Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Biyomoleküllerin Geçici olarak Kontrollü Release için Yüzey Polielektrolit Elyaf Kompozit Yapı iskeleleri

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53079

⸱

19 Ağustos 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Bu makalede

Özet

Doku mühendisliği için iskeleler, hücresel nişin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel mikro çevresini özetlemelidir. Burada, sürekli biyokimyasal salınımlı kompozit, çok bileşenli polimerik iskeleler oluşturmak için bir platform olarak arayüzey polielektrolit kompleksleştirme liflerinin kullanımını gösteriyoruz.

Özet

Doku mühendisliğinde kullanılan çeşitli iskeleler, fizyolojik hücre nişini taklit etmek için kontrollü bir biyokimyasal ortam gerektirir. Arayüzey polielektrolit kompleksleştirme (IPC) lifleri, küçük moleküllü ilaçlar, hücreler, proteinler ve büyüme faktörleri gibi çeşitli biyolojik ajanların kontrollü bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. IPC liflerinin yapımındaki metodolojinin basitliği, kontrollü biyomolekül dağıtımı için uygulamasında esneklik sağlar. Burada, çok bileşenli bir kompozit iskele oluşturmak için IPC liflerini hidrofilik polisakkarit ve hidrofobik polikaprolakton olmak üzere iki farklı polimerik iskeleye dahil etme yöntemini açıklıyoruz. IPC liflerinin bu polimerik yapılara kolayca gömülebileceğini, biyomoleküllerin sürekli salınım ve daha iyi korunma kabiliyetini artırdığını gösterdik. Ayrıca, hücre davranışı üzerinde sinerjik etkilere sahip olabilecek topografik ipuçları ve sürekli biyokimyasal salınım ile kompozit polimerik bir iskele oluşturduk. IPC lifli kompozit polimerik iskeleler, hücresel nişi yeniden yaratmanın yeni ve basit bir yöntemini temsil eder.

Giriş

Hücre dışı matris, hücre davranışlarını yönlendiren doğal biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarına sahiptir. Bu fizyolojik üç boyutlu (3D) mikro ortamı taklit etmek, rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamaları için geniş çapta araştırılmış bir stratejidir. Örneğin, hem doğal olarak türetilmiş hem de sentetik substratlar, biyofiziksel hücresel ortamı taklit etmenin bir yolu olarak topografik ipuçlarıyla modifiye edilmiştir. 1 Örneğin, polikaprolakton (PCL) iskeleleri, desenli PDMS alt tabakaları üzerine dökülerek kolayca desenlenebilir. 2 Bununla birlikte, çoğu sentetik iskele, kontrollü biyokimyasal ortamı in vivo olarak yetersiz bir şekilde özetlemektedir.Sentetik malzemelerin toplu veya yüzey modifikasyonu, yalnızca hücre bağlanması için biyokimyasal ipuçları sunar, ancak yine de biyokimyasal dağıtımın zamansal düzenlemesinden yoksundur. 3 Bu nedenle, hücre dışı matrisin zamansal olarak düzenlenmiş biyokimyasal dağıtım sistemini taklit edebilen optimal iskelelere ihtiyaç vardır.

Mikroküreler gibi biyokimyasal dağıtım sistemleri, çok aşamalı sentez sürecinin ciddiyeti ve karmaşıklığı nedeniyle biyoaktivite kaybı ve düşük birleştirme verimliliği sorunlarıyla boğuşmaktadır. 4-6 Tek adımlı bir fabrikasyon ve birleştirme yöntemi kullanan alternatif yöntemlerin, dahil etmede verimsizlik ve biyoaktivite kaybı olmaksızın uygun bir biyokimyasal mikro çevre yaratma konusunda mükemmel bir potansiyele sahip olduğu kanıtlanmıştır. Uygulanabilir bir çözüm, biyolojik ajanları iletmek ve korumak için arayüzey polielektrolit kompleksleştirme (IPC) liflerinin kullanılmasıdır. İki zıt yüklü polielektrolit sulu çözelti bir araya getirildiğinde, IPC lifleri arayüzden çekilebilir. Sulu çözelti içindeki hemen hemen her tür hidrofilik biyomolekül, negatif veya pozitif yüklü polielektrolit çözeltisine eklenebilir, böylece kompleksleştirme işlemi sırasında yararlı biyomoleküllerin IPC elyafına dahil edilmesini kolaylaştırır. Ayrıca, bu işlem sadece sulu ve ortam koşulları gerektirir, böylece biyoaktivite kaybı riskini azaltır. Bu yöntem kullanılarak, aktif büyüme faktörleri2,7 hatta hücreler8,9 başarıyla verilmiştir. Ek olarak, IPC lifleri oluşturmanın basit yöntemi, herhangi bir şekle veya yöne kalıplamaya izin verir. Bu tür liflerin stabilitesi, kompozit iskeleler oluşturmak için hem hidrofobik2 hem de hidrofilik polimerlere7 dahil edilmesinde avantajlı olmuştur. IPC lifli bu kompozit iskeleler, hücreler için fiziksel ankraj sağlarken fizyolojik olarak ilgili bir biyokimyasal ortam oluşturmak için faydalıdır.

Bu çalışmada, aktif biyomoleküllerin kontrollü salınımı için IPC liflerini topografyaya sahip hidrofilik ve hidrofobik bir iskeleye dahil etmek için bir yöntem gösteriyoruz. Kavram kanıtı olarak, kitosan ve aljinattan yapılmış IPC liflerini biyouyumlu, immünojenik olmayan ve antijenik olmayan pullulan-dekstran hidrofilik hidrojele veya biyouyumlu polikaprolakton hidrofobik iskeleye dahil ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Polielektrolit Çözümleri 1. Hazırlanması

  1. Liao ve ark ayrıntılı olarak, kitosan saflaştırılır. Kısaca, bir% 1 oluşturmak% 2 çitosan solüsyonu (w / v) (hacim / hacim) asetik asit ve vakum filtre notu 93 filtre kağıdı kullanılarak. PH 10 dakika boyunca 1.200 xg'de 7. Santrifüj çöktürülmüş kitosan stabilize kadar 5M NaOH kullanılarak süzüntü nötralize eder. Süpernatant boşaltacaktır ve kitosan yıkamak için deiyonize su ilave edilir. Santrifujleme ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın. Saflaştırılmış biçimini elde etmek üzere -80 ° C ve liyofilize edilir, O / N oranında çöktürüldü kitosan dondurun. Bir nemi kabine saflaştırılmış kitosan saklayın.
  2. Steril doku kültürü kabına saflaştırılmış kitosan 1 gr tartılır. Biyolojik güvenlik kabinine UV lambası mümkün olduğu kadar yakın bir doku kültürü çanağı içinde kitosan yerleştirin ve 15 dakika boyunca UV ışığına maruz kalmaktadır. Steril forseps kullanılarak bir cam kap içine steril kitosan yerleştirin. Çözündürün çitosan 0 süzüldü kullanılarak.% 0.5 ve% 1 arasında bir nihai konsantrasyona kadar 15M asetik asit (a / h).
  3. Alginik asit, sodyum tuzu 0.1 g tartılır ve (ağırlık / hacim) çözeltisi bir% 1 elde etmek üzere iyondan arındırılmış (DDI), su damıtılmış, 10 ml içinde çözülür. Tam çözünmeyi temin etmek amacıyla vorteks karıştırıcıda, en azından 2 saat boyunca alginik asit sodyum tuzu karıştırın. 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir aljinat çözeltisi filtre. 4 ° C 'de aljinat çözeltisi saklayın.
  4. Üretici tarafından tavsiye edilen şekilde, sinir büyüme faktörü (NGF), - örneğin vasküler endoteliyal büyüme faktörü (VEGF) veya beta insan rekombinant büyüme faktörleri sulandırın.

IPC Elyaf 2. Çizim

  1. Benzer bir net yüke sahip polielektrolit çözeltisi 10-20 ul kısım halinde proteinleri, büyüme faktörleri veya diğer biyomoleküllerin karıştırın. Net bir negatif yük (örneğin bovin serum albümini [BSA]) ile Biyolojik moleküller aljinat çözeltisi ile karıştırılır. Net pozitif şarj (örn VEGF) ile Biyolojik moleküller ile karıştırılmalıdırçitosan solüsyonu.
  2. Parafilm ile kaplı olan bir sabit ve düz bir yüzey üzerinde çitosan ve aljinat az miktar (10-20 ul) yerleştirin. çitosan ve aljinat damlacıkları yakın yerleştirilir fakat birbiri ile temas halinde olmalıdır.
  3. Hafifçe kitosan ve aljinat damlacıklar halinde forseps bir çift her ucu batırın. Birlikte forseps kısma polielektrolitlerin damlacıklar getirin. Damlacıklarının birbirleriyle temas olduğunda, yavaş yavaş iki damlacıkları (Şekil 1A) arabiriminden IPC fiber çekmek için yukarı dikey forseps çekin.
  4. Dikkatli bir şekilde dönen mandrel üzerine yapıştırılmış düz bir polimerik iskele olarak bir koleksiyoncu, forseps üzerine çizilen IPC fiberin ucunu yerleştirin (bkz bölüm 3 ve 4). Üniform ve IPC elyaf beadless oluşumuna izin vermek için 10 mm / sn arasında sabit bir hızda mandrel döndürün. Dahil bir patlama salınımına neden olur boncuk oluşturacak IPC lifleri çekme hızını artırmakbiyokimyasal ve erken fiber sonlandırma. 10
  5. Dahil etkinliğini belirlemek için, geri kalan tüm sıvılar 1X fosfat tamponlu salin içinde 500 ul (PBS) ile sulandırarak parafilm sol toplar. BCA (BSA) deneyi (VEGF ve NGF için) ELISA veya dahil biyomolekülün tespit etmek için uygun bir tahlil ile artığında protein ya da büyüme faktörü içeriğini ölçmek.

Kompozit Hidrojel Pullulan-Dextran'ın İskele (PD) Polisakkarit ve IPC Elyaf 3. Fabrikasyon

  1. IPC elyaf toplama gözden çıkarılabilir pullulan çerçeve Fabricating
    1. Pullulan polisakarit tartılır ve (ağ / hac), sulu çözelti% 20 oluşturmak için damıtılmış iyonu giderilmiş (DDI), su ile karıştırılır. Homojenliği sağlamak için pullulan çözüm O / N karıştırın.
    2. 10 cm çaplı doku kültür polistiren (TCPS) çanak içine pullulan çözeltisi 15 g Cast. 37 ° C'de pullulan çözeltisi O / N kurutun. 7 içine pullulan filmleri kesinmm 7 mm kare kare x.
  2. Pullulan-dekstran polisakarit çözeltisi hazırlanması
    1. Bir% 30 oluşturmak polisakaritlerin çözeltisi pullulan ve dekstran (w / v): DDI su (3: 1 oran). Polisakarit çözeltisi homojenliği sağlamak için O / N karıştırın. Yavaş yavaş% 20 bir son konsantrasyon elde etmek için polisakarit çözeltisine sodyum bikarbonat eklemek (a / h). Çözeltinin homojenliği sağlamak için O / N karıştırın. 4 ° C'de polisakarit çözeltisi saklayın.
  3. Pullulan çerçeve üzerinde IPC lifleri Toplama
    1. Bir timsah klibi kullanarak kurban pullulan çerçevesi (bölüm 3.1) yapıştırın. Plastik kaplamalı yapışkan bant kullanılarak döner mandrel ucunda timsah klibi ve pullulan çerçeveyi yapıştırın. 10 mm / sn arasında sabit bir hızda yapıştırılmış çerçeve ile mandrel döndürün. pullulan çerçevesi istenilen yönlerde dönen mandrel üzerine yapıştırılmış olabilir.
  4. Bir forseps çifti (bölüm 1) ve ATTAC kullanarak IPC lifleri Beraberlikh dönen pullulan çerçeve üzerine IPC liflerinin çizilmiş sonu. Sabit bir hızda IPC lifleri çizin. IPC fiber terminal sonuna ulaştıktan sonra, N oda sıcaklığında / fiberler-on-frame yapısı O kurulayın.
  5. PD hidrojel iskele içine IPC lifleri gömülmesi
  6. . (W / v) sodyum sulu çözeltisi ve 100 ul 10M sodyum hidroksit trimetafosfat% 11, 100 ul, pullulan-dekstran çözeltisinin, her gram çapraz bağlanması 7 1-2 dakika boyunca, bir stirplate kullanılarak 60 rpm'de çözelti karıştırın. Sodyum trimetafosfat ve sodyum hidroksit ilave edildikten sonra, polisakarit çözeltisi hemen çapraz olacaktır. IPC lifleri tamamen gömmek için lifler-on-frame yapı üzerine viskoz polisakkarit solüsyonu dökün. Kimyasal olarak çapraz bağlanmış kompozit iskeleleri (Şekil 1B) oluşturmak için 30 dakika boyunca 60 ° C de bir araya pullulan-dekstran-IPC lifler (PD-IPC) inkübe edin.
  7. DİKKAT: davlumbaz adım 3.3.2 uygulayın ve uygun koruyucu equi kullanınasetik asit gibi pment aşındırıcı ve yanıcı bir olduğunu.
  8. PD-IPC iskele gözenek oluşumunu teşvik etmek için, 20 dakika boyunca% 20 (ağırlık / hacim) asetik asit bütün iskele daldırın.
  9. 100 rpm ile çalkalanarak bir 5 dakika boyunca 1X PBS içinde yıkama PD-IPC iskeleler, reaksiyona girmemiş reaktifleri çıkarın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
  10. Aşırı PBS çıkarın ve hemen -80 ° CO / N de PD-IPC iskeleleri dondurma. Iskeleleri herhangi kontrollü salım veya biyoaktivite tahlillerinde kullanımdan önce en az 24 saat liyofilize.

PCL ve IPC Elyaf Kompozit Scaffold 4. Fabrikasyon

DİKKAT: Diklorometan tehlikeli bir malzemedir. Diklorometan işlerken davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman kullanın.

  1. Bozulmamış ve desenli PDMS yüzeylerde oluşturma
    1. Yumuşak litografi süreci kullanılarak istenilen boyut TCP'lerin bir parça kullanarak bir bozulmamış polidimetilsiloksan (PDMS) Elastomerik tabaka oluşturun. Patte oluşturİstenilen topografya ile şablonları poli (metil metakrilat) standart yumuşak litografi yöntemleri kullanarak rned PDMS substratlar. 12
  2. IPC elyaf toplama gözden çıkarılabilir PCL çerçeve Fabricating
    1. PCL tartılır ve (ağırlık / hacim) çözeltisi bir% 0.9 oluşturmak için diklorometan içinde çözülür. PDMS alt-tabakanın her 1 cm2 bir alan için,% 0.9 PCL çözeltisi 500 ul bırakın. Tam ile duman davlumbazında buharlaşmaya diklorometan çözücü tüm izin verir. Istenilen kalınlıkta filmi kalınlaşmasına% 0.9 PCL döküm işlemi tekrarlayın. PDMS substrat kurutulmuş PCL filmi çıkarın. Bir uygun boyutlu zımba kullanılarak PCL çerçeve içinde bir delik oluşturur. 2
  3. PCL çerçeve üzerinde IPC lifleri Toplama
    1. Bir timsah klibi (4.2.1 itibaren) delik ile kurbanlık PCL çerçeveyi yapıştırın. Plastik kaplamalı yapışkan bant kullanılarak dönen mandrel üzerine timsah klibi yapıştırın. PCL Fram üzerine IPC fiber çekilmiş ucunu10 mm / sn (bölüm 2) sabit bir hızda dönme başlamadan önce ör. IPC elyaf çekme sona ermesinden sonra, fiber üzerinde çerçeve yapısı göre O / N 4 ° C'de kurutun.
  4. Fiber-on-frame desenli PCL alt tabaka içine inşa gömülmesi
    1. Gerektiği gibi, tertemiz bir ya da desenli PCL tabanı oluşturmak için PDMS substrat üzerine% 0.9 PCL çözeltisi 500 ul bırakın. İstenilen kalınlıkta bir iskele elde etmek için% 0.9 PCL çözümünün çoklu katmanlar Cast. Tam ile duman davlumbazında buharlaşmaya diklorometan çözücü tüm izin verir.
    2. PCL tabanı üzerine elyaf üzerinde çerçeve yapısı (bölüm 4.3.1) yerleştirin. İstenilen kalınlık elde etmek için fiber-on-frame inşa birden çok kez% 0.9 PCL çözüm ekleyin ve tamamen PCL-IPC kompozit iskele (Şekil 1C) imalatı, IPC lifleri gömün.

Kompozit IPC Yapı iskeleleri Biyolojik Ajanlar Yayın 5. Ölçüm

  1. Yeri kompozit PD-IPC veyaPCL-IPC iskeleleri ve stand-alone IPC lifler ayrı bir 24 plaka.
  2. Iskele daldırın ve stand-alone IPC lifleri 1X PBS 500 ul. 37 ° C'de inkübe edin. Çeşitli zaman noktalarında (salım ortamı) PBS toplayın ve 1X 500 ul PBS ile değiştirin.
  3. Dahil biyomolekülün kümülatif salım profilini hesaplamak için bir BCA tahlili (BSA), ELISA (VEGF ve NGF) ya da diğer uygun bir deney kullanılarak salım ortamı protein ya da büyüme faktörü miktarını ölçün.

Kompozit IPC iskelelerinin üzerinde Hücreleri 6. Tohum Çıkış Biyolojik Ajanlar biyoaktivitesini Test

  1. En az 20 dakika süreyle biyolojik güvenlik kabini UV ışık kullanılarak liyofilize PD-IPC veya PCL-IPC kompozit iskeleleri sterilize edin.
  2. 200 ul büyüme ortamı içinde 2 x 10 5 hücre, bir hücre süspansiyonu elde etmek için, standart hücre kültürü teknikleri kullanarak. Kompozit iskeleleri üzerine konsantre hücre süspansiyonu Tohum. After 20 dakika, tam iskeleler batırmak için büyüme ortamı kontör hacmi.
  3. Böyle Alamar mavisi metabolik aktivite deneyi, PC12 neurite akıbet tahlil ya immünofloresan gibi standart teknikler yoluyla hücre aktivitesini ölçmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu makalede, çeşitli biyomoleküllerin sürekli salınması için IPC lifleri ile kompozit iskeleleri yaratmaya çalıştı. Bu çalışmada kullanılan ve biyomoleküllerin özellikleri Tablo 1 'de görülmektedir. IPC lifler önce bir PD-IPC kompozit iskeleti (Şekil 1B) oluşturmak için bir hidrofilik PD hidrojel içine yerleştirilmiştir. Model molekülü BSA ilk kontrollü biyomolekülün serbest bırakılması için bir kompozit iskele kullanarak fizibilitesini belirlemek için test edilmiştir. BSA 45 ± 0.97...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

IPC lifler, iki bir birbirine zıt yüklü polielektrolitlerin etkileşimi ile oluşturulmaktadır. işlem stabil lif oluşumu için bir kendi kendine-montaj işlemi kolaylaştırmak polielektrolitlerin arayüzünden kompleksinin çıkarma kullanmaktadır. IPC elyaf formasyonu mekanizması, benzer yüklü polielektrolit kompleks işlemi sırasında dahil edilebilir herhangi bir biyomolekül ilave sağlar. 10,11 Bunun aksine, bir birbirine zıt yüklü polielektrolit bir biyo-molekülün eklenmesi anında çökelti oluşturmasına neden olur. I...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu eser Mükemmeliyet onun Araştırma Merkezleri, mechanobiology Enstitüsü, Singapur biri tarafından yönetilen Singapur Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. MFAC 1122703037. BKKT mechanobiology Enstitüsü tarafından desteklenen Araştırma Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı (Singapur) ve Ulusal Ajans (Fransa) projesi numarası altında ortak program tarafından desteklenmektedir. Biz kanıt okuma video yapımında yardımcı olmak için el yazması ve Bayan Şafak JH Neo Sayın Daniel HC Wong teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Pullulan Hayashibara Inc Okayama JaponyaMolekül ağırlığı (MW) 200 kDa. Bu malzeme, pullulan çerçeveleri ve PD-IPC iskeleleri yapmak için kullanılan farmasötik sınıf pullulandır.
DekstranSigma AldrichD1037MW 500 kDa. Bu malzeme artık Sigma Aldrich tarafından üretilmiyor. Önerilen alternatif katalog numarası 31392'dir (Sigma Aldrich). Bu malzeme PD-IPC iskeleleri yapmak için kullanılır.
Sodyum Bikarbonat Sigma AldrichS5761Sodyum bikarbonat, pullulan-dekstran polisakkarit çözeltisine yavaşça eklenmelidir. Hızlı sodyum bikarbonat ilavesi çökelmeye neden olur.
Sodyum TrimetafosfatSigma AldrichT5508Bu kimyasal higroskopiktir ve nem alma kabininde saklanmalıdır. Sulu sodyum trimetafosfat çözeltisi her zaman taze yapılmalıdır.
Sodyum HidroksitSigma AldrichS5881Bu malzeme tehlikelidir ve nitril eldiven gibi uygun koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır.
KitosanSigma Aldrich448877MW 190-310 kDa. Asetilasyon derecesi% 75 ila% 85. Kararlı IPC lifleri oluşturmak için kitosanın saflaştırılması gerekir.
Asetik AsitMerckBu, başka bir marka türü ile değiştirilebilir. Bu malzeme aşındırıcı ve yanıcıdır. Bu kimyasalı çeker ocakta tutarken yüz siperi, nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve galoş gibi koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.
Kahverengi alglerden elde edilen aljinik asit sodyum tuzu, düşük viskoziteliSigma AldrichA2158Gece boyunca suda çözünür. Steril 0.2  ile süzün; &mikro; Kullanmadan önce m şırınga filtresi. 4 ° C'de saklayın.
Sığır Serumu AlbüminiSinopharm Kimyasal ReaktifSteril PBS'de çözün ve 0.2 & mikro kullanarak süzün; kullanmadan önce m şırınga filtresi.
BCA test kitiPierce23225Bu kit, PD-IPC iskelelerinden BSA salınımını ölçmek için kullanılmıştır.
İnsan Rekombinant Vasküler Endotelyal Büyüme FaktörüR& D sistemleri293-VEBüyüme faktörünü% 0.2 heparin çözeltisi içinde 5 'lik bir nihai konsantrasyona çözün; mg/ml'dir.
Sigma AldrichH3393'tenHeparin Sodyum TuzuBu, başka bir marka türü ile değiştirilebilir. Heparin tuzunu steril suda% 1'lik bir nihai konsantrasyonda çözün ve 0.2 & mikrodan süzün; kullanmadan önce m şırınga filtresi.
İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC)LonzaC2517ABu birincil hücre tipi, PD-IPC iskelelerinden salındıktan sonra VEGF biyoaktivitesini belirlemek için testte kullanıldı.
Alamar mavisiYaşam TeknolojileriDAL1025Bu, hücre metabolik aktivitesini ölçmek için kullanılır. Alamar mavisini hücrelerle inkübe edin ve standart hücre kültürü koşullarında 2 ila 4 saat koruyun. Hücre aktivitesi ile ilişkili olan Alamar mavisi yüzde azalmasını belirlemek için 570 nm'de absorbansı ölçün.
ScanVac Coolsafe LiyofilizatörLabogene7.001.200.060Bu, -105 ila -110 ° C'de çalışan, programlanamayan bir dondurarak kurutucudur; °C. Bu, diğer standart laboratuvar liyofilizatörleri ile değiştirilebilir.
Polikaprolakton (PCL)Sigma Aldrich181609MW 65 kDa. Bu artık Sigma Aldrich tarafından üretilmiyor. Bu, Sigma Aldrich katalog numarası 704105 ile değiştirilebilir.
DiklorometanSigma AldrichV800151Bu, başka bir marka türü ile değiştirilebilir. Bu malzeme tehlikelidir ve çeker ocakta kullanılmalıdır. Bu kimyasalla çalışırken her zaman koruyucu ekipman giyilmelidir.
Polidimetilsiloksan (PDMS; 184 Silikon Elastomer Kiti)Dow Corning(240)4019862Elastomer kiti, polimer baz ve çapraz bağlayıcı ile birlikte gelir. Polimer bazının ve çapraz bağlayıcının farklı oranlarda karıştırılması, PDMS'nin farklı sertliğine neden olacaktır.
İnsan Rekombinant Beta-Sinir Büyüme Faktörü (NGF)R& D sistemleri256-GFSteril DI suda 100 > nihai konsantrasyona kadar sulandırılmıştır; &mikro; g⁠/⁠ml. Aliquot ve -20 &°C'de mağaza; Kullanana kadar C.
İnsan Mezenkimal Kök Hücreleri (hMSC)CambrexBu hücre tipi, NGF ve nanotopografinin sinerjik etkisini belirlemek için testte kullanıldı.
Sıçan PC12 Feokromasitoma Hücreleri ATCC: Bu hücre tipi, NGF'nin biyoaktivitesini belirlemek için nörit büyüme testinde kullanıldı. NGF ile salınan ortama maruz kaldıktan sonra, nörit uzantılı hücre sayısını ölçün ve toplam hücre sayısını normalleştirin.
93. sınıf filtre kağıdıWhatmanZ699675Bu, pH & nbsp; 7'de sodyum hidroksit ile çökeltildikten sonra kitosanın saflaştırılması için kullanılır.
Salıncak kovalı santrifüjEppendorf5810RKitosanın 1.200 x g hız kullanılarak saflaştırılması sırasında kullanılır.
Sabit hızda dönen mandrelli motorRhymebusRM5EMotor, pullulan veya PCL çerçevesi üzerinde IPC liflerinin imalatı için kullanılır.
Fosfat tamponlu salinFirstBaseFiltrasyon yoluyla sterilize edin (0.2 & m filtre) ve otoklav. 
10 mm çapında Doku Kültürü Polistiren Kabı (TCPS)GreinerTCPS kabı, pullulan çerçevenin dökümü için kullanılır.
İnsan VEGF ELISA kitiAr-Ge D sistemleriDVE00ELISA kiti, salım ortamında VEGF'nin tespiti için kullanılır.
İnsan NGF ELISA kitiR& D sistemleriDY256ELISA kiti, salım ortamındaki NGF'yi tespit etmek için kullanılır.
Plastik Kaplı Yapışkan BantBel-Art9040336Yapışkan bant, timsah klipsini dönen mandrele güvenli bir şekilde yapıştırmak için kullanılır
Porcine

Kaynaklar

  1. Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  2. Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
  3. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  4. Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
  5. Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  6. King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
  7. Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
  8. Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
  9. Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
  10. Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
  11. Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
  12. Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
  13. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
  14. Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
  15. Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
  16. Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
  17. Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
  18. Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
  19. Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
  20. Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353(2013).
  21. Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165(2005).
  22. Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
  23. Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
  24. Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
  25. Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kontrollü Biyomolekül SalınımıKompozit Polimerik İskelelerFedai İskeletIPC Fiber OluşumuPolisakkarit İskelePolikaprolakton İskeleSürdürülebilir SalınımTopografik İşaretlerBiyomolekül Korunumu
Biyomoleküllerin Geçici olarak Kontrollü Release için Yüzey Polielektrolit Elyaf Kompozit Yapı iskeleleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.