Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Özet

Mikroakışkan cihazlar içinde fonksiyonel mikro dokuların oluşturulması, geleneksel hücre kültürü tekniklerinin mikrocihazlardaki sınırlı mekansal boyutlara uyarlanarak hücre fenotiplerinin stabilizasyonunu gerektirir. Kollajenin modifikasyonu, hepatositler gibi birincil hücreleri mikroakışkan doku modelleri olarak stabilize edebilen ultra ince kollajen düzeneklerinin katman katman birikmesine izin verir.

Özet

Mikroakışkanlar, hücresel mikro çevrenin mükemmel kontrolünü sağlasa da, mikroakışkan cihazlar içindeki hücrelerin kültürlenmesi, kollajen tip I jellerdeki hücrelerin kültürü challenging. 3D olabilir, bu da mikrocihazlarda mikroakışkan doku modelleri oluşturmak için gerekli olan hücre morfolojisini ve işlevini stabilize etmeye yardımcı olur. Doku kültürü plakaları için geleneksel 3D kültür tekniklerini mikroakışkan cihazlara çevirmek, sınırlı kanal boyutları nedeniyle genellikle zordur. Bu yöntemde, mikroakışkan cihazlarda kültürlenen hücrelerin üzerinde ultra ince kollajen düzenekleri oluşturmak için katman katman biriktirme ile kullanılabilen polikatyonik ve polianyonik kollajen çözeltileri üretmek için doğal tip I kollajeni modifiye etmek için bir teknik tarif ediyoruz. Bu ince kollajen tabakaları, örnek hücre olarak birincil hepatositler kullanılarak gösterildiği gibi hücre morfolojisini ve işlevini stabilize eder ve mikroakışkan cihazlarda uzun süreli mikro doku kültürüne izin verir.

Giriş

Mikroakışkanlar, hücresel mikroçevrenin mükemmel kontrolüne izin verse de, hücrelerin, özellikle de birincil hücrelerin, mikroakışkan cihazlar içinde kültürlenmesi zor olabilir. Doku kültürü plakalarında kültürlendiğinde hücre fonksiyonunu sürdürmek ve stabilize etmek için birçok geleneksel hücre kültürü tekniği geliştirilmiştir, ancak bu teknikleri mikroakışkan cihazlara çevirmek genellikle zordur.

Böyle bir teknik, fizyolojik 3D hücre ortamının bir modeli olarak kollajen jelleri üzerinde veya arasında sıkıştırılmış hücrelerin kültürüdür. ¹ Tip I kollajen, hücre dışı matriks, doğal bolluk, sağlam hücre bağlanma bölgeleri ve biyouyumluluk nedeniyle biyomalzeme uygulamaları için en sık kullanılan proteinlerden biridir. ² Diğerlerinin yanı sıra kanser hücreleri^3,45, mikrovasküler endotel hücreleri⁶ ve hepatositler⁷ dahil olmak üzere birçok hücre kollajenli 3D kültürden yararlanır. Doku kültürü plakaları gibi açık formatlarda kollajen jellerin kullanımı kolay olsa da, mikroakışkan cihazların sınırlı kanal boyutları ve kapalı yapısı, tüm kanalı tıkamadan jelleşen sıvıların kullanımını pratik hale getirir.

Bu sorunun üstesinden gelmek için, mikroakışkan cihazlarda kültürlenen hücrelerin üzerinde ultra ince kollajen düzenekleri oluşturmak için katman katman biriktirme tekniği^8'i doğal kollajen çözeltilerinin kimyasal modifikasyonlarıyla birleştirdik. Bu katmanlar hücre morfolojisini stabilize edebilir ve kollajen jellere benzer şekilde işlev görebilir ve polimerize matris ile kanalları tıkamadan mikroakışkan cihazlarda hücreler üzerinde biriktirilebilir. Bu yöntemin amacı, polikatyonik ve polianyonik kollajen çözeltileri oluşturmak için doğal kollajeni modifiye etmek ve hücreler üzerine ince kollajen matris düzenekleri biriktirerek mikroakışkan kültürde hücreleri stabilize etmektir. Bu teknik, mikroakışkan cihazlarda primer hepatositlerin morfolojisini ve işlevini stabilize etmek için kullanılmıştır. ⁹

Doğal ve sentetik polielektrolitler¹⁰ ile plaka kültüründe hepatositleri kaplamak için^{katman katman biriktirme 11,12} ve mikroakışkan cihazlarda hepatositler için bir tohumlama tabakası olarak^13,14 bildirilmiş olmasına rağmen, bu yöntem, 3D kollajen kültürü tekniklerini taklit ederek hepatositlerin üzerine saf bir kollajen tabakasının birikmesini tanımlar. Bu protokolde, 3D kollajen katmanları kullanılarak korunabilen hepatositleri örnek hücreler olarak kullanıyoruz. Kollajende 3D kültürden yararlanan diğer birçok hücre türü, ultra ince bir kollajen matris düzeneğinin katman katman biriktirilmesinden sonra kültürden benzer şekilde faydalanabilir.

Protokol

Yerli Çözünür Kolajen Çözüm 1. Hazırlık

1. Hazırlama ya da 1-3 mg / örneğin Piez ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi standart ayırma protokollerini kullanarak ml. ¹⁵ de sıçan kuyrukları kolajen asitleştirildi çözünür, tip 200 mg satın
2. Modifiye edilen kollajen çözeltilerinin istenen son hacmine bağlı olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını Scale. Yaklaşık çözünebilir doğal kolajen 200 mg, 3 mg / ml metile edilmiş 25-30 ml ve süksinillenmiş kolajen çözeltilerinin 25-30 ml her biri tercih.

2. Kolajen Metilasyon

1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Bulanık olma çözüm neden kollajen çökelti gözlemleyin.
3. 25 dakika boyunca 3000 x g'de çöktürülmüş kollajen çözüm aşağı doğru döndürün. Berrak bir jel-benzeri çökelti tüplerin alt görünür olmalıdır. Aspire ve düzgün süpernatant sıvı atmayın.
4. 0.1 N HCI ile metanol içinde 200 ml çökelmiş kollajen yeniden süspanse edin ve metilasyon reaksiyonu 4 gün boyunca oda sıcaklığında karıştırma ile oluştuğu sağlar. Kollajen erimesi olmaz, ama çözüm bulutlu hale getirecek çok küçük görünür parçalar halinde parçalayın gerekir.
5. Metilasyon sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm metıle kollajen pelet. Aspire ve asitli metanol süpernatant atın.
6. Tekrar pipetleme ile yaklaşık 3 mg / ml'lik bir konsantrasyona vererek, steril PBS 25 ml metile edilmiş kolajen çözündürülür ve bir 60 um'lik bir hücre süzgecinden çözelti filtre edin. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
7. Concentratio değerlendirinticari bir sıçan kolajen ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözümün n. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
8. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak metillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin metıle kollajen olan üst kat.
9. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

3. Kolajen Succinylation

1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, diğer 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Kollajen bulanık olma çözüm neden çöktürmek gerekir.
3. Suc 40 mg çözülür(kolajen çözeltisinin hacmi ^inci 20/01) 10 ml aseton içinde cinic anhidrid (kolajen mg'ı başına 0.4 mg) eklenir. Yavaş yavaş (yaklaşık 0.5 mi artışlarla) sürekli pH değerine karıştırılarak kolajen çözeltisi bu karışıma ekleyin. PH 9.0 yaklaşırken 1 N NaOH, 1 veya 2 damla eklenerek pH 9.0'ın üzerinde muhafaza edin.
4. Aseton içinde süksinik anhidrit katan 120 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin. Süksinillenmiş kollajen erir olarak açık hale çözüm gözlemleyin. Periyodik olarak 9.0 üstünde kalmasını sağlamak için pH değeri kontrol edin.
5. 1 N HCI 20 ul artışlarla 4.0 çözeltinin pH ayarlayın. Süksinillenmiş kollajen çökeltiler gibi yine bulutlu çözüm gözlemleyin.
6. Succinylation sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm süksinillenmiş kollajen pelet. Aspire ve reaksiyona girmemiş süksinik anhidrit ile asidifiye süpernatant atın.
7. Succinylated kolajen çözülürsteril PBS, 25 ml, 60 mikron hücre süzgecinden çözeltisi tekrar pipetle ml / yaklaşık 3 mg'lık bir konsantrasyonunu vermek ve filtre bölgesi. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
8. Ticari bir kollajen sıçan ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözeltinin konsantrasyonunu değerlendirin. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
9. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak süksinillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin süksinillenmiş kollajen olan üst kat.
10. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

Kollajen Değişiklikler 4. Doğrulama

1. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kollajen çözeltilerin her birinden 1 mi örnekleri hazırlayın ve konsantre seyreltinHidrojen iyonu titrasyon için steril saf su ile 0,1 mg / ml arasında entration. Bundan başka, en azından 4 saat için her 10 kDa kesme membraneusing 3 çözeltisi değişiklikler ile suya karşı diyaliz ile tampon, en az 1000 kat seyreltilir.
2. NaOH ve HCl az miktarda 7.3 çözeltilerin pH ayarlayın. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri için titrasyon eğrilerini oluşturmak için Tanford ¹⁶ tarafından tarif edildiği gibi rasgele bir referans olarak pH 7.3 kullanarak, örneğin her biri hidrojen iyon titrasyonu yapın.
3. Asit hacminin ilişkili H ^+, molekül başına elektron sayısına karşı eklenirler pH değişimine çizilir. Yüksek pH "Amino" sınıfı, nötr noktasına doğru süksinillenmiş kolajen bir kayma (amin gruplarının kaybı) göstermelidir ve düşük pH "karboksil" sınıfı için metile kollajen sola doğru bir kayma (karboksil gruplarının kaybı göstermelidir ) ve süksinillenmiş kollajen bir sağa kayışı (karboksil grubunda bir kazançs), doğal kolajen ile karşılaştırıldığında.
4. Standart protokoller ^17,18 takiben, 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBA) kolorimetrik yöntem kullanılarak succinylation ile ikame nativ kollajen amino gruplarının% belirleyerek succinylation reaksiyonunun etkinliğini değerlendirmek.

Mikroakışkan Cihazlar ve Hücre Yayımlamak 5. Fabrikasyon

1. Standart yöntemler kullanılarak ⁹ mikroakışkan cihazları imal. 100 mikron boyunda 0,4-1,5 mm genişliğinde ve hücre büyümesi için uzun kanallar 1-10 mm mikroakışkan hücre kültürü oda oluşturmak için fotolitografi kullanarak tanımlanan silikon üzerinde SU-8 ustaları PDMS çoğaltma kalıp kullanın.
2. Cihaz ve bir bardak slayt yüzeyini okside plazma temizleyici kullanın ve sonra bağ birlikte basın. En az 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize aygıtı sonra steril PBS içinde 50 ug / ml fibronektin bölmeyi doldurup, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Fenotipinde veya farklılaşma hali stabilizasyonu için kolajen jel gerektiren primer sıçan ya da insan hepatositleri gibi hücreler, cihazı Tohum. Bu cihaz başına 14 x 10 ⁶ hücre / ml'de tohumlanmıştır taze izole edilmiş fare primer hepatositlerinde ^7,19 ya da ticari olarak temin edilebilir dondurulan primer insan hepatositleri 20 ul kullanımı.
4. Hücreler 4-6 saat takmak ve ardından serbest hücrelerin yıkayın ve büyüme ortamı ile kaplama medya yerine izin verin. Yayılma, tam hücre sağlamak ve hücrelerin konfluent tek tabaka oluşturmak için O / N inkübe edin.

6. katman-katman, bir kollajen depolanmasının

1. Laminer akış, doku kültürü kaputu, cihaz başına her çözeltinin 10 uygulamalar için metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri, yeterli miktarda, yanı sıra ortam birkaç ml hazırlar. Buz üzerinde çözüm tutun. Biz cihaz başına katmanın başına kollajen 20 ul (10-15 kat, toplam cihaz hacmi) kullanın.
2. Olmakmetilatlanmış (Polikatyonik) çözümü ile çırçır, daha sonra 20 metillenmiş bir ul ve sahip cihazlar yıkama alternatif her uygulama arasında 1 dakika bekledikten kolajen çözümleri succinylated. Aygıtı yaklaşık 20 dakika sürer solüsyon başına 10 kez, toplam yıkayın. Hücreler medya olmadan süreyi en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın.
3. Yavaş yavaş büyüklüğüne bağlı olarak giriş / çıkışında biriken kollajen gözlemleyin. Sıvı Akış arttıkça direnci, medya ile bir veya iki kez aygıtı yıkayın ve sonra katmanlarını devam edin.
4. Tüm katmanları uygulandıktan sonra, taze medya ile iki kez cihazı durulayın ve inkübatör dönmek. Hücre tipine bağlı olarak, hepatositler geliştirilmiş polarizasyon gibi hücre dışı matris ile indüklenen morfolojik değişiklikler, bir kaç saat içinde görünür olmalıdır.
5. Kollajen matrisin mevcudiyetini doğrulamak için standart yöntemler kullanılarak ⁹ transmisyon elektron mikroskopisi için temsili cihazlar hazırlayınkültürlenmiş hücrelerin üzerine montajı.

Hücre Fenotip ve Fonksiyon 7. Stabilizasyon

1. Resim hücre tipi için standart yöntemler kullanılarak hücre morfolojisi, canlılık ve polaritesi. Hepatositlerde için, kollajen birikimi etkilerini göstermek için apikal polarizasyon faz mikroskobu, canlılığı için LIVE / DEAD boyama ve CMFDA boya kullanılarak 14 gün boyunca görüntüleri toplamak.
2. Hücre morfolojisi için, durulama, 20 ul PBS ve görüntüyü faz kontrast mikroskopisi kullanılarak cihazı enjekte PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca cihazı yıkayın.
3. Ölü / canlı boyama için, durulama, üretici talimatlarına göre hazırlanır DAPI ile ölü / canlı boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir, durulama Cihaz tekrar 20 PBS ul ve görüntünün floresan mikroskobu kullanarak cihazı ile.
4. Safra Canaliculi boyama, imalatçının talimatları izlenerek, 37 ° C de 30 dakika inkübe hazırlanan DAPI ile 2 uM CMFDA boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için durulama PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme ile tekrar cihazı yıkayın 20 ul PBS ve görüntü floresan mikroskobu kullanarak cihazı.
5. Harcanan ortam toplamak ve hücre fonksiyonunu belirlemek için, kültür süresi boyunca uygun zaman noktalarında hücresel metabolik ürünlerini ölçmek. Hepatositler için, harcanan ortam içinde albumin ve üre miktarını ölçer.
6. Böyle değerlendirmek enzim aktivite düzeyleri, antikor boyama ya da RNA analiz gibi hücreler kendilerini, üzerinde son nokta fonksiyonel analizler gerçekleştirin. Hepatositlerde için, neden ve sitokrom P450 enzim faaliyetleri veya faz II konjugasyon enzim glutatyon S-transferaz ölçün.

Sonuçlar

Yerli kollajen tabakası-katman birikimi kullanmak için polikatyonik ve polianyonik kollajen çözümleri oluşturmak için metilasyon ve succinylation kullanılarak değiştirilebilir. Succinylation sukkinil grupları ile nativ kollajen ε-amino grupları değiştirir ve metilasyon, bir metil grubu (Şekil 1A) ile saf kollajenine karboksil gruplarını değiştirir. Kollajen proteini amino asit yan zincirlerine Bu modifikasyonlar çözeltiler pH titrasyon eğrilerini değiştirebilir. Metilasyon, amino grupları üzerinde hiçbi...

Tartışma

Ultra ince saf kolajen düzenekleri değiştirilmiş kolajenlerin katman-katman birikimi ile şarj hücreleri veya malzeme yüzeylerinde yatırılabilir. Bu çalışmanın sonuçları, metilasyon ve yerli kolajen succinylation hücreleri (Şekil 2) ile ilgili ultra ince kollajen matris, derlemeleri yatırmak için katman-katman tekniği kullanılabilir (Şekil 1) ve diğer yüklü polikatyonik ve polianyonik kolajen çözümleri oluşturmak göstermektedir Malzeme yüzeyler. Böyle ultra ince matris tabakaları hepatos...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
kollajen tip I, sıçan kuyruğu	Yaşam Teknolojileri	A1048301	konsantre sıçan kuyruğu kollajen
tip I, sıçan kuyruğu	sıçan kuyruğu kollajen	Sigma-Aldrich	C3867-1VL
, sıçan kuyruğu	EMD Millipore	08-115	konsantre sıçan kuyruğu kollajen
kollajen tip I, sıçan kuyruğu	için seçenek R%D Sistemleri	Konsantre	sıçan kuyruğu kollajen
	Sigma-Aldrich	239690-50G	süksinilasyon reaktifi
susuz metanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	metilasyon reaktifi
sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH çökeltme reaktifi
hidroklorik asit	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH çökeltme reaktifi
sıçan kollajen tip I ELISA	Chondrex	6013	kollajen içeriğini tespit etmek için seçenek
hidroksiprolin tahlil kiti	Kollajen içeriğini tespit etmek için	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT
hidroksiprolin tahlil kiti	Kollajen içeriğini tespit etmek için	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1