Yöntem makalesi

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

21.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53085

⸱

7 Ekim 2015

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Özet

İnsan eklem kıkırdağı hasara karşı oldukça hassastır ve sınırlı kendi kendini onarma ve yenilenme potansiyeline sahiptir. Kıkırdak dokusunu tasarlamak için hücre bazlı stratejiler, eklem kıkırdağını onarmak için umut verici bir çözüm sunar. Doku onarımı için en uygun hücre kaynağını seçmek için, doku mühendisliği kıkırdağında farklı hücre kaynakları tarafından yapılan biyolojik ve biyomekanik farklılıkları sistematik olarak incelemek için uygun bir kültür platformu geliştirmek önemlidir. Burada juvenil, yetişkin ve osteoartritik (OA) kondrositlerin kıkırdak rejenerasyon potansiyelini sistematik olarak incelemek için üç boyutlu (3D) bir biyomimetik hidrojel kültür platformu uyguladık. 3D biyomimetik hidrojel, kondrositlerin in vitro kültürü için fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortam sağlayan sentetik bileşenli poli (etilen glikol) ve biyoaktif bileşenli kondroitin sülfattan oluşuyordu. Ek olarak, iskele potansiyel olarak in vivo kıkırdak onarımı için hücre iletimi için kullanılabilir. İskelede tasarlanan kıkırdak dokusu, kantitatif gen ekspresyonu, immünofloresan boyama, biyokimyasal testler ve mekanik testler kullanılarak değerlendirilebilir. Bu sonuçları kullanarak, hem gen ekspresyonu düzeyinde hem de tasarlanmış kıkırdak dokusunun biyokimyasal ve biyomekanik özelliklerinde, değişen yaşlardaki kondrositlerin diferansiyel rejeneratif potansiyelini karakterize edebildik. 3D kültür modeli, normal veya anormal gelişimin farklı aşamalarından kondrositler ve progenitör hücreler arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları araştırmak için uygulanabilir.

Giriş

Sınırlı kendi kendini onarma potansiyeli ile insan eklem kıkırdağı sık sık geri dönüşü olmayan hasarlara uğrar. Şu anda eklem kıkırdağı yaralanmalarının tedavisi için verimli hücre bazlı yaklaşımların geliştirilmesine yönelik kapsamlı çabalar odaklanmaktadır. Bu hücre bazlı tedavilerin başarısı, büyük ölçüde optimal bir hücre kaynağının seçimine ve rejeneratif potansiyelinin korunmasına bağlıdır. Kondrositler, kıkırdak onarımı için yaygın bir hücre kaynağıdır, ancak tedarikleri sınırlıdır ve 2D tek katmanlı kültürde in vitro genişleme sırasında farklılaşabilirler, böylece hiyalin kıkırdak 1 oluşumunu sınırlarlar.

Bu protokolün amacı, farklı yaş ve hastalık durumlarından insan kondrositlerinin in vitro karşılaştırmalı bir çalışması için 3 boyutlu bir hidrojel platformu oluşturmaktır. Geleneksel iki boyutlu (2D) kültürün aksine, üç boyutlu (3D) hidrojeller, kondrositlerin morfolojilerini ve fenotiplerini korumalarına izin verir ve kondrositlerin kıkırdak dokusu üretmesini sağlayan fizyolojik olarak ilgili bir ortam sağlar 2,3. Kondrosit kültürü için 3 boyutlu bir fiziksel yapı sağlamanın yanı sıra, hidrojeller doğal kıkırdak hücre dışı matrisin (ECM) işlevini taklit eder. Spesifik olarak, kondroitin sülfat metakrilatın dahil edilmesi, salgılanan parakrin faktörler 4 için potansiyel bir rezervuar sağlar ve hücre aracılı bozunma ve matris döngüsü 5 sağlar. Agaroz ve aljinat jeller dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda birçok 3D hidrojel kültür sistemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kondrosit kültürü için bazı belirgin avantajları olan biyomimetik bir 3D kültür sistemi kullandık. Kondroitin sülfat (CS), eklem kıkırdağında bol miktarda bulunan bir bileşendir ve PEG-CS hidrojellerinin kondrojenik fenotipi koruduğu ve hatta arttırdığı ve hücre aracılı matris bozunmasını ve dönüşümünü kolaylaştırdığı gösterilmiştir 2,5. Ek olarak, hidrojel iskelenin mekanik özellikleri, PEG konsantrasyonunun değiştirilmesiyle kolayca modüle edilebilir ve bu nedenle kondrositlerin veya ilgili bir hücre tipinin 6,7 rejenerasyon potansiyelini daha da arttırmak için kullanılabilir. PEG / CSMA ayrıca biyouyumludur ve bu nedenle örneğin kıkırdak defektlerinde doğrudan bir klinik uygulama potansiyeline sahiptir. Bu sistemin sınırlaması, karmaşıklığı ve agaroz gibi daha basit sistemlere kıyasla hücre canlılığını potansiyel olarak etkileyebilecek fotopolimerizasyonun kullanılmasıdır, ancak kondrosit kültürünün avantajları potansiyel sınırlamalardan daha ağır basmaktadır.

3D hidrojel kültürü, hücre fenotipinin (gen ekspresyonu, protein immün boyama) ve fonksiyonel sonucun (kıkırdak matrisi üretiminin miktar tayini, mekanik test) değerlendirilmesi için geleneksel testle uyumludur. Bu elverişli 3D ortam, uzun süreli 3D kültürlerde üç farklı yaşlı popülasyondan insan kondrositlerinin doku rejenerasyon potansiyelini karşılaştırmak için test edildi.

Sonuçlar hem fenotipik hem de fonksiyonel testlerle değerlendirildi. Juvenil, erişkin ve OA kondrositler, 3D biyomimetik hidrojel kültüründe farklı yanıtlar gösterdi. 3 ve 6 hafta sonra, kondrojenik gen ekspresyonu juvenil ve yetişkin kondrositlerde yukarı regüle edildi, ancak OA kondrositlerinde aşağı regüle edildi. Agrekan, tip II kollajen ve glikozaminoglikan (GAG) dahil olmak üzere kıkırdak dokusu bileşenlerinin birikimi juvenil ve yetişkin kondrositler için yüksekti, ancak OA kondrositleri için yüksek değildi. Ortaya çıkan kıkırdak yapılarının basınç modülleri de benzer eğilimler sergiledi. Sonuç olarak, hem juvenil hem de erişkin kondrositler, hidrojellerde 6 haftaya kadar 3D kültürde kondrojenik ve kıkırdak matriks eğilimi sergiledi. Buna karşılık, osteoartritik kondrositler, kıkırdak fenotip kaybı ve sağlam kıkırdak oluşturma konusunda minimal yetenek ortaya çıkardı.

Protokol

Tüm deneyler Stanford Üniversitesi İnsan deneklerin esaslara uygun olarak yapılır ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu protokolü onaylandı.

1. Eklem Kondrosit İzolasyonu

  1. Total diz protezi sırasında atılan doku kıkırdak edinin ve daha önce 8 açıklandığı gibi teşrih.
  2. Görme pürüzsüz yüzeyler için kıkırdak örneklerinin medial veya lateral femoral kondilleri seçin ve subkondral kemik etkilemeden 4-5 mm kıkırdak biyopsi kaldırmak için bir neşter ile kıkırdak yüzeyinde kesi yapmak.
  3. Arıtılmış kollajenaz ile O / N tedavi ile doku enzimatik ayrışma ile hücre dışı matris kondrositler izole edin. 37 ° C 'de, kondrosit büyüme ortamı kollajenaz II (125 U / ml) ve kollajenaz IV (160 U / ml) 1: 1'lik kullanın.
  4. Ertesi gün, 70 ile ayrışmış hücreleri ihtiva eden sindirilir doku filtremm boyut Naylon örgü gözenek. 5 dakika boyunca 600 x g'de DMEM / F12 ve santrifüj 20 ml ile iki kez yıkayın.
  5. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM / F12 içinde yeniden süspansiye, 25 ug / ml askorbat, 2 mM L-glutamin, antimikrobik maddeler, aşağıdaki 1 x 10 6 hücre / 60 mm kültür çanağı yoğunluğunda izole kondrositler Plate (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml fungizon). Önceki biomimetic hidrojeller kapsülleme 37 ° C'de plakaları tutun ve yüksek yoğunluklu bir tek tabaka olarak birincil kondrosit kültürleri korumak.

2. Biyomimetik Hidrojel Fabrikasyon

Not: Bu yöntem sağlar poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), DPBS kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ihtiva eden bir biomimetik hidrojel sentezi. Foto-başlatıcı eklenmesi fotoaktif çapraz bağlanmasını sağlar. Nihai hidrojel bileşimi% 7 tartmak içeriyort / hacim (a / h) PEGDA bölgesinin% 3 CS-MS w / v, ve ışık başlatan a / h% 0.05.

  1. Metakrilat grupları ile CS polimerin işlevselleştirilmesiyle CS-MA sentezlemek.
    1. MES 1,952 g deiyonize su, 200 ml NaCl 5,84 g (dihidroksi 2 O) eritilmesi ile 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic asit (MES) ve 0.5 M sodyum klorür (NaCl) tamponlu çözeltisi hazırlayın. Tamponlu çözelti içinde kondroitin sülfat, sodyum tuzu, 5 g çözündürülür.
    2. (: EDC = 1: 2 NHS mol oranı) 0,532 g (4,62 mmol) N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 1,771 g (9,24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidroklorür (EDC) ilave 5 dakika boyunca çözeltisi ve bir karıştırma.
    3. Çözeltisine ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon sıcaklığı (: 2: 1: EDC: AEMA = 1 NHS molar oranı) 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetil metakrilat (AEMA) ekleyin.
    4. Diyaliz tüpüne (12-14 kDa'lık bir MWCO) kullanılarak, 4 gün boyunca iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz (diH 2 O) karışımın saflaştınlır.
    5. P Filtre0.22 um'lik bir filtreden urified çözeltisi ve kurutucu ve vakum O / N çözeltisi içeren açık tüpleri. Tüm tüpleri ışıktan korunmasını sağlamak. Nem ve ışıktan korunan -20 ° C 'de erimiş polimeri saklayın.

3. Hücre Encapsulation

  1. (Hücre yüklü 3D hidrojeller yumrukluyor için) PCR film ve silindirik çubuklar Otoklav ve UV ışığı altında doku kültürü kaputu 0,2 um filtrelenmiş% 70 etanol dalma ısmarlama silindirik jel kalıp sterilize edin.
  2. Hava kabarcıkları veya sızıntıları önlemek için boşluklar olmadan otoklavlanmış PCR film ile jel kalıbın dibine kapatılmalıdır. Steril 150 mm plaka muhafaza ediniz.
  3. Önceki biomimetic hidrojel hücre kapsülleme günlük, kollajenaz II O / N tedavi ve kollajenaz IV çözümü ile yüksek yoğunluklu kondrosit tek tabaka ayrıştırmaları. Kollajenaz VI, her kondrosit büyüme medya için kollajenaz II için 125 U / ml ve 160 U / ml kullanın37 ° C'de ilave edildi.
  4. 50 ml'lik bir tüp almak ve ilave,% 5 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim), poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, molekül ağırlığı = 5000 g / mol),% 3 w / v kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve DPBS h ışık başlatan /% 0.05 w. Çözüm karıştırmak ve bir kenara tutmak için tüp Vortex. Işıktan tüp koruyun.
  5. , 50 ml'lik bir Falcon tüpü içine ayrışmış hücreleri toplamak 5 dakika boyunca 460 x g'de santrifüj sayısı ve. Aspire tüm hücreler tüp ortam 15 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta hücreler yeniden askıya almak için, yukarıda karışık jel maddesi ekleyin. Hava kaçınarak oluşumunu kabarcıklar ise 30 kez iyice karıştırın.
  6. Pipet 72 özel yapılmış silindirik jel kalıbına hücre hidrojel süspansiyonunun ya da tek başına hidrojel ul ve 5 dakika için 3 mW / m 2 UV ışığı (365 nm dalga boyu) maruz kalma ile jelleşme neden. Hiçbir hücre içeriği ile bazı hidrojel çözüm hazırlayın. Gelecekteki biyokimyasal ve mekanik test için negatif kontrol olarak bu yapıları kullanın. MeasuUV yoğunluğu metre ile UV ışığın yoğunluğuna yeniden. Yoğunluğunu ayarlamak için, UV ışık kaynağı ve jelleşme sırasında hidrojel iskele arasındaki mesafeyi değiştirin.
    NOT: hidrojel CS içerdiğinden, aselüler katkısı sadece hücresel GAG temsil hücre yüklü hidrojellerin biyokimyasal GAG içeriğinden çıkarılır.
  7. Kapalı kolay kabuğu için filmi kesmek için bir neşter kullanın ve dikkatlice çıkarın. Silindirik çubuklar yardımıyla, polimerleşmemiş jel ve gevşek hücreler yıkayın steril DPBS 5 ml ile bir 6 yuvalı plaka içine jel üzerinden itin.
  8. Kültür, her oyuğa kondrosit büyüme ortamı 1,5 ml içeren 24 gözlü levhalar içine, hücre yüklü hidrojeller. Kuyuya yıkanmış hidrojeller aktarmak için tek kullanımlık spatula kullanın.
  9. Bir canlılık / Sitotoksisite kiti kullanılarak, canlı cansız boyama 24 saat sonrası kapsülleme hücre canlılığını değerlendirmek. Kültür taze kondrosit Gro değişen 3-6 hafta süreyle hücre yüklü hidrojeller ve boş hidrojeller2 günde analizler için hasat öncesi medya wth.

4. RNA Ekstraksiyon ve Gen İfadesi Analizleri

  1. Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu.
  2. Steril bir spatula yardımı ile, temiz bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne her hidrojel transferi ve her tüpe Tri-reaktif madde 250 ul ilave edin. RNA izole etmek için üreticinin talimatlarına uyun.
  3. RNA izolasyonu ve miktar kullanımı her örnekten bunun 1 mcg ve sonra High Capacity cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanılarak cDNA içine ters transkripsiyonu gerçekleştirin.
  4. Nicel PCR ilgi genlerin ifadesinin incelenmesi için TaqMan Gen İfade Diziler kullanın. GAPDH dahili gen ifadesi düzeylerini normale.
  5. PCR, aşağıdaki koşullar için bir 10 ardından urasil DNA glikosilaz önceki amplikonları inaktive etmek için 50 ° C'de 2 dakika inkübasyon yer alır60, 95 ° C'de inkübasyon dakika Taq polimerazı aktive etmek için. Daha sonra 95 ° C de 15 sn meydana gelen PCR'nin devre döngüsü gerçekleştirmek ve 60 ° C'de 1 dak.

5. Biyokimyasal analizler

  1. Her hücre hidrojel yapıları için DNA ve aşağıdaki gibi sülfatlı glikozaminoglikan (sGAG) üretimini ölçmek.
  2. Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu. Boş bir tüp tartılır ve kağıt mendil üzerinde kurutma sonra içine hidrojel koymak ve hidrojellerin ağırlığını veya ıslak ağırlığı kaydedin.
  3. Enzimatik sindirimi için ayrı bir 1.5 mi Eppendorf tüp -20 ° C 'de, her bir hidrojel dondurun ve daha sonra (GAG) (DNA) Picogreen deneyi ve Dimetil-Metilen mavisi analizi çalıştırmak için sindirilmiş ürünün bir kısım kullanın.
  4. Hidrojeller enzimatik sindirimi için papainase çözeltisi hazırlayın.
    1. İlk Sodyum fosfata 7.1 g dışarı tartarak PBE tamponu hazırlamake dibazik (Na 2 HPO 4) ve Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 1.6 g. , DH 2 O 500 ml çözülür pH 6,5'e ayarlanır ve 0.22 mm'lik bir filtreden filtre saflaştırılmış çözeltisi.
    2. PBE tamponu, 20 ml L-sistein 0,035 g çözündürülür. Çözüm ve steril papain enzimi 100 ul Filtre.
  5. Hazır deneyleri gerçekleştirmek için zaman, -20 ° C ila tüpleri alıp dondurulmuş hidrojellere hazır papain çözüm 300 ul ekleyin. Bir havanda jel Crush ve motor tokmak ile iyice karıştırın.
  6. Ek papain solüsyonu ile 500 ul hacim kazandırın. Kontrol jeller için aynı prosedürü uygulayın. 16 st 3,9, 60 ° C'de inkübe edin. Sindirilmiş hidrojel ihtiva eden çözelti, dolayısıyla DNA ve GAG ​​ölçümü için kullanılabilir. Üreticinin pr aşağıdaki standart olarak Lambda faj DNA ile Picogreen analizi kullanılarak DNA içeriği ölçünotocol.
  7. 1,9-dimetilmetilen mavisi (DMMB) standart 10 olarak köpekbalığı kondroitin sülfat ile boya bağlama testi kullanılarak sülfatlı-GAG içeriği ölçmek. İlgili ıslak ağırlık GAG miktarını bölerek GAG içeriği belirler.

6. Mekanik Test

  1. 10 N yük hücresi ile donatılmış bir Instron 5944 test sistemi kullanılarak serbest basınç testleri gerçekleştirin.
    1. In vitro kültür istenen gün sonra, hücre-hidrojel iskele ve aselüler kontrol hidrojeller sıkıştırma testi gerçekleştirin.
    2. Oda sıcaklığında PBS banyosu içinde örnekleri daldırın ve yükleme koşulları altında kıkırdak dokunun yaşadığı fizyolojik suşu itibaren 15,% 11,12 maksimum suşuna 1% streyn / sn bir hızda sıkıştırılması% 10-20 olduğu rapor edilmiştir 13,14.
  2. Üçüncü mertebeden polinom denklem kullanılarak gerilme eğrileri ve eğri uyum vs stres oluşturun. Compr belirleme% 15 suş değerlerinde eğri fit denklemden essive teğet modülü.

Sonuçlar

PEG ve CS kısımları (Şekil 1) içeren biyoaktif hidrojeller insan mafsal kondrositleri 2,3,5,7 kültür ve olgunlaşması için ideal bir platform oluşturmaktadır. Farklı yaşlarda ve hastalık durumlarından Kondrositler tarif edilen yöntem ile kültürlendi ve fenotipi, gen ekspresyonu ve oluşturulan kıkırdak dokusunun biyokimyasal ve mekanik özellikleri için analiz edilebilir. Üç kondrosit örnekleri juvenile- 6 ay, bireylerde erişkin 34 yaş ve osteoarthritic- 74 yaşında, 3D biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra hasat edilmiştir. Gen ekspresyonu, normal kondrosit, çocuk ve yetişkin hem analizleri kondrosit genleri Col2a1 ve Col6a1 ekspresyonunda bir artış göstermiştir. Col6a1 (Şekil 2) ekspresyonunu sürdürmek uygun bir biomimetik ortamda kültürlenen olmasına rağmen kondrojenik fenotipinin kaybı gösterirken Aksine, hastalıklı kondrositler Col2a1 dramatik bir azalma olduğunu gösterdi.

CS-PEG hidrojeller de kondrositler çoğalmaya için dinamik bir ortam olarak hizmet PEG ve CS önceden var olan matris sindirimi ve hücre etrafındaki ve hücre dışı matris olgun kıkırdak dokusunun başlıca bileşenleri bırakır. In vitro kültür 3 hafta sonra, kondrosit genişlemesi, bu özellikler göz önüne alındığında Picogreen boyası ile DNA miktarının ölçülmesi ile tahmin edilebilir. Hücreler üç grup karşılaştırmalı analizi OA kondrositler kültür 1 gün ile karşılaştırıldığında dramatik bir düşüş sergiledi ise çocuk ve yetişkin nüfusun hücre yoğunluğu değişmeden olduğunu göstermektedir. DNA içeriğinin kaybı aynı zamanda uzun dönemli kültür (Şekil 3) sırasında mümkün hücre ölümünü destek veren kondrositler OA için değil gözlenmiştir. Salgılanmış matris kültürlerin 3 hafta sonra bitiş noktası aşamasında DMMB boya bağlama deneyi ile sülfatlanmış-GAG içeriği olarak belirlendi. GAG içeriği recor olarak hidrojel yaş ağırlık normalize edilmektedirded enzimatik sindirim ve aselüler katkı önce çıkarılır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, kondrositler 3D hidrojeller kültür 3 hafta boyunca GAG benzer bir önemli miktarda biriken.

Fiziksel iskele varlığı serbest basınç deneyleri 2,3 ile numunelerin biyomekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. Hücresel olmayan hidrojeller basınç modüllerden bir azalma olur ise, hücreye yüklü yapılar Kültürde 3 hafta (Şekil 4) daha sonra sıkıştırma modülünü muhafaza. Fenotipik, burada açıklanan biyokimyasal ve biyomekanik analizler değerlendirilmesi ve mühendislik kıkırdak için farklı kondrosit popülasyonlarının potansiyelini anlamak için, bu nedenle yararlıdır.

figure-results-1
3D kondrosit cul 1. PEG-CS biomimetic hidrojeller ŞekilTure. Kondrositler poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA) ve kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve ısmarlama silindirik jel kalıbına dökülmüş ihtiva eden bir karışım içinde tekrar süspanse edilir. UV ışınlarına maruz sonra, jeller kalıplardan toplanır ve hücre canlılığı, canlı cansız boyanma 24 saat sonrası kapsülleme değerlendirilir katılaştı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3D biomimetik hidrojeller kültürlenmiş insan kondrositlerde kondrojenik genlerin 2. ifadesi. 3B biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra genç, yetişkin ve OA kondrositler tarafından kıkırdak belirteçleri Col2a1 ve Col6a1 nicel gen ekspresyonu. Değerler gün 1. Hata b gen ifade düzeyine normalize edilmişars ortalama ± SD temsil etmektedir. p *, ark modifiye. 2 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
3D biomimetic Hidrojellerde kültürlü insan kondrositlerde Şekil 3. DNA içeriği. 3D biomimetic hidrojellerin kültür 3 hafta sonra çocuk, yetişkin ve OA kondrositlerinde Picogreen testi ile DNA miktar tayini. Değerler gün 1'de DNA düzeyinde normalize edilir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4. GAG içerik ölçümü ve 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra insan kondrosit serbest basınç testi. 1. günde kondrositlerde ve kültür 3 hafta sonra DMMB deneyi ile (A) GAG miktar 3D biomimetic hidrojeller. Değerler ağırlığı (ww) ıslak normalize ve ug / g olarak ifade edilmiştir. 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra asellüler ve hücre yüklü hidrojellerin (B) Basınç modülü (kPa). Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Tartışma

Bu protokolde bildirildiği gibi, 3D hidrojeller genellikle tek tabakalı kültürler 15 ile karşılaştı fibrocartilage hücrelerine hücre dediferansiyasyon süreci kaçınarak, kültürde kondrosit fenotipi muhafaza edebiliyoruz. Ayrıca, hidrojel yapısının chondrocytes- uzun süreli kültürleri yaş ve hastalık ile ilişkili içsel hücre özelliklerini korumaktadır elverişli bir ortam ortaya koymuştur.

3B biomimetik hidrojel kullanılması birçok avantaj vardır. İlk olarak, kondroitin sülfat dahil (CS), eklem kıkırdağının içinde bulunan başlıca bir komponent, kondroitinaz salgılayarak hidrojel matrisi bozan ve ekstra hücresel matris 5, 16 yeni sentezlenmiş kıkırdak bırakmaya hücreleri sağlar. Buna ek olarak, CS gösterilmiştir artritik eklem anti-inflamatuar özelliklere sahip. Biomimetik hidrojel kıkırdak tamir hücre dağıtımı için bir iskele malzemesi olarak kullanılabilir, ve kimyasal olarak modifiye edilebilirDaha iyi doku biyomalzeme entegrasyon 17,18 kolaylaştırmak için.

PEG-CS hidrojellerin kullanımı, uzun süreli kondrositlerin kültürleri ve biyokimyasal ve mekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. İşte biz bu platformu kıkırdak mühendisliği için en uygun hücre tipini tanımlamak amacıyla farklılaştırılmış kondrosit çeşitli kaynaklardan karşılaştırmalı analizler için yararlı olabilir nasıl gösterir. İlginçtir, hidrojeller kapsüllü kondrositlere kendi içsel yeteneklerine göre canlı kalır ve çoğalır. Hidrojel bileşimi destekleri, aslında, sağlıklı genç ve erişkin kondrositlerin büyümesi Şekil 2'de gösterildiği gibi. Açıklanan hidrojel bileşimi ve yapısı da kıkırdak doku formasyonunu teşvik glikozaminoglikan ile değerlendirilen fonksiyonel hücre dışı matris birikimi (GAG ile gösterildiği gibi ) ölçümü.

Buluşun bir başka avantajı, kondrosit hidrojel yapıları olanYeni oluşan kıkırdak dokusunun mekanik özellikleri için değerlendirilebilir. Serbest basınç testi karşılaştırma için aselüler hidrojel yapılmalıdır unutmayın. Hidrojeller, aslında, bağlı CS parçalarının sertliği için temel bir sertliğe sahiptir. (Bir gerilme oranı / s% 1 at)% 5-20 serbest basınç gerilme yükleme koşulları altında kıkırdak dokusu yaşadığı fizyolojik zorlanma beri kıkırdak dokusunun 11,12 mekanik testler için uygulanabilir 10-20 olduğu rapor edilmiştir % 13,14. Mekanik test hücre yüklü ve hücresel olmayan iki hidrojellerin tepkisi, kültür son nokta değerlendirilmiştir. Tarif edilen örnekte, OA kıkırdak ihtiva eden konstruktların düşük katılıkta aksine, yetişkin ve juvenil kondrositlerin ihtiva eden konstruktların benzer bir sertliğe gözlenen, yukarıda. Hücre-hidrojel yapısının bu tür mekanik özellikleri fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesine olanakHücre olgunlaşma yeteneği derinlemesine analizini veren oluşturulan doku.

Sonuç olarak, kıkırdak doku üretmek için farklı bir kondrosit nüfusun potansiyel çalışma 3D biomimetik hidrojellerin kullanımı yaygın olarak uygulanabilir. Burada tarif edilen in vitro çalışmaların yanısıra hücre-yüklü yapıları in vivo nakli fizyolojik bağlamda hücre olgunlaşmasını ve rejeneratif potansiyel çalışma tasavvur edilebilir. Ek biomimetik faktörlerle hidrojel platformun bundan başka değişiklikleri de, kondrosit çoğalmasını ve olgunlaşmasını optimize etmek için tasavvur edilebilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Stanford Ortopedik Cerrahi Bölümü'ne ve Stanford Coulter Translasyonel Tohum Hibesi'ne finansman için teşekkür eder. JHL, desteği için Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Bursu ve DARE Doktora Bursu'na teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
juvenil kondrositler (Klontikler Normal İnsan Kondrosit Hücre Sistemi)LonzaCC-2550
yetişkin kondrositler (Klontikler Normal İnsan Kondrosit Hücre Sistemi)LonzaCC-2550
poli (etilen glikol diakrilat)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-morfolinoetansülfonik asitSigmaM5287
foto başlatıcıIrgacure 2959
sodyum klorür SigmaS9888
kondroitin sülfat sodyum tuzu SigmaC9819
N-hidroksisüksinimid Sigma130672
1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidroklorürSigmaE1769
2-aminoetil metakrilatSigma516155
diyaliz tüpleriSpectrum Laboratories  132700
Kollajenaz 2Worthington Biyokimyasal 
Kollajenaz 4Worthington Biyokimyasal 
DMEM/F12 ortamıHyClone, Thermo Scientific SH3002301 
canlı/ölü tahlilLife TechnologiesL3224
Tri reaktifYaşam TeknolojileriAM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Test KitiInvitrogenP11496
Sodyum fosfat dibazik SigmaS3264
Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu SigmaE5134
L-SisteinSigmaC1276
1,9-dimetilmetilmetilen mavisi Sigma341088
Instruments
UV ışık ekipmanları - XX-15LW Tezgah Lambası, 365 nmUVP95-0042-07
Instron 5944 test sistemi Instron ŞirketiE5940
LS004177LS004189

Kaynaklar

  1. Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
  2. Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  3. Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553(2013).
  4. Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
  5. Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
  6. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
  7. Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
  8. Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
  9. Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
  10. Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
  11. Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
  12. Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
  13. Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
  14. Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
  15. Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
  16. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
  17. Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
  18. Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kondroitin Sülfat MetakrilatPolietilen Glikol DiakrilatEnzimatik DisosiasyonUV FotopolimerizasyonMekanik TestlerGen Ekspresyon Analiziİmmünofloresan Boyama
Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.