göre adlı bir çalışma sayfasına sonuçları kopyalayın.
    5. Daha fazla ROI "su çevre" fare hareketi analizi kısıtlamak amacıyla Adım 5 makro kullanın. 4.3.3 aynı elektronik tablo dosyasındaki ROI (Şekil 2, Adım 5) göre adlandırılır çalışma sayfası üzerine sonucunu kopyalayın.
    6. ROI "koku çevre" fare hareketi analizi kısıtlamak için Adım 6 makro kullanın. 4.3.3 gibi ROI elektronik tablo dosyası (Şekil 2, Adım 6) göre adlandırılır çalışma sayfası üzerine sonucunu kopyalayın.
    7. Tüm videoları işlemek ve hayvanların başına kare sayısını tutarlılık açısından kontrol edin. Burada, 2 dk keşif oturumuna gelen 1.810 kare için tüm hayvanları kayıt.
    8. Her bir hayvan için ve sıralama çerçeveleri ortalama gri va her ROI içinlues büyük 0. Divide daha değerlere göre kare sayısı 1 saniye tekabül ve her ROI harcanan saniye edinin.

5. İstatistiksel Analiz

  1. Her test için http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ bulunan formülü kullanarak Bartlett testi ile gruplar / genotipleri içinde varyans homojenliği doğrulayın.
  2. Zaman Bartlett testi sonuçlarına bağlı olarak eşit veya eşitsiz varyansları varsayarak bir yönsüz Student t-testi kullanılarak tek grup içindeki koku karşı su ile harcanan arasında cazibe ve kaçınma testinde, karşılaştırmalar yürütmek. Bonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile genotipler arasındaki su ile harcanan zaman çıkarılır kokuları ile harcanan süreleri karşılaştırın.
  3. Duyarlılık testinde Wate ile harcanan zaman çıkarılır koku ile harcanan zaman karşılaştırmalar analizBonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile idrar belirli bir seyreltilerde gruplar arasında r. Bonferroni post-hoc testi ile tekrarlı 2-Yönlü ANOVA büyüyen koku konsantrasyonları gruplar arasında duyarlılık karşılaştırın.
  4. Cazibe ve kaçınma testinde genotipleri ve tedaviler arasındaki etkileşim Bonferroni post-hoc testi ile 2 yollu ANOVA ile incelenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

algı testi 2-MB asit fıstık ezmesi ve kaçınma için cazibe ölçer. Farelerin üç grup test edilir ve su ile karşılaştırıldığında "koku çevre" harcanan zaman ölçülür. Su (t 8 = 2.52, p <0.05) ile karşılaştırıldığında tercih testte, kontrol grubu ve bir koku önemli tercih gösterir. Öte yandan, B grubu fıstık ezmesi önemli cazibe görünmüyor ve su (t 6 = 3.22, p <0.05) daha fazla zaman harcıyor. Böylece, kontrol grubu A (F 1,7 = 26,39, p <0.005) farklı davranır. Buna ek olarak, grup C ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kokulara karşı algısını, kokulara, su ve duyarlılık karşısında kokular arasındaki ayrım: Bu protokol önerilen testler farelerde doğuştan koku davranış farklı yönlerini değerlendirmek için izin verir. Bu protokol daha önce 15 gösterilen tercih ve kaçınma ölçeğine göre herhangi bir koku uygulanabilir. Protokol keşif faaliyeti dayalı yana fareler kendi hareketini etkileyecek ve koku keşif engel olabilir herhangi bir motor bozukluğu ya da kaygı görüntü yok önemlidir. tarif edilen testler, ancak bunlar, yetişkin k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Alzheimer hastalığı araştırmalarını desteklemek için İsviçre Ulusal Vakfı (31_138429) ve Synapsis Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fare kafesiItalplast (İtalya)1144B36 cm uzunluk x 20,5 cm genişlik x 13,5 cm yükseklik
Yontma ahşap yatak takımıAbedd (Avusturya)LTE E-0013 cm yüksekliğinde
Fıstık ezmesiMigros (İsviçre)NA1:10
2-MetilbütirikSigma Aldrich (İsviçre)W269514
Aynı fare suşunun verimli dişilerinden elde edilen saf dişi idrarıNANA Seyreltme serisi
KameraOlympus (ABD)Camedia C-8080MOV dosyaları
Java için Quicktime (Windows)Apple (ABD)MOVdosyalarını görselleştirmek için NA video eklentisi
Windows için ImageJNIH (ABD)NAVideo İşleme/Analiz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doty, R. L., Kamath, V. The influences of age on olfaction: a review. Cognitive Science. 5, 20(2014).
  2. Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).
  3. Moberg, P. J., et al. Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review. Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).
  4. Kovács, T. Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders. Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).
  5. Barrios, F. A., et al. Olfaction and neurodegeneration in HD. Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).
  6. Doty, R. L. Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders. Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).
  7. Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function. Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).
  8. Devanand, D. p, et al. Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up. American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).
  9. Conti, M. Z., et al. Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease. Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).
  10. Keller, A., Vosshall, L. B. Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception. Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).
  11. Brai, E., et al. Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour. European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).
  12. Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice. Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).
  13. Alonso, M., et al. Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).
  14. Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice. Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).
  15. Kobayakawa, K., et al. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).
  16. Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse. Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).
  17. Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice. Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).
  18. Page, D. T., et al. Computerized assessment of social approach behavior in mouse. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48(2009).
  19. Nyfeler, Y., et al. Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal. Embo J. 24 (19), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386" 3504-3515 (2005).
  20. Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. Properties and mechanisms of olfactory learning and memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
  21. Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179 383-407 (2012).
  22. Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  23. Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Olfactory TestingMouse BehaviorImageJ AnalysisOdor PreferenceOdor AvoidanceSensitivity TestComputer assisted AnalysisVideo RecordingHabituation ProtocolUrine Dilution

Related Articles