Yöntem makalesi

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

DOI:

10.3791/53049

⸱

21 Nisan 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein ekspresyonunu kontrol etmek sadece yaşayan her organizma için gerekli değildir, aynı zamanda hücresel modellerde protein fonksiyonlarını araştırmak için de önemli bir stratejidir. Sunulan protokol, primer hipokampal nöronlar dahil olmak üzere memeli hücrelerinde antikor girişiminin uygulanmasını gösterir ve protein fonksiyonunun incelenmesinde üç boyutlu rekonstrüksiyonların kullanımını gösterir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

protein ekspresyonunun bir sıkı yönetim canlı her organizmada gerekli değil, aynı zamanda hücresel modellerinde protein fonksiyonlarını araştırmak için önemli bir strateji değil sadece. Bu nedenle, son araştırmalar RNA ve antikor enterferans dahil memeli hücre hatları, hatta hayvan modellerinde, protein ifadesini hedef için farklı araçlar icat etti. İlk strateji son yirmi yılda çok dikkat toplamıştır ederken, hücresel membranlar boyunca ve hücre içine antikor kargoların bir translokasyon aracılık peptidler, çok daha az ilgi aldı. Bu yayında olarak, antikor müdahale deneyleri gerçekleştirmek için insan embriyonik böbrek hücrelerinde ve primer hipokampal nöronlar Chariot isimli bir peptit taşıyıcı kullanır ve daha fazla protein işlevi analiz üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulanmasını göstermek için nasıl ayrıntılı protokol sağlar. Bulgularımız Chariot muhtemelen nükleer lokalizasyon sinyali, Particula için olduğunu göstermektedirrly soma ve çekirdeğinde bulunan proteinleri hedef için çok uygundur. Primer hipokampal kültürlere Chariot uygularken Enteresandır, reaktif şaşırtıcı derecede iyi ayrışmış nöronlar tarafından kabul edilmesi ortaya çıktı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

her canlı organizma kendi gelişimini komuta yanı sıra çevresel sinyallere tepki için protein ifade Sıkı denetim esastır. Bu nedenle, mekanizmaların çok sayıda hassas uygulama tarafından kodlanan her protein ifade düzeyini düzenleyen evrim sırasında icat edilmiştir. ömrünün herhangi bir zamanda herhangi bir ökaryotik hücre içinde mevcut olan 20.000 genler. Protein üretimi farklı aşamalarında yer alarak, düzenleyici mekanizmaların posttranslasyonel modifikasyonlar proteini, taşıma ve bozulma yönüne taşıma kromatin yapısının, transkripsiyonu ve RNA yönetim arasında değişir.

Moleküler makine ve değiştirilmiş protein ekspresyon düzeyleri altta yatan de arızaları, kanser ya da zihinsel engelli gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Nitekim, nöronal gelişim ve memeli beyin fonksiyonlarının olağanüstü karmaşıklığı bakarak, sensiProtein ifadesindeki değişiklikler bu sofistike sistemlerin bilirlik Alzheimer ve Frajil X Sendromu (FXS) gibi Parkinson hastalığı (AH ve PH) yanı sıra otizm spektrum bozukluğu (ASD) dahil olmak üzere birçok tanınmış entelektüel açıkları kendini gösterir. Ikinci hastalığı tek için düzenleyici protein, FMRP (Kırılgan X mental retardasyon Protein) 1-4 kaybına bağlı olan bir çok protein, geniş bir misexpression ile karakterize edilir. Nokta mutasyonları zihinsel engelli olan hastalarda tespit değil iken 5 kapatma mRNA değiştirerek mRNA stabilitesini ve çeviri yönetir Ayrıca, Değişken ücret etkileyen kromozomal yeniden düzenlenmeler bağlantılı x protein A (VCXA), bir protein, son zamanlarda, entelektüel açıkları ile ilişkilendirilmiştir şimdi olduğu gibi 6, 7, gözlenen ruhsal bozuklukları değişmiş VCXA ifadesi ve hedef prote düzensiz ifadesi kaynaklanan düşündürenins. Bu bulgulara, de novo ASD ile ilişkili genlerin kopya sayısı varyasyonları, böylece yüksek veya azalmış protein ekspresyon düzeyleri neden olabileceğini fikrini desteklemektedir, yeni gen duplikasyonlar ve silmeler ASD 8 için önemli bir risk faktörü olduğunun tespit edip araştıran bir çalışma doğrultusunda entelektüel açıkları.

Dikkate değer olarak, son araştırmalar başka bir proteinin ifade seviyesi, tam hemen hiçbir güvenlik marjları 9 yüksek protein miktarlarının bir sonucu olarak, toplanmayı önlemek için ayarlanır ilişkin kanıtlar sağlamıştır. Nedenle, daha küçük artışlarla, AD ve PD 9 gibi hastalıkları indüklemek için yeterli olduğu önerilmiştir. Protein ekspresyon kontrol katkıda moleküler makine çeşitliliği bu bulgular ışığında karmaşık bir düzenleme planı desteklemesine rağmen, 5000'den fazla memeli genlerinden 10 ekspresyon seviyesini araştıran bir çalışma göstermiştirdoğa daha cimri düzeni tercih: Proteinlerin hücresel bolluğu ağırlıklı böylece RNA kullanılabilirlik yönetimi esas ince ayar protein ifadesini hizmet ettiğini gösteren, çeviri 10 seviyesinde düzenlenir gösterilmiştir.

ilgi proteinlerin dozunu incelenmesi (POI) bu nedenle sadece bir proteinin endojen fonksiyonlarının anlaşılmasında önemli değil, aynı zamanda birçok hastalığın araştırılması ve tedavilerin geliştirilmesine değil. Böylece, son on yıl POI dozajı işlemek için RNA girişimi kullanarak çeşitli stratejiler ilerleyişini gördük. RNA enterferans yaygın protein fonksiyonunu incelemek için kullanılır ve hatta kanser ya da göz hastalıkları tedavi etmek yanı sıra hastalarda 11-13 antiviral tedavileri sürdürmeye klinik çalışmalarda uygulanan olmasına rağmen, bazı zorluklar strateji imkansız hale olabilir ortaya çıkabilir. Örneğin, homoloji ile demonte tahrik tohum sırası compara olduğuble kısa, dolayısıyla teşvik dışı hedef etkileri. Yüksek verimli dizileri nadirdir ve zaman alıcı ve masraflı olabilir sağ dizisini tanımlayan, (14 gözden) seçenekler binlerce arasında bulunan gerekir, ancak o zamandan beri sonuçlar yine hayal kırıklığı olabilir.

Alternatif bir strateji doğrudan antikorlar tarafından POI hedef etmektir. Burada, hücresel protein durumunu azaltmak için (Aktif Motif tarafından imal edilmiş), protein taşıyıcı Chariot kullanımını göstermektedir ve üç boyutlu rekonstrüksiyon istihdam knock-down aşağıdaki protein fonksiyonunu incelemek için.

Chariot, kendisi 2.8 kDa peptidinin, aktif motifi memeli hücreleri 15 membranları boyunca Servisi peptidler, proteinler ve antikorlar için kullanılır. Chariot-POI kompleksleri, bunun üzerine hidrofobik etkileşimler, kullanan olmayan kovalent makromoleküler kompleksler oluşturarak İÇN ile peptid ilişkilendirir bir endosome-ind hücrelere içselleştirmiş olanependent şekilde. Önemli olarak, Chariot mekik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu etkiler de sitotoksik etkilerini uygulamak için veya yük 15 biyolojik aktivitesini etkilediği de işaret etti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazır Çözümler

  1. 2 ug / ml bir son konsantrasyona kadar steril H liyofilize aktif motifi toz 2 O yeniden süspanse edin. Karıştırma için dikkatlice dokunun.
  2. (Örneğin, 12 ul, her biri 2 ul reaksiyon başına zorunludur) az miktar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.

Hücreler 2. Hazırlık

  1. Bu tür antibiyotikler de dahil olmak üzere, bir 24 yuvalı plaka 500 ul büyüme ortamı üzerinde HEK293 hücreleri veya birincil nöronlar gibi tohum memeli hücreleri.
    NOT: nöronlar kullanırken, düşük yoğunluklu hücreleri tohum ve 24 plaka sadece iki orta satır kullanın. Her iyi ve böylece inkübasyon (adım 4.2) sırasında orta liman boş muadili olacaktır. nöronlar ele aldığınızda her zaman hücreler bir kaç dakikadan fazla inkübatör dışında tutulur değil emin olun.
  2. Hücreler uygulama kadar kültür, uygun koşullar altında hücrelerin (nemlendirilmiş% 5 CO2 ve 37 ° C). % 50konfluent.
    NOT: nöronlar kullanırken, kültür istenilen gelişimsel aşamaya kadar hücreler ulaştı ve uygulamayı değiştirecek. ortamda iki kez% 25-50 haftada. Orta (1 x B27, 5 mM L-glutamin ve 1 x penisilin ve streptomisin içeren; ref 16 karşılaştırın), Neuro temelli vasat.

3. Chariot Kompleks Oluşum

  1. reaksiyon başına PBS 50 ul sırasıyla özel hedef veya ilgili antikor, bunun yanısıra kontrol proteini veya kontrol antikoru, 0,1-2 ug seyreltin.
    NOT: Bu teknik aynı zamanda makromoleküler kompleksleri öncesi bağlı primer ve sekonder antikor (. Cp 'Temsilcisi Sonuçlar', Şekil 1) oluşan çalışır. Mix ve sıkma.
  2. Her numune için, Chariot kendi aralarında birleşmelerini engellemek için ayrı bir tüp kullanarak PBS, 50 ul 2 ul Chariot stok solüsyonu seyreltin. Mix ve sıkma.
  3. pipet ile Chariot seyreltme seyreltilmiş POI veya antikor (adım 3.1) aktarınting. Mix ve sıkma.
  4. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı (Chariot-PO kompleksleri oluşturacaktır).

4. Hücrelerin transfeksiyonu

  1. Chariot kompleksleri, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı 100 ul (37 ° C, katkı maddeleri) (aşama 3.4) ile seyreltilir. Ortamı çıkarın ve bir kez önceden ısıtılmış 1 x PBS kullanarak hücreleri yıkayın.
    NOT: nöronlar kullanırken, orta atmayın, bu yeniden yapılacaktır. 37 ° C'de tutun. Yıkama için, PBS, 0.5 mM MgCI2 ve CaCl2 ihtiva eden kullanımı.
    Öneri: plakasını (adım 4.5) kuluçkaya ederken boş kuyularda ortamı tutmak.
  2. hücrelere Chariot kompleksi çözeltisi (aşama 4.1) uygulayın ve çözeltinin eşit bir dağılımını sağlamak için yavaşça hücreler sallayın. 1 saat boyunca standart koşullar (adım 2.2) altında hücreleri büyür. % 10 oranında bir nihai konsantrasyona kadar serum ekleyin. nöronlar kullanıldığında, Adım 4.1 orta ekleyin. 1 ila 2 saat daha hücreleri büyütün.
    NOT:Optimal inkübasyon süresi büyüklüğü ve yük özelliklerine bağlıdır ve tecrübi olarak ayarlanması gerekebilir. Aşağıdaki öneriler bir rehber olarak hizmet edebilir: peptitler için, 1 saat 1-2 saat antikorları için, 2 saat tavsiye ve antikorlar ile nöronların transfeksiyon 4 saat için olan proteinler için, genellikle yeterli olur.
  3. Her zamanki gibi analiz için işlem hücreleri. Lütfen dikkat: teknik sabitleme protokolleri yanı sıra canlı görüntüleme kullanarak deneyler ile uyumludur.

5. Görüntüleme

  1. bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak, yaklaşık 0.25-0.5 mikron mesafe kullanarak hücreleri ve / veya ilgi hücre bölümlerinde z-yığınları alır. hassas tabaka mesafesi yeniden inşa edilmesi yapı büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı tespit edilmesi gerekmektedir.

6. İmar

  1. Aşağıdaki adımlarda, o tıklayarak birden fazla nesneyi seçmek için, seçmek ve gezinmek, Cntr arasında geçiş yapmak için Esc altını kullanmakn onlara ve shift tuşu nesneleri (krş. 6.10 adım) kesmek için.
  2. Imaris içinde LSM-dosyasını açın.
  3. parlak yapıları doygunluk ulaşana kadar her kanal için görüntü Ayarı kullanarak, resim kontrast. Yüzey inşaat etkilemeyeceğini bu ayarlama, sadece görüntü eşikleme de deneyci yardımcı olmak için hizmet ettiğini unutmayınız.
  4. Yeni Yüzeyler Ekle simgesini tıklayın. Bir sihirbaz açılacaktır.
  5. Seçin: İlgi Segment sadece bir bölge. Bir sonraki adıma geçin.
  6. ilgilendiğiniz nesne sığdırmak için seçim kutusunun kenar boşluklarını ayarlayın. Görüntü 3 boyutu vardır akılda ve seçimi de z düzlemde ayarlanması gerektiğini Lütfen ayı. Seçim kutusunun dikdörtgen şekli düzgün ilgi nesnesi eşleşmiyor gerekiyorsa, nesneyi açmak ve / veya gerekli tüm yapılar gömülü kadar kutuyu büyütmek. İstenmeyen nesneler daha sonra kaldırılmış olabilir (cp. 6.10 adım). İlerlemek.
  7. Uygun ch seçinAnnel. Yüzölçümü Detay Seviyesi veya küre çapı yapıları yeniden düzenlenmesi eşleşecek şekilde ayarlanması gerekir. Sinyal özelliklerine bağlı olarak, Mutlak Yoğunluk veya Yerel Kontrast da kullanılabilir. Genellikle, Yerel Kontrast yaygın sinyalleri için daha iyi çalışır. Herhangi bir durumda, ayarlar, sırasıyla, ilgi konusu her bir sinyalin ya da yapı için ayrı ayrı ayarlanabilir olması gerekir.
  8. Eşik aracını kullanarak, ilgi yapısını yeniden.
  9. yeşil ok alt tıklayarak yeniden tamamlamak.
  10. kesme ve gerektiği gibi yüzeylere kaldırmak için kalem aracını kullanarak daha nesne ayarlayın. Istenilen nesneyi kesmek için görüntüyü, bu nedenle, kuzey-güney yönünde kesilir yatırmak için mümkündür.
  11. seçme İstatistik, Ayrıntılı İstatistiklere ve Ortalama Değerler her yüzey için hacim, alan ölçümleri ve yoğunluklarını alın.
  12. Renk kodlu istatistikleri gözlemlemek için (İsteğe bağlı adım) (cp. Şekil 2E ve F), ilgili yüzey rengi sekmesini seçin ve yerine 'Base' ve 'İstatistik Kodlu' işaretleyin. Çeşitli seçenekler görüntülenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki paragraflarda, POI fonksiyonel demonte gösteren örnek sonuçları Chariot reaktif ve antikor girişim sunulmaktadır kullanarak (Simiate, daha fazla ayrıntı için 16, 17 bakınız). Bulgular Simiate azalmış ekspresyon transkripsiyonel aktivite bozar, ve doz bağımlı bir şekilde, daha yüksek antikor miktarları (> 1 ug antikoru) uygulanması durumunda% 99 üzerinde mortalite oranları ile sonuçlanan, apoptosisi teşvik göstermektedir (Bu keşifler, daha önce yayınlanmış 16). Bur...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir doz tahrik şekilde hücre işlevlerini kontrol protein sentezleme seviyeleri önemini incelemek için bir protokol mevcut. Açıklanan protokol, dolayısıyla hücresel seviyede protein fonksiyonunun ayrıntılı çalışmalar sağlayarak hipokampal nöronlar dahil olmak üzere çeşitli memeli hücre tipleri, protein ekspresyonunun bir ince ayar manipülasyon sağlar.

RNA interferans özel hedefleri aşağı regüle etmek için bilinen bir strateji temsil eder, ancak, dezavantajları (cp. 14) sahi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sunulan çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından finanse edilerek bölgelerinde desteklenmiştir / RD Kanada ortaklık programının Frajil X Araştırma Vakfı, RD, Üniversite Erlangen-Nürnberg Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung Jerome Lejeune Vakfı RD ve Deutsche Forschungsgemeinschaft gelen RD ve RE. Yazarlar pCMV5-FLAG vektör kullanılabilir hale getirmek için teknik hücre kültürü bakımı ile ilgili yardım yanı sıra Prof. Dr. M. Wegner için Ingrid Zenger'i teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, özellikle video çekimi de yararlı destek için Nadja Schroeder teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ChariotActive Motif30025mağazası -20 > C
Nörobazal ortamYaşam teknolojileri21103-04937 °C'ye kadar ısınma; C
1x B27Life teknolojilerini17504044 -20 ° C'de saklayın;
CL-glutaminYaşam teknolojileri25030-149-20 ° C'de saklayın; C
Penisilin ve StreptomisinYaşam teknolojileri15140-122-20 ° C'de saklanır; C
Imaris yazılımıBitplanen.a.pahalı, ancak eşsiz
Lazer Tarama MikroskobuZeissn.a.
kullanmadan önce

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007(2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Chariot PeptideThree dimensional ReconstructionHEK293 CellsPrimary Hippocampal NeuronsLaser Scanning MicroscopyImaris SoftwareThresholding ToolSurface Analysis

İlgili makaleler