Yöntem makalesi

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme Microcystis aeruginosa) Akım Sitometri Kullanımı

DOI:

10.3791/53036

⸱

29 Ocak 2016

 ,  , 
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saha ve laboratuvar çalışmaları mikrobiyal alt popülasyonlar morfolojik ve fizyolojik parametrelerin yüksek heterojenite görüntülemek için gösterilmiştir. Mikropların hücre bölünmesi ve metabolik faaliyetler azalır sayede atıl durumda, var gibi bir mikrobiyal hücre gerçek zamanlı durumunu belirlemek, canlı ya da ölü kategorilerde ötesine geçer. Genel nüfus canlılığı belirlemeye yardımcı olmak için hızlı ve doğru bir yöntem moleküler problar ile tespit ve mikropların ölçümü ihtiyacını, sitometri (FCM) akış sağlar Verilen. Membran bütünlüğünü algılamak için bir model siyanobakterilerin olarak Microcystis aeruginosa SYTOX Yeşil ve SYTOX Turuncu kullanarak, tek bir hücre ölümlerinin hızla endikasyon için bir transfer yöntemi geliştirmek. Actio karşılaştırılabilir moduna sahip benzer bir eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile diğer ürünlerin olmasına rağmen, bu derginin içinde kullanılan moleküler problar (sırasıyla yeşil ve turuncu bir nükleik asit problarının anılacaktırön probları belirtilen n, biz özellikle) başvurun. Moleküler problar kullanılarak protokoller konsantrasyon ve inkübasyon süreleri esas olarak farklı türler arasında değişiklik göstermektedir. M.aeruginosa yola Bu protokol izlenerek, yeşil bir nükleik asit probu 30 dakika kuluçkalama ve 10 dakika sonra 1 uM turuncu bir nükleik asit probu sonra 0,5 uM konsantrasyonlarında optimize edilmiştir. Membran hasarı olan hücrelerin raporlama altında yol açtı belirtilen optimum az Her iki probları konsantrasyonlarda. Bunun aksine, her iki sondalarda 5 uM konsantrasyonları ve daha yüksek 'canlı' hücreler 'canlı olmayan hücreli bir sayı üzerindeki gösterimine neden hedef floresan ürettiği ve böylece spesifik olmayan lekelemeye bir tür, sergiledi. Kontrol nesil uygunluğu tartışma konusu olmaya devam rağmen pozitif kontroller (ısı ile öldürülmüş), sınanabilir ölü biyokütle sağladı. Yeşil ve turuncu nükleik asit probları biz de optimize etmek için adımlar mantıklı bir dizisini gösterereketkin bir siyanobakteriyel fizyolojik durumunu analiz etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmak için nasıl monstrate.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre sürekli fizyolojik parametrelerini değiştirerek ve işlevini değiştirerek çevreye yanıt karmaşık bir sistemdir. 3 - izogenik mikrobiyal nüfus doğada ve laboratuar hem de nüfus dinamikleri bile nispeten sabit çevresel koşullar altında meydana gelen 1, alt popülasyonlar gelişimi etkilenir. Doğal mikrobik topluluk değişkenliği nedeniyle çevre koşullarının oldukça değişken doğası ortaya çıkmaktadır. Bunlar bazen stokastik süreçler sonradan nüfus ortalamasına çok farklı subpopülasyonunun üretirler. Son kanıtlar bu fizyolojik alt popülasyonlar çevresel koşullara farklı tepki ve dramatik etkiler ve genel nüfus 3,4 etkileyen sinyal bileşikleri veya inhibitörleri üretebilir ortaya koymuştur.

Bir nüfus içinde heterojenliği tanımlamak için bir yöntem oluşturulması un anahtarıdırÇeşitli ortamlarda mikroplar ekolojisini ların önemli ve heterocysts gibi özel hücrelerin geliştirilmesi, çevresel dalgalanmalara tepki olarak morfolojik heterojenlik gösterir ağır etkiler insan su güvenliği konusunda. Türler gibi Anabaena gibi toksik Microcystis gibi, sıkıntı siyanobakterilerin bilgi oluştururken gereklidir ve akinetes 2. Buna karşılık, Microcystis hücreleri stres yanıtı sırasında belirgin morfolojik heterojenliğini görüntüler yok. Canlı ve cansız hücreler arasında ayrımcılık fizyolojik farklılaşmanın en önemli yönüdür ve mikrobiyal populasyon dinamiği daha iyi anlaşılmasını verir. Ancak, bakteriyel canlılığı kendisinin kavramsal sorunu zor ve kötü 1,5,6 karakterize kalır.

Flow sitometri (FCM) tek tek hücrelerin analiz güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Tek hücreli fizyo anlayışı artırmak içinFCM aracılığıyla logy moleküler problar metabolik ve biyokimyasal süreçlerin 7 bir dizi ayırmak için kullanılmıştır. Bu hücresel ve nüfus düzeyinde türlerin artan bilgiye açtı ve sırayla su kaynakları yönetimi 8,9 yardımcı oldu. Bununla birlikte, organizmalar, moleküler prob tasarımı ve protokolü uygulaması 6,10,11 bir dizi yol açan hücre duvarları ve zarlarına gözenekler ve pompalar, moleküler prob alımı ve efflux bakımından farklılık gösterir. Ticari ve araştırma amaçlı kullanılabilir moleküler problar genellikle çok farklı hücre tipine uygulanabilir genel bir protokol ile temin edilmektedir. Bir başka 6'ya bir hücre tipi için geliştirilen protokoller transferinde çok dikkatli olmalı, etkin kullanımdan önce moleküler problar optimize etmek önemli bir görev bu nedenle.

Yeşil ve turuncu bir nükleik asit probları en az bir baz ile çift ve tek sarmallı nükleik asit hem bağlama seçinivity ve hücrelerin plazma zarı bütünlüğünün değerlendirmek için kullanılır. Yeşil bir nükleik asit probu, hücre canlılığının bir göstergesi olarak hareket edebilir örneğin propidium iodide bazlı bileşikler 12 gibi diğer moleküler problar, kıyasla belirgin bir şekilde daha iyi hücre etiketleme floresan sinyalini alır. Terimi hücre canlılığı, 'burada, DNA parçalanma, plazma zan bütünlüğü kaybı sonra meydana varsayar. Nükleik asit probları üç pozitif ücretleri ile simetrik olmayan siyanin boyalar ve hem de ökaryotik ve prokaryotik 11,13 14,15 organizmalarda karakterize konsantrasyonlarda altında intakt membranlı hücrelere giremez. Nükleik asitlerin bir nükleik asit sondasının bağlanması, bunların zar bütünlüğü tehlikeye sahip hücrelerde endojen sinyallerden flüoresans emisyonlarının a> 500 misline kadar artış ile sonuçlanabilir. Örneğin yeşil bir nükleik asit prob olarak moleküler problar tek hücre fizyolojisinin iyi bir göstergesi olabilir, ancak, bir ihtiyaç vardır tYalnız Microcystis deneylerde 0.5 uM 15 - - 0,1 mcM 30 dakika ve konsantrasyon aralıkları - 19 inkübasyon süreleri 7 dk arasında değiştiği gibi o, amaçlanan hedef organizmanın her prob optimize.

Burada yeşil sitometrik deneyleri ve (bugüne kadar siyanobakteriyel türler M.aeruginosa üzerinde test edilmemiştir) nispeten yeni turuncu nükleik asit probları optimize etmek bir protokol mevcut. Aşağıdaki gelişmiş metodoloji sonra diğer türlere aktarılır ve böylece mikropların anlayış ve ekolojik davranışları artırarak, diğer moleküler problar protokolleri optimize etmek için bir platform olarak kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküler Probe ve Akış Sitometre 1. hazırlanması

  1. Ultra saf süzüldü H2O gerekli konsantrasyonlarda alikuota dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mM çözelti olarak tedarik edilir, nükleik asit prob, ana solüsyonları seyreltin
  2. 25 o C kadar kullanım - -5 o C arasındaki karanlık koşullarda nükleik asit probları saklayın.
  3. Akış sitometresi ve yük yazılım paketi açın (FCM özellikleri için Malzeme / Ekipman tabloya bakınız).
  4. Numune enjeksiyon probu (SIP) boş bir hemoliz tüpü (12 x 75 mm) koyun, FCM temizleme işlemini başlatmak için geri floş sonra unclog ve tıklayın.
    NOT: SIP için bazı örnek aşamaları mikrosantrifüj tüpler dahil tüpler çeşitli barındırabilir. FCM tertibatında kullanılan moleküler prob seyreltici madde ve kılıf sıvısı analitik dereceli "tip 1" 0,22 um membran filtre kaynağı yer alıyor.
  5. Yeri15 dakika karıştırıldı ve hızlı bir akışkan hızına (veya> 66 | il / dakikalık bir akış oranı) - SIP, aşırı saf, süzüldü, H2O, 2 ml taze bir hemoliz tüpü 10 için bir zaman limiti belirlemek.
  6. Arka plan gürültüsünü azaltmak ve 'koşmak' tıklayın floresan ve ışık yayılımı kanallar hakkında eşikler koymak yeni bir veri hücresini seçin.
  7. Saniyede toplam etkinlik üretici firmaların tavsiyelerine altında değilse, o zaman oruç 2 dakika süreyle dekontaminasyon solüsyonu 2 ml örneği çalıştırmak ve daha sonra 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın.
    NOT: modelleri arasında değişebilir olarak, start-up protokolleri temizlik FCM için üreticilerin öneriler kontrol ediniz. Belirli eşikleri için test de bazı ekipman arttırmak veya optik dedektörler kaydedilen elektrik sinyali azalan photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) için gerilimler kazanımları uygulamak için izin verir FCM modeli ile uyumlu olması gerekir. Bu deney kullanılan FCM modeliment gerilim PMT sabit ve parçacıkları daha küçük 2.0 mm ve elektronik gürültü dışlamak için 80,000 ileri ışık yayılımı (FSC-H) bir eşiğini kullandı.

Kültürler ve İlk Hücre Sayımı 2. Hazırlık

  1. 120 o C'de 20 dakika boyunca 250 ml'lik bir cam kaba alg ortam (x50 konsantrasyonu), aşırı saf, süzüldü H2O ve 2 ml Otoklav 98 mi
  2. SIP kapsamında bir tüp içine, yüksek kararlı durum yoğunluğu yer örnek 2 ml M.aeruginosa (7806 PCC) bir ilk tarımı kaynaktan. Vorteks veya sonikasyon 20 herhangi bir koloni oluşumunu bölmekte ve ışık mikroskobu ile eşit dağılmış hücreleri onaylayın.
    NOT: Ultrasonik dalgalar aşırı maruz kalma hücre erimesi neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır. Böyle yan ışık yayılımı olarak çıkışlar (M.aeruginosa gibi türlerde bulunan gibi) sonication gaz veziküller daraltabilirsiniz beri (SSC-H) yoğunluk se daha olabilirnsitive.
  3. FCM yazılımı içinde, ileri ışık saçılım (FSC-H) verileri kaydetmek ve eksen üzerinde bir günlük ölçeğinde görüntülemek için "log" linkine tıklayarak arsa özelliklere yapılandırmak için bir histogram arsa seçin.
  4. Ayrı bir çıkış, böyle M.aeruginosa bulunan aksesuar fotosentetik pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12.5 nm) gibi doğal floresan kaydetmek için (ekseni log) Başka bir histogram seçin.
  5. Phycocyanin ve elde edilen floresan kaynaklanan emisyonları filtre bir dedektör heyecanlandırmak bir ışık kaynağı kullanın.
    NOT: fikosiyanin 600 nm üzerinde heyecanlı ve sadece kırmızı ışık kaynağı 21 ile tespit edilecektir ise fotosentetik pigment gibi klorofil olarak, yaygın olarak kullanılan 488 nm mavi lazer ile heyecanlı olabilir. Uyarma ışık kaynakları için akış sitometrelerinde üreticisi ve emisyon dedektörleri spektrumları, burada hem 488 nm ve 640 nm lazer ile kontrol ile birlikte kullanılmıştırBir 675 ± 12.5 nm optik filtre.
  6. Hedef organizmanın (10 mikron) ve nispeten yavaş akış hızı (/ dak 14 ul) çekirdek büyüklüğüne yakın yüksek çözünürlük seçme ayarları kayıt için.
    NOT: En iyi çözünürlük örnekleri için saniyede olayların öneri üreten göre çalıştırılmalıdır.
  7. Elde veri kapı dışarı ışık saçılımı ve / veya floresan sinyallerine bir eşik kullanmadan önce elektronik arka plan gürültüsü veya hücre numunesi enkaz neden olduğu.
  8. Yeni bir veri hücre seçin bir günlük ölçeğinde FSC-H ve SSC-H parametreleri ile bir yoğunluk arsa oluşturmak ve çalıştırmak tıklayın.
  9. Numune yoğunluğu aşırı olay oranı neden olursa, seyreltme adımlar doğruluk ve hassasiyetini arttırmak için alınabilir.
  10. Yoğunluk arsa üzerinde arka plan gürültü ya da enkaz (FSC <320000) tarafından üretilen düşük seviyeli dağılım sinyalleri, dışlamak için önceki histogram yazılım kapıları geçerlidir. Yüksek bağıl floresan Tersine kapısıfikosiyanin hücrelerinden gelen sinyaller ve sadece bu olayları (- 1950000 FL4, 56000) içerir.
  11. Ml başına kaç hücre çalışmak, kapı alanlarda kaydedilen hücre sayısını kullanın ve FCM geçti numunenin toplam hacmine bölerek.
    Not: Burada kullanılan FCM modeli örnek hacmi belirlenecek sağlayan bir mikroişlemci kontrollü peristaltik pompa sistemi vardır. Diğer FCM ekipman kalibre boncuk süspansiyonu veya toplam Numune hacmini doğrulamak H 2 O ağırlık / hacim farklılıkları bir hesaplama gerektirebilir.
  12. M.aeruginosa bir parti büyüme çevriminin (250,000 hücre / ml) başlatmak için taze olarak hazırlanmıştır ortama hücrelerin gerekli hacim.
    NOT: Türler yani bir toplu döngüsü yaşam döngüsü aşamaları belirlemek için önceden kaydedilmiş olmalıdır onların yerinde çevre parametreleri ve besin durumuna bağlı olarak büyüme oranlarında farklılık gösterir.

3. OptimMoleküler Probe Hücre Alımı ve zasyon

  1. M.aeruginosa kültür hasat yarım üslü fazda aşama 2'de hazırlanan bir "canlı" bir kontrol olarak kullanırlar.
    NOT: Düz bir üstel faza yüksek yoğunluklu kültüründen seyreltilmiş numuneler bir başlangıç ​​gecikme / indüksiyon fazından aşılanan kültürlerin karşılaştırıldığında, ölü hücre ciro yoluyla optimizasyon sonuçlarını etkileyebilir.
  2. 30 dakika 6,11,22 1 saat, paraformaldehid veya% 4 formaldehit 60 o C'de yöntemleri gibi% 70 etanol, ısıtma örnekleri kullanarak, bir "ölü" bir kontrol olarak, diğer yarısı hazırlayın. Numuneler mikroçevrede varyasyonları (örneğin., PH) kontrol edin.
    NOT: M.aeruginosa pozitif, ısı ile öldürülmüş, 'ölü' kontrol fikosiyanin sinyalleri onun azalması yoluyla 'canlı' örnek ayrılır. Diğer yöntemlerle mortalite uyaran aynı çıktıyı neden olmayabilir ve bir yerdedirtürlerde y.
  3. Farklı oranları kullanılarak karışık örnekleri kurmak 'canlı' ve 'ölü' örnekleri (örneğin,% 0,% 25,% 50,% 100).
  4. Vorteks veya sonikasyonla koloni oluşumunu bölmekte ve pH'ı kontrol edin.
  5. Kendi ilgili dedektör vasıtasıyla fikosiyanin sinyalleri kaydetmek için 488 nm yeşil floresan gelen kaydedebilirsiniz dedektörleri yanında lazer (FL1, 530 ± 15 nm) ve portakal (FL2, 585 ± 20 nm) nükleik asit probları ve 640 nm lazer seçin.
    Not: DNA ya bağlandığı zaman turuncu bir nükleik asit sondası 570 nm 547 nm ve emisyon maksimumlar bir eksitasyon dalga boyuna sahip iken, yeşil bir nükleik asit probu, 523 nm 504 nm ve emisyon maksimumlar yaklaşık flüoresan uyarma dalga boyuna sahiptir. Bir 488 nm argon iyon katı hal lazer hem moleküler problar uyarmak için kullanılabilir, ancak, (547 nm kadar) yeşil bir lazer daha yüksek bir turuncu bir floresan üretir.
  6. Başlangıç ​​noktası olarak tanıtmaküreticileri ile moleküler prob% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' kültüre konsantrasyonunu tavsiye ve karanlıkta inkübe edin.
  7. Yeni bir veri hücre seçin arka plan gürültüsünü (FSC-H 80000) azaltacaktır eşikleri ve tetikleyiciler ile SIP altına numuneyi yerleştirin.
  8. FSC-H ve SSC-H parametreleri ve üç histogramlar ile yoğunluk arsa oluşturun. Ilgili moleküler prob optik detektör kanal (FL1 veya 2), tek bir fikosiyanin emisyonlarını (FL4-H) ve bir log ölçeğinde için diğer FSC H, bütün tespit etmek için kullanılarak, bir histogram.
  9. Zaman noktalarında (1, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakika) bir sayıda, ayrı bir veri hücrelerinde kayıt kadar 60 dakika boyunca karanlıkta nükleik asit probları ile M.aeruginosa örnekleri inkübe edin.
    NOT: Belirli kimyasalların potansiyel reaksiyonlar için üretmektedir ile pH kontrol gibi parametreler ayarlarken (test nükleik asit için bir tampon fosfat veya tek değerlikli veya diva yüksek düzeyde içeremez sondalarödünç katyonları, DNA bağlanma azalacaktır gibi).
  10. İlgili floresan prob kanal histogram içine hücre boyutu organizmalar hedef - Bir yazılım kapısı sadece FSC-H histogram (1.500.000 320.000) dahil etmek uygulayın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan konsantrasyonlar arttırılması veya M.aeruginosa numune veya nükleik prob başlangıç ​​stok çözeltisi hacmi azaldığı biri ile değiştirilebilir 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 uM idi.
  11. Floresan prob kanalında en yüksek histogram tepe (- 1650000, turuncu FL2-H, 30.000 - Yeşil FL1-H, 240.000 165.000) başka herşey bir yazılım kapısı uygulamak ve daha sonra kapının o yoğunluk arsa içine pozitif prob floresan.
  12. Moleküler prob konsantrasyonları (örneğin x 0.1 x 10) ve / veya sıcaklık ve pH düzeyini gerekirse ayarlanması,% 100 "canlı",% 100 'ölü' ve tüm karışık kültür örnekleri ile 3.11 - Run 3.1 adımları tekrarlayın.
  13. nükleik aside ile boyanmış hücrelerin toplam yüzdesini bulmak için (yarım toplam FSC-H veya% 100 'ölü' kültüründen alınan) 'ölü' hücreleri orijinal hücre yoğunluğuna pozitif moleküler prob floresan sinyalleri sayısını karşılaştırın Problar.
  14. Non-spesifik boyama (bir Tek Yönlü Varyans Analizi veya Kruskal-Wallis tek yönlü analizi araçları kullanmak üretmeden hücre nükleik prob alımı en yüksek yüzdesi için en uygun protokol bulmak için her konsantrasyon içinde her süre için yapın, verileri) parametrik olmayan ise.

4. Moleküler Probe Floresan Ayrımcılık

  1. Intrinsik veya spesifik olmayan hücre boyama floresan girişim / örtüşme testi için 50% 'canlı' ve% 50 'ölü' karışık kültür verilerini seçin ve tüm kapıları kapalı alır.
  2. Sadece FSC-H histogram (320000 - 1500000) dahil etmek için bir yazılım kapısı uygulayın hedef için phycocyanin içine hücre boyutu organizmalarKanal histogram.
  3. Kapısı 'ölü' olarak etiketlenmiş düşük zirve ilavesi ile 'canlı' olarak en yüksek fikosiyanin zirve ve etiket.
  4. Ortalama dalga boylarını hem kayıt, 'canlı' ve ardından 'ölü' fikosiyanin (FL4) sinyalleri aynı anda birini kullanarak, ilgili moleküler prob floresans histogram kanalına başka bir kapı adımı gerçekleştirin.
    NOT: Bu deneyde mortalite başlatılması için mod bu protokol kapsamında açıkça fikosiyanin sinyallerini azaltır ısıl işlem, tarafından yapıldı. 'Ölü' hücreleri üreten popülasyonlarının diğer yöntemler edinilen çalışır farklı çıkışları verebilir.
  5. Oran pozitif moleküler prob floresan ('ölü') ve içsel / spesifik olmayan sinyal ('canlı') ortalama dalga boyları protokol hassasiyetini belirlemek için.
    NOT: 'canlı' ve 'ölü' popul floresan ayrımcılığı artırmak içinkus, hücre duvarı geçirgenliği ve elde edilen floresan sinyalleri 6 geliştirmek için besin tükenmiş hücreleri veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde Etkin leke alımı karbon kaynağı artar. Spektral örtüşme bazı FCM modellerinde sınırlı tazminat örnek edinme (PMT gerilim değişiklikleri) sırasında veya sonrasında analitik özel yazılım kullanıcı-manipüle ikili düzeltme yapılabilir.
  6. 'Ölü' en yüksek hücre miktarı oluşumu non-spesifik boyanması olmadan lekeli olmuştur optimize protokolü seçin. Testin bir numara varsa benzer sonuçlar iyi floresan sinyal ayrımcılık ile birlikte düşük konsantrasyon ve inkübasyon süresi ile protokol kabul. Takip sitometresinin kapatma işlemi için talimat üretmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üslü fazda bir M.aeruginosa toplu kültüründen İleri doğru ışık saçılımı (FSC) ve yan ışık dağıtma (SSC) çıkışları, sırasıyla, hücre boyutu (çapı) ve iç boyu bilgileri (Şekil 1A) içerir. FSC M.aeruginosa olmak için çok büyük ve / veya küçük olan hücreleri ayırabilir. Bu ayrımcılık veya yolluk bir FSC çıkışı (Şekil 1C) belli noktaları arasındaki rafine verilerle yapılabilir. Kırmızı bir ışık kaynağı tarafından uyarıldığı zaman fikosiyanin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

15,19,22,23 - moleküler problar kullanılarak yayın artan sayıları, güvenilir ve bilgilendirici veriler 5,6,8 elde edilebileceğini gösterir. Henüz itibarıyla aynı konsantrasyon ve kuluçkalama süresi 6,10 Tüm türler arasında etkili olabilir hücre canlılığı için mükemmel bir leke yoktur. Değişmiş floresan emisyonları ile prob hatta aynı tip doğru konsantrasyon ve inkübasyon süresi (Tablo 1 ve 3) kurmak için bir gereksinim olduğunu göstermektedir. Bu protokolü kul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar araştırma ve tesisler için destek ve finansman için doktora öğrencisi Dave Hartnell ve Bournemouth Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SiyanobakteriOrtamı Sigma-AldrichC3061-500MLBG-11 Tatlı su konsantre çözeltisi (x50 seyreltme)
Dekontaminasyon SıvısıBD Biosciences653155Çıkışlar hızlı veya 2 & mikro akış hızında saniyede 12'den fazla olay olduğunda 66 dakika boyunca çalıştırın; l/dk.  Ardından 2 dakika kılıf H2O.
Akış SitometresiBD Biosciencesistek üzerineBD Accuri C6
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020DMSO'da nükleik asit boyası ve 5 mM çözeltisi
SYTOX OrangeLife TechnologiesS11368Nükleik asit boyası ve DMSO'da 5 mM çözeltisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Flow CytometryMolecular ProbesMicrocystis AeruginosaSYTOX GreenSYTOX OrangeCell MortalityNucleic Acid ProbesProbe OptimizationFluorescence DetectionCyanobacterial Physiology

İlgili makaleler