Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki
Bu makalede
Özet
Özet
Karmaşık biyolojik örneklerdeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini, çok çeşitli araştırma ve klinik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, seçilmiş reaksiyon izleme (SRM) kütle spektrometresi (MS) kullanılarak kantitatif tahlillerin geliştirilmesi ve uygulanması için adım adım talimatlar sağlar. İlk olarak, olası kuantotipik hedef peptitler çok sayıda kritere göre tanımlanır. Bu, proteotipik peptitlerin tanımlanmasını, posttranslasyonel modifikasyon bölgelerinden kaçınılmasını ve hedef peptidin hedef proteine benzersizliğinin analiz edilmesini içerir. Daha sonra, ham harici peptit standartları sentezlenir ve SRM tahlilleri geliştirmek için kullanılır ve elde edilen tahliller, biyolojik numunelerin kalitatif analizlerini gerçekleştirmek için kullanılır. Son olarak, saflaştırılmış, niceliklendirilmiş, ağır izotop etiketli iç peptit standartları hazırlanır ve izotop seyreltme serisi SRM testlerini gerçekleştirmek için kullanılır. Elde edilen tüm MS verilerinin analizi sunulmaktadır. Bu protokol, RAW 264.7 hücreleri (bir fare monosit/makrofaj hücre hattı) içindeki kemotaksis sinyal yolunun proteinlerinin mutlak bolluğunu doğru bir şekilde test etmek için kullanıldı. Gi2'nin (heterotrimerik bir G-proteini α-alt birimi) miktar tayini ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Giriş
Kütle spektrometrisi (MS) kullanmak proteomik deneyler hedefli olmayan (av tüfeği) veya hedeflenen yöntemleri ya kullanmak için dizayn edilebilir. Keşif proteomik genellikle geleneksel veri bağımlı toplama modunu kullanarak, ya da (örneğin, MS E, SWATH) son zamanlarda geliştirilen veri bağımsız tekniklerden birini 1,2 kullanarak, ya aşağıdan yukarıya av tüfeği MS dayanır. Shotgun proteomik yüksek verimli peptit tanımlama ve nispi ölçümü için güçlü bir araçtır, ama mutlak ölçümü için veya proteinlerin küçük tanımlanan setler (~ onlarca) hedefleme için genellikle uygun değildir. En sık hedeflenen proteomik için kullanılan MS yöntemi neden....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu yöntem, daha önce 56 tarif edilmiştir.
1. Peptid hedef seçimi
- Hedef proteinlerin bir listesini derlemek ve biyolojik örnekler arasında normalleştirme için konum idaresi proteinlerinin az sayıda içerir ve aynı zamanda bir iç protein standardı (örneğin ateşböceği lusiferaz) içerir. Böyle Protein Sindirim Simülatörü 29,30 gibi bir yazılım aracı kullanarak silico triptik peptidler içine hedef proteinleri sindirmek.
- Peptidler tam triptik ve hiçbir eksik tripsin bölünme siteleri içerdiğini gerektir. Potansiyel eksik tripsin sindirimi 31 önlemek için komşu tripsin bö....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
sinyal iletim yollarının tahmini hesaplama modellerinin geliştirilmesi sistem biyolojisi 53 temel hedeflerinden biridir. Ne yazık ki, hatta yoğun çalışılan ve yüksek klinik öneme sahip olan sinyal yolları için, bu nicel tedirginlikler cevaben yolu davranışlarını tahmin etmek için genellikle hala mümkün değildir (örn bu MAPK / ERK yolu 54 için geçerlidir). Son zamanlarda, bir soruşturma yolunun 56 sinyal fare makrofaj kemotaksisini çalışmak için hedeflenen proteomik, transkriptom.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mutlak Protein ölçümü bu biyobelirteç doğrulama ve sinyal iletim yolu modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir çok farklı aralık için gereklidir. Son zamanlarda, LC-SRM kullanılarak hedeflenen proteomik peptid standart hazırlama, HPLC, qqq-MS ve LC-SRM veri analizi de dahil olmak üzere çok sayıda teknolojilere iyileştirmeler yararlanmıştır. Sonuç olarak, bağışıklık karşı güçlü bir alternatif haline gelmiştir. Immünoanalizler ve / veya uygun değildir multiplekslemesi için, son derece hassas ve yüksek verimli olabilir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Asetonitril (ACN), LC-MS sınıfı | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bikinkoninik asit) protein tahlil kiti | Fisher | 23235 | |
| Boncuk çırpma için boncuklar, zirkonya-silika, 0,1 mm | BioSpec Ürünleri | 11079101z | |
| Bestatin hidroklorür | Sigma | B8385-10MG | |
| Hücre kültürü DMEM (glikozlu, L-glutamin olmadan) | Lonza | 12-614F | |
| Hücre kültürü EDTA, 500 mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Hücre kültürü fetal sığır serumu (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Hücre kültürü L-glutamin | Sigma | G8540-25G | |
| Hücre kültürü fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Hücre kültürü Tripan Mavi canlılık lekesi, %0,4 w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Otomatik T4 hücre sayacı | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 tek kullanımlık sayma odaları | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formik asit, LC-MS sınıfı, ampuller | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemositometre, Neubauer ile geliştirilmiş, 0,1 mm derinlikte | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1 M, pH 7,2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hidroklorik asit, %37 w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| İyodoasetamid | Sigma | I1149-5G | |
| Lazer Tabanlı Mikropipet Çektirme | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC kaplı silika kılcal, 50 & m id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC flakon, otomatik numune alma cihazı, 12 mm x 32 mm polipropilen | SUN SRI | 200-268 | |
| LC flakon vidalı kapak, otomatik numune alma cihazı, ön yarık PTFE/silikon | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG'den | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH şeritleri colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop fosfataz inhibitör kokteyli | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Suları | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg kartuş | Sular | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, ekstraksiyon manifoldu, 20 pozisyon | Sular | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, düz yüzeyli kauçuk ampul | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı | Fisher | SPD111V | |
| Trifloroasetik asit (TFA), LC-MS sınıfı | Fisher | A116-50 | |
| Tripsin, sıralama sınıfı, modifiye | Promega | V5113 | |
| Tüp Mikronik tüpler için decapper | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tüpler, 2 ml mikrosantrifüj, o-ring vidalı kapak, steril | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Üre | Sigma | U0631-500g | |
| Su, LC-MS sınıfı | Fisher | W6-1 |
Kaynaklar
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
