Bu yazının amacı, büyük ölçüde akciğer kanseri ya da diğer patolojiler ile kurulum ve fare akciğerlerin analizine yardımcı olacak basit yöntemler tarif etmektir. Biz sadece ve güvenilir akciğer instilasyonlar, fiksasyon ve akciğer hacim ölçümleri yürütmek için 3 protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Yaralanmasına veya fareler öldürmeden doğrudan akciğere canlı ajanlar, hücreleri veya kimyasal aşılamak yetenek akciğer kanser araştırmalarında önemli bir araçtır. Solunum fonksiyon ölçümleri için fareler entübe nasıl gösteren yayınlanmış bir dizi yöntem olmasına rağmen, hiçbiri farelerin büyük kohortlarda hızlı trakeal damlatma potansiyel sorunsuz vardır. Bu yazıda, basit ve hızlı bir yöntem etkin bir biçimde bu tür instilasyonları yürütmek için bir müfettiş sağlayan tarif edilmektedir. Yöntem, herhangi bir özel alet veya aydınlatma gerektirmez ve çok az uygulama ile öğrenilebilir. Bu, bir fare anestezi trakea görselleştirmek için boyun küçük bir kesi yapıyor ve daha sonra doğrudan bir intravenöz kateter takmadan içerir. Ufak bir kesik hızlı bir doku yapışkanı ile kapatılır ve farenin iyileşmelerine izin verilir. Yetenekli bir öğrenci ya da teknisyen 2 dk / fare ortalama hızında instilasyonları yapabilirsiniz. T kezKanser kurulduğunda da akciğerlere kantitatif histolojik analiz için bir ihtiyaç sık sık vardır. Geleneksel fiksasyon sırasında akciğer enflasyonu standardize etmek zahmet etmeyin, genellikle patolog ve analizler genellikle oldukça öznel olabilir bir puanlama sistemine dayanmaktadır. Bu bazen bir akciğer tümörü büyüklüğü brüt tahminler için yeterli yeterli olabilirken, akciğer yapısı veya hücrelerin herhangi bir uygun stereolojik miktar tekrarlanabilir tespit prosedürü ve sonraki akciğer hacmi ölçümünü gerektirir. İşte biz de baskı altında akciğerleri sabitleme ve daha sonra doğru sabit akciğer hacmini ölçmek için basit, güvenilir prosedürler açıklanmaktadır. Tek şart, 1 mg-300 g aralığında doğru olan bir laboratuar dengedir. Böylece burada sunulan prosedürleri büyük ölçüde farelerde akciğer kanserlerini oluşturmak tedavi ve analiz etme yeteneğini geliştirmek olabilir.
Giriş
Bir takım nedenlerden, akciğer kanseri yaygın farede çalışılmamıştır. Bunun bir nedeni, akciğere erişim in vivo olarak çok zordur ve sabit akciğer kantitatif analiz genel olarak yapılmaz olmasıdır. Bu yazıda anlatılan yöntemler bu durumu düzeltmek için tasarlanmıştır. Hedefler burada büyük akciğer kanseri ya da diğer patolojiler ile kurulum ve fare akciğerlerin analizine yardımcı olacak basit yöntemler tarif vardır. Bu yaklaşımlardan hiç biri bütünüyle yeni olmakla birlikte, burada tarif edildiği gibi basitleştirilmiş biçimde tek başına yöntemlerle bir araya sunulmamıştır.
Öncelikle uzunlamasına çalışmalarda bireysel farelerde tekrar akciğer fonksiyonunu veya bronkoalveoler lavaj yapmanın amacıyla fare akciğer entübasyon için yöntemler tarif etmişlerdir el yazması bir dizi olmuştur. Orijinal kağıt beri, mous farklı yaklaşımlar tarif var diğer bazı kağıtlar olmuşture entübasyon 1 -9. Bu yöntemlerin tümü başarıyla kullanılabilir olsa da, genellikle önemli bir eğitim gerektirir ve bir nontrivial başarısızlık oranı olmadan sık sık değildir. Buna ek olarak, akciğer fonksiyon ölçümleri gerçekleştirmek amacıyla, kanül herhangi bir hava kaçağı olmaması için yeterince sıkı bir şekilde uyacak trakea gerekmektedir. Ancak, entübasyon başka pratik kullanım akciğere doğrudan belirli maddeler (kanser hücrelerini ya da diğer hakaret) ya da tedavi edici ilaçlar teslim etmektir. Böyle bir prosedür sıkı uydurma kanül ne de herhangi bir gelişmiş solunum fonksiyon ekipman gerektirmez. Burada gösterilen bu yöntemin yeni özelliği yemek borusu giren kanülün herhangi imkanı olmadan entübasyon izin veren küçük bir cerrahi prosedür gerektirir. Bu basit yaklaşım, nispeten daha az eğitim veya deneyime sahip başarılı entübasyon sağlar. En çok 30 fareler / saat sıfıra yaklaşan bir başarısızlık oranı ile bu yaklaşımı kullanılarak tedavi edilebilir.
T kezO fareler yaralı ya da kanserli akciğerler sonra histolojik ve patolojik analiz için kaldırılabilir, kurban edilecek hazırız. Ancak, düzgün diğer akciğerler ile karşılaştırıldığında herhangi bir histolojik değişkenleri ölçmek için, bu tespit prosedürleri standardize ve düzgün bir şekilde monte akciğer hacmini 10 ölçmek esastır. Bu yazıda ayrıntılı olarak standardize tespit usullerinin yanı sıra sabit akciğer hacmini ölçmek için bir yol sağlayan basit yordamlar açıklanır. Böyle bir hacim tespiti olmadan, sadece göreli yoğunlukları 10 ölçülebilir çünkü hacim, histoloji miktarının önemli bir ölçümdür. Akciğer hacmi bilinmektedir Ancak, bir kez hücreler ve akciğerde diğer yapısal ölçümler mutlak ölçüm daha sonra ölçülebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol 20-35 g farelerde iyi çalışan bir sistemi tarif eder. Yöntem basitçe kateter boyutunu değiştirerek büyük veya daha küçük farelere adapte olabilir. Tüm hayvan protokolleri Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Akciğer damlatma
- Entübasyon için kullanılacak ticari 1-inç uzunluğunda 20 g intravenöz kanül Select.
- El ile Şekil 1 'de gösterildiği gibi, uç bir hafif bir eğrilik oluşturmak için büküm kateter ucunu değiştirin.
- IP ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (15 mg / kg) karışımı ile fare enjekte anestezisi, ve refleks hareketinin olmaması ile anestezi teyit etmektedir. Hemen anestezi sonrası gözlerde veteriner merhem sürün. Anestezi gözleri veteriner merhem uygulamak ve cerrahi sonrası ve aşılama analjezi için Karprofen (5-10 mg / kg SQ) vermek hemen sonra.
- Mou yerleştirineğimli bir platform üzerinde se yatar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, ameliyat dikiş ipliği döngüler ile büyük bir ofis birleştirici çok iyi işler bantlanmış.
- Boyun ve temiz ventral bölümünü Tıraş ve% 70 alkol ile boyun alanı dezenfekte edin. Yeni latex ve pudrayla eldivenlerle,% 70 alkol ile dezenfekte cerrahi aletler kullanmayın.
- Kullanımı keskin makas yaklaşık 12 mm alt kesici altında boyun küçük bir cerrahi kesi yapmak.
- Bir forseps yavaşça boyun cildi çekme ile trakea ventral duvarı görülebilir kaudale kadar.
- Yavaşça dilini geri çekin ve fare ventral yüzeyine doğru eğik bükük ucu ile kanül yerleştirin. 1.4 gibi boyun cilt üzerinde nazikçe çekin ve trakea içine kanül yerleştirin.
NOT: Küçük bir uygulama ile, kateter trakea aşağı hareket görünür olacaktır. O yemek borusu giderse, o zaman kateterin hareketinin hiçbir görsel nişan olacak. Hiçbir kesiTrakea yapılır. - Kateter boyun trakea görüldüğü sonra, güvenilir olmak o yaklaşık 5 mm ileri ses telleri geçti ama yine de karinanın üstünde.
- Bir jel yükleme pipet ile kateter içinden enjekte edilerek sıvının 50 ul kadar aşılamak hazırlayın. Diş hub ucu yerleştirin, ancak farenin nefes ucu senkron sıvı hareketini gözlemlemek için dikkatle göz enjekte etmeden önce. Ardından instillate enjekte.
- 1 ml şırınga ile hemen akciğerlerde sıvı derin dağıtma yardımcı olmak için kateter yoluyla akciğerlere hava 0,6 ml nispeten hızlı enflasyonu yapın. Kanül kaldırın.
- Kanül kaldırın.
- Vetbond için paket eki talimatlarına uygun olarak, küçük bir cerrahi yara kapatma siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar kullanın. Bireysel kafeslerde fareler yerleştirin ve uyanmak kadar görsel onları izlemek ve discomf herhangi bir gösterge olmadan normal davranmayaort.
2. Akciğer Fixation
Not: tüm deney prosedürleri bir farede yapılır, akciğerler formaldehid (veya arzu edilen herhangi fiksatif) ile sabitlenmesi ile histolojik işlem için hazır hale edilebilir.
- Bir IACUC kabul edilebilir prosedüre fare Kurban. Videoda gösterilen temsili fare, bir anestezi fare servikal dislokasyon kullanılır.
- Cerrahi, trakea ventral tarafında ortaya küçük bir kesim yaparak ve trakea içine 18 G saplama iğne ucu takarak, ve iplik ile bağlayarak (zaten bitmiş değilse) bir trakeostomi gerçekleştirin.
- Dikkatle, orta hat kesi ile göğüs kafesi açmak için diyaframı kesip, ve akciğerler açığa lateral göğüs duvarları kaldırmak.
- Formaldehit içeren bir halka standında bir rezervuar iğnenin diş ucunu. Şekil 3 Bkz.
- 25 cm MM'nin seviyesinden formaldehit üst yüzeyini ayarlamase. Şekil 3 Bkz. Sonraki bir vana sonuna dışarı akışkan çalıştırarak tespit tüp hava olduğundan emin olun. Rezervuar tüp trakea kanül diş ucunu. Formaldehit ile akciğerlerini şişirmek için musluğunu açın. En az 20 dakika boyunca basınç altında akciğerlere bırakın.
- Formaldehit ile akciğerlerini şişirmek için musluğunu açın. En az 20 dakika boyunca basınç altında akciğerlere bırakın.
- Sonra, saplama iğnenin ucunun ötesine trakea kapalı kravat. Bu uncannulated trakea daha açığa iğne geri yavaşça çekin yardımcı olabilir. Güvenli bağlı olduğunda, stopcock çıkarın.
- Dikkatle akciğerleri teşrih.
- Gecede formaldehit içinde akciğerleri yerleştirin. Daha uzun zaman ince ve bazı lekeler ya da prosedürler belirli süreleri belirtebilirsiniz. Ayrıca bu gibi z-düzeltme başka bir sıvı sabitleyici, uygulaması ve daldırma için kullanılabilir.
- Daha fazla işlenmeden önce histolojik ölçmekBir sonraki açıklandığı gibi sabit akciğer hacmi.
Sabit Akciğer Hacim 3. Ölçüm
- . Şekil 4'te gösterildiği gibi Archimedes prensibi kullanılarak akciğer hacmini ölçmek formaldehit sabit akciğer çıkarın ve kalp ve herhangi bir diğer non-akciğer dokusu disseke.
- Tamamen su altında akciğerleri tutmak için kullanılan bir önce inşa basit ev yapımı tel destek aygıtı kullanın.
NOT: Bu cihaz kullanılıyor hangisi denge ile uyumlu hale gerekmektedir. Şekil 5'te gösterilen tipik bir cihaz, plastik pipet ve ince (20 G) telden yapılır. Bu sistem videoda kullanılan denge ile iyi çalışır, ancak kolayca en Laboratuvar teraziler adapte olabilir. - Su içinde bir yerde destekleyici kafes denge ve dara su ≈200 ml beher yerleştirin. . Şekil 6'ya bakın metal kafes çıkarın; Su yüzeyinde akciğer koyun ve su altında basınkafesi ile.
- Denge üzerinde ağırlığını kaydedin. Bu sayı, su yerinden hacmini yansıtır ve dolayısıyla akciğer hacminin doğrudan bir ölçüsüdür. Emin akciğer veya dikiş veya kenarlarına veya beher alt değmeyecek tel kafes herhangi bir bölümünü yapmak için dikkatli olun.
- Doğruluk için, bu ölçümü tekrarlayın. Bir doku üzerinde su akciğer ve kurutun. Yerinde tekrar kafes ile beher dara ve akciğer hacim ölçümü tekrarlayın. İki hacim ölçümleri daha sonra ortalaması alınmalıdır.
Not: akciğerler fazla yaklaşık bir hafta için formalin içerisinde kalır, akciğerlerdeki hava sıvı içinde çözülmektedir. Bu durumda, akciğer batar, bu nedenle batık akciğer tutmak için Şekil 5'te olduğu gibi herhangi bir cihazı kullanmak için artık gerekli değildir. Bu durumda hacmi, Şekil 4 'de gösterildiği gibi tamamen daldırılmış kadar ameliyat dikiş ipliği diziden biri ile akciğer tutarak, sadece ile ölçülebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Prosedür, tek başına herhangi genel sonuçlara yol etmez ilk protokolde tarif eder. Bu, yalnızca doğrudan nefes borusu içine maddeleri aşılamak için çok güvenilir bir araç tarif eder. 7 trypan blue Burada anlatılan yöntemle damlatıldı olan bir akciğer bir örneğini göstermektedir. Trakea veya farelere 11,12 doğrudan verilen diğer boyalar ya da izleyiciler ile görülmüştür ne benzer boya yaygın dağıtım vardır. Biz de sırasıyla yaygın fibrozis veya amfizem, sonuçlanan akciğer, içi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada anlatılan prosedürler çeşitli avantajları vardır. İlk Gerekli ekipman basit ve ucuzdur. İkincisi, entübasyon hızla birkaç hatalar yapılabilir. Üçüncüsü, sabit akciğer hacmi sabit basınçta akciğerlere düzeltmek ve daha sonra ölçebilme akciğer 10 yapıların veya hücrelerin düzgün ölçümü sağlar.
Entübasyon için bir olası olumsuz küçük cerrahidir. Bu 2. instillation gerekiyorsa prosedürü tekrarlayın yeteneğini sınırlayabilir. Ancak, yapıştırıcı dikkatli cerrahi ve uyg...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Laboratuvar | Terazisi Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | 1-300 g aralığına sahip olan diğer teraziler kullanılabilir |
| 20 g Luer intravenöz kateter | Insylte | Diğer birkaç olası satıcı, ör., Jelco Optiva | |
| 500 ml laboratuvar şişesi | Çeşitli | Diğer birkaç olası satıcı |
Kaynaklar
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601(2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549(2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
