Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri
Bu makalede
Özet
Özet
Intravital mikroskopi yaşayan hayvanlarda farklı farklı bölgelerde süreçleri ve damarları araştırmak için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu protokol, biz mezenter damarların intravital mikroskobu açıklar. Bu, in vivo olarak, lökosit-endoteliyal etkileşimleri gösteren tekrarlanabilir sonuçlar ile kısa bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Biz endotel LPS mücadeleden sonra inflamatuar bir ayarı açıklamak. Ancak bu modelde biri bakteriyel kimyasal veya biyolojik gibi iltihaplı durumların birçok farklı türde uygulamak ve ilaçların yönetimini ve yaşam hayvan üzerindeki doğrudan etkileri ve lökosit işe üzerindeki etkisini araştırmak yapabilirsiniz. Bu protokol, farelerde ve damarlarda inflamatuar yanıt üzerindeki etkileri farklı tedaviler için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Burada, floresan rodamin 6G bu etiketleme yoluyla lökosit ve trombosit görselleştirme açıklar. Buna ek olarak, herhangi bir görüntüleme pe olabilirhedeflenen floresan etiketli moleküller kullanılarak rformed.
Giriş
Bu protokolün amacı, inflamatuvar koşullarda lökosit-endotel ve lökosit-trombosit etkileşimleri doğrudan gözlem için fareler yaşayan mezenter damarların intravital mikroskopi basitleştirilmiş tekniği tanımlamaktır.
Intravital mikroskopi inflamatuar lökosit işe alma ve işlevini anlamak için önemsiz ama önemli değil enflamatuvar durumlarda 1,2 altında in vivo lökosit-endotel etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu protokolde biz tarif yöntemi daha önce yayınlanan yayınlara göre geliştirilmiştir. Yayımlanmıştır ne büyüyen trombüs 3 ve paralel olarak trombosit birleşmesini görselleştirmek benzer daha erken 4, bir batın mezenterik ven iletilen ışık mikroskobu ile incelenir. Bu tür sıçanlarda 5 veya fare karaciğer ve sıçanların 6 cremaster kas gibi içi hayati mikroskobu çeşitli modelleri vardır.
Mezenter ven intravital mikroskopi geliştirilmiş ve birçok grup ile daha önceki çalışmalarda uygulanmıştır. / - - Kimin trombosit serotonin farmakolojik uzun vadeli tarafından tükenmiş farelere bulgular nöronal olmayan serotonin eksikliği ve karşılaştırılmıştır olan fareler, vahşi tip fareler ve triptofan hydroxylase1 (TPH1) arasında lökosit işe farklılıkları gözlemlemek için bu tekniği kullandık Uygulama, bir seçici serotonin tekrar-yükselme inhibitörü, fluoksetin 7. Biz de akut fluoksetin tedavisinin 8. sonrası lökosit-endotel etkileşimleri incelenmiştir.
Bu model, hızla gerçekleştirilen ve lökosit-endotel ve trombosit lökosit etkileşimleri geçerli ölçümleri sağlar, çünkü bu protokolde, mezenter damarların intravital mikroskopi odaklanmak. Bu çok daha zor ve zaman alıcı kemik, karaciğer, deri, ya da cremaster kas gibi diğer organlara, intravital mikroskobiyle bulunmaktadır. kipBurada tarif edilen L, lipopolisakarit intraperitoneal enjeksiyonu gibi bir enflamatuar uyarıcı, ile challengeing sonrası inflamatuar hücre-hücre etkileşim tekrarlanabilir değerlendirilmesi için idealdir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Alman hayvan koruma kanunu (TierSchG) uygun olarak yapılmıştır. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) ve ulusal hayvan refahı vücut GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) tarafından tanımlanan fareler ev sahipliği ve iyi hayvan uygulamalarına uygun olarak ele alındı. Freiburg Üniversitesi hayvan refahı komitesi yanı sıra yerel yönetimler (Regierungspräsidium Freiburg) tüm hayvan deneyleri onayladı.
1. Hayvan Taşıma, hazırlanması ve Enflamasyon indüksiyonu
- 20 g - 16 ağırlık aralığı ile 6 haftalık erkek fareler - 4 kullanın. Not: fareler eski veya daha ağır olmaları durumunda, mikroskobik gözlem sınırlayan, damar etrafındaki aşırı yağ sunuyoruz.
- Ameliyat öncesinde tüm araçları ve mikroskop tablosunu sterilize edin.
- Enjekte 20 mg / kg LPS (lipopolisakarit) intraperitonal olarak 4 bakteriyel Inflamm uyarılması için bir oturma fare içine mikroskop önce saattirme.
- Plastik odası ve mezenterik doku nemlendirmek için 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde bir% 0.9 tuzlu su çözeltisi Prewarm.
- Sağ mikroskopi işlem öncesi intraperitonal ketamin enjekte (100 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) ile fare anestezisi. Alternatif anestezi, örneğin,% 2 izofluran teneffüs kullanılabilir. Refleks uyarım (firma basınç ayak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı ile doğru anesthetization onaylayın.
- Bir tıraş makinesi kullanarak karın atmaktadır ve etanol% 70 doymuş gazlı bez ile gevşek saç çıkarın.
- Anestezi altında iken, kuruluk önlemek için fare gözleri veteriner merhem sürün.
2. Cerrahi
- % 70 etanol kullanılarak karın sterilize edin. Bu yöntem, steril bir yöntem değildir, deney sonunda öldürücü olabilir.
- Median laparotomi gerçekleştirin: küçük, kavisli bir forseps ve küçük bir makas kullanarak karın cildi açın. Epi tanımlayıngastrical gemiler damarları korumak için, linea alba bölgesinde periton açın ve.
- Nemli doku tutmak için karın boşluğuna önceden ısıtılmış tuzlu su bir kaç damla uygulanır.
- Floresan 50 ul rodamin 6G 9,10 daha önce tanımlandığı gibi, retro-orbital (1 mg / mi) enjekte edilmesiyle Etiket lökositlerin ve trombositlerin.
- 10 cm çapında bir petri içinde ileumand yerinde bunun bir döngü exteriorize ve 37 ° C uygulayarak nemli doku tutmak için emin olun tuzlu su çözeltisi (% 0.9) her dakika önceden ısıtılmış.
3. Intravital Mikroskopi
- Mikroskop altına Fare yerleştirin ve 200 çapında mezenter ven getirmek - görünümünde merkezinde 300 um. Hiçbir görünür yağ çevresi ile bir gemi seçin.
- Böylece endotel uyarılmasını önlemek mezenter damarlarını dokunmayın. Dikkatli ileum döngü Kolu.
- Kan hücresi endotel etkileşimlerini görselleştirinBir ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop ve mikroskop yazılımı kullanarak bir kamera ile. Tutanak kan fare başına 4 farklı damarlarda 1 dakika için hücre-endotelyal etkileşimleri.
- Görüntüleme Deneylerin tamamlanmasından sonra, servikal dislokasyon ile fare öldürülür.
4. Analiz
- Analiz çevrimdışı yürütmek ve tüm parametreler için kör. Herhangi bir uygun yazılım programı kullanarak analiz gerçekleştirin.
- Intraluminal kan hücresi akımı odaklanmış yüksek zaman çözünürlüklü sine-klipleri istikrarlı ve interindividually karşılaştırılabilir kan akımı koşulları (maksimal kare hızı) onaylayın.
- Haddeleme lökosit sayısını ölçmek. Bunun damar yoluyla dikey bir çizgi çizin ve 1 dakika içinde bu çizgiyi tüm lökositlerin sayısı.
- Tek lökosit stabil endotel üzerinde yuvarlanma sırasında 50 mikron mesafe geçmek gerekiyor zamanı ölçerek haddeleme hızı belirleyin. Bunu yapmak için, 50 um t mesafede iki dikey çizgi çizinven hrough.
- Temsili bir lökosit gerekli zaman (mm / s) üzerinden 50 mikron bölerek other.Calculate bir hattan lökositlerin hız almak için gereken süreyi ölçün.
- 0.04 mm'lik bir 2 alanda lökosit adezyonu ölçün. Bunu yapmak için, damara 200 mikron yan uzunluğunda bir kare çizin.
- Bu kare içinde 30 saniye boyunca hiçbir görünür hareket olarak tanımlanan firma yapışık lökositler, Kont.
- Platelet lökosit etkileşimlerini ölçmek için tek lökosit bağlı trombositlerin sayısını.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde tarif edilen deneysel ortamda bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu intravital mikroskobiyle gözlenebilir bir batın ileum-döngü ve kaplar, bir fare göstermektedir. Şekil 2 nedeniyle işlem görmemiş hayvanlarda aktivasyon belli ölçüde göstermektedir prosedür kendisi. Fakat hemen hemen hiç yavaş haddeleme ya LPS ile tedavi edilen farelere kıyasla, lökositlerin Sıkı yapışma vardır. Ayrıca, vahşi tipli fare ya içme suyu ya da tedavi edilmemiş farelerde 3 hafta iç...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda hazırlık ve in vivo farelerin mezenter damarlarının intravital mikroskopi performansını açıklamak. Bu yöntem bize canlı organizmada doğrudan lökosit-endotel ve trombosit endotel etkileşimleri 11 gözlemleme fırsatı veriyor.
Endotel inflamasyon için erken yanıt olarak aktive olur ve haddeleme, yapışma ve göçüne 12 sonuçlanan lökositler ve trombositler ile etkileşime girer. Ancak lökositler de trombosit sözde şekillendirme ile etkileşim, platelet lökosit...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Escherichia coli'den lipopolisakkaritler 055: B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
Kaynaklar
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316(2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
