Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Özet

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Özet

Saha ve laboratuvar çalışmaları mikrobiyal alt popülasyonlar morfolojik ve fizyolojik parametrelerin yüksek heterojenite görüntülemek için gösterilmiştir. Mikropların hücre bölünmesi ve metabolik faaliyetler azalır sayede atıl durumda, var gibi bir mikrobiyal hücre gerçek zamanlı durumunu belirlemek, canlı ya da ölü kategorilerde ötesine geçer. Genel nüfus canlılığı belirlemeye yardımcı olmak için hızlı ve doğru bir yöntem moleküler problar ile tespit ve mikropların ölçümü ihtiyacını, sitometri (FCM) akış sağlar Verilen. Membran bütünlüğünü algılamak için bir model siyanobakterilerin olarak Microcystis aeruginosa SYTOX Yeşil ve SYTOX Turuncu kullanarak, tek bir hücre ölümlerinin hızla endikasyon için bir transfer yöntemi geliştirmek. Actio karşılaştırılabilir moduna sahip benzer bir eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile diğer ürünlerin olmasına rağmen, bu derginin içinde kullanılan moleküler problar (sırasıyla yeşil ve turuncu bir nükleik asit problarının anılacaktırön probları belirtilen n, biz özellikle) başvurun. Moleküler problar kullanılarak protokoller konsantrasyon ve inkübasyon süreleri esas olarak farklı türler arasında değişiklik göstermektedir. M.aeruginosa yola Bu protokol izlenerek, yeşil bir nükleik asit probu 30 dakika kuluçkalama ve 10 dakika sonra 1 uM turuncu bir nükleik asit probu sonra 0,5 uM konsantrasyonlarında optimize edilmiştir. Membran hasarı olan hücrelerin raporlama altında yol açtı belirtilen optimum az Her iki probları konsantrasyonlarda. Bunun aksine, her iki sondalarda 5 uM konsantrasyonları ve daha yüksek 'canlı' hücreler 'canlı olmayan hücreli bir sayı üzerindeki gösterimine neden hedef floresan ürettiği ve böylece spesifik olmayan lekelemeye bir tür, sergiledi. Kontrol nesil uygunluğu tartışma konusu olmaya devam rağmen pozitif kontroller (ısı ile öldürülmüş), sınanabilir ölü biyokütle sağladı. Yeşil ve turuncu nükleik asit probları biz de optimize etmek için adımlar mantıklı bir dizisini gösterereketkin bir siyanobakteriyel fizyolojik durumunu analiz etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmak için nasıl monstrate.

Giriş

Hücre sürekli fizyolojik parametrelerini değiştirerek ve işlevini değiştirerek çevreye yanıt karmaşık bir sistemdir. ^{3 -} izogenik mikrobiyal nüfus doğada ve laboratuar hem de nüfus dinamikleri bile nispeten sabit çevresel koşullar altında meydana gelen ^1, alt popülasyonlar gelişimi etkilenir. Doğal mikrobik topluluk değişkenliği nedeniyle çevre koşullarının oldukça değişken doğası ortaya çıkmaktadır. Bunlar bazen stokastik süreçler sonradan nüfus ortalamasına çok farklı subpopülasyonunun üretirler. Son kanıtlar bu fizyolojik alt popülasyonlar çevresel koşullara farklı tepki ve dramatik etkiler ve genel nüfus ^3,4 etkileyen s....

Protokol

Moleküler Probe ve Akış Sitometre 1. hazırlanması

1. Ultra saf süzüldü _H2O gerekli konsantrasyonlarda alikuota dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mM çözelti olarak tedarik edilir, nükleik asit prob, ana solüsyonları seyreltin
2. 25 ^{o C} kadar kullanım - -5 ^{o C} arasındaki karanlık koşullarda nükleik asit probları saklayın.
3. Akış sitometresi ve yük yazılım paketi açın (FCM özellikleri için Malzeme / Ekipman tabloya bakınız).
4. Numune enjeksiyon probu (SIP) boş bir hemoliz tüpü (12 x 75 mm) koyun, FCM temizleme işlemini başlatmak için geri floş sonra unclog ve tıklayın.
   NOT: SIP için b....

Sonuçlar

Üslü fazda bir M.aeruginosa toplu kültüründen İleri doğru ışık saçılımı (FSC) ve yan ışık dağıtma (SSC) çıkışları, sırasıyla, hücre boyutu (çapı) ve iç boyu bilgileri (Şekil 1A) içerir. FSC M.aeruginosa olmak için çok büyük ve / veya küçük olan hücreleri ayırabilir. Bu ayrımcılık veya yolluk bir FSC çıkışı (Şekil 1C) belli noktaları arasındaki rafine verilerle yapılabilir. Kırmızı bir ışık kaynağı tarafından uyarıldığı zaman fikosiyanin.......

Tartışma

^{15,19,22,23 -} moleküler problar kullanılarak yayın artan sayıları, güvenilir ve bilgilendirici veriler ^5,6,8 elde edilebileceğini gösterir. Henüz itibarıyla aynı konsantrasyon ve kuluçkalama süresi ^6,10 Tüm türler arasında etkili olabilir hücre canlılığı için mükemmel bir leke yoktur. Değişmiş floresan emisyonları ile prob hatta aynı tip doğru konsantrasyon ve inkübasyon süresi (Tablo 1 ve 3) kurmak için bir gereksinim olduğunu göstermektedir. Bu protokolü kul.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Siyanobakteri	Ortamı Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Tatlı su konsantre çözeltisi (x50 seyreltme)
Dekontaminasyon Sıvısı	BD Biosciences	653155	Çıkışlar hızlı veya 2 & mikro akış hızında saniyede 12'den fazla olay olduğunda 66 dakika boyunca çalıştırın; l/dk.  Ardından 2 dakika kılıf H2O.
Akış Sitometresi	BD Biosciences	istek üzerine	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	DMSO'da nükleik asit boyası ve 5 mM çözeltisi
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nükleik asit boyası ve DMSO'da 5 mM çözeltisi