Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53098

⸱

7 Şubat 2016

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

Bu makalede

Özet

İnsan meme epitelinin hormon etkisini incelemek için uygun bir 3D kültür modelini tanımlıyoruz.

Özet

Meme epitel morfogenezi süreci hormonlardan etkilenir. 2D kültürler kullanılarak meme epiteli üzerindeki hormon etkisinin incelenmesi, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyonu uç noktaları ile sınırlıdır. Bununla birlikte, organizmada, meme morfogenezi 3 boyutlu bir ortamda gerçekleşir. 3D kültür sistemleri, tek katmanlı hücre kültürü (2D) ile organizmanın karmaşıklığı arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Burada, hormon etkisini incelemek için uygun olan insan meme epitelinin bir 3D kültür modelini açıklıyoruz. Ticari olarak temin edilebilen hormona duyarlı insan memesi epitel hücre hattı, T47D ve sıçan kuyruğu kollajen tip 1'i matris olarak kullanır. Bu 3D kültür modeli, ana mamotropik hormonlara yanıt verir: estradiol, progestinler ve prolaktin. Bu hormonların epitel morfogenezi üzerindeki etkisi, son noktaya göre 1 veya 2 haftalık tedaviden sonra gözlenebilir. 3D kültürler, epitelyal morfogenez, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi için hasat edilebilir.

Giriş

standart 2D kültürlerin aksine, 3D hücre kültürü vekil modelleri fizyolojik ilgili bağlamda, biri doku andıran epitel hücre davranış çalışma için izin verir. meme bezi 3D kültürleri meme bezi gelişimi ve neoplazi birçok açıdan aydınlatmak yardımcı olmuştur. Ancak, şu anda mevcut 3D kültür modellerinin en görev için kullanılan insan epitel hücre hatları hormon reseptör ifadesini 6,7,9 eksikliği nedeniyle hormon etkisini incelemek için uygun değildir.

Bu yazıda, hormon etkisini 12 incelemek için uygundur insan meme epitel 3D kültür modeli açıklanmaktadır. Bu model, ilk olarak göğüs infiltratif duktal karsinom olan 54 yaşındaki bir kadın hastadan elde edilen bir plöral efüzyonundan elde edilmiştir ticari olarak temin edilebilen hormon duyarlı insan meme epitelyal hücre kuşağı, T47D 3,11,13 kullanır. Bir matris olarak fare kuyruk kolajeni tip 1 kullanın. Bu 3D kültURE modeli insan meme epitelyal hücreleri üzerinde üç mammotropic hormon (estradiyol, promegeston (progesteron bir analog) ve prolaktin) etki çalışma için uygundur. Hormon oluşan epitel morfolojisi morfometrik analizi 12 zamanla miktar olarak tespit edilebilir.

Uygun tohum yoğunluğu, bu 3D kültürler 2 hafta muhafaza edilmesini sağlar. Bu zamana kadar, yapıların geliştirilmesi epitel morfolojisi üzerinde hormon eylem sağlam bir nicel değerlendirilmesi için yeterlidir. Jeller, hücre proliferasyonu için daha önceki zaman noktalarında toplandı edilebilir ve gen ekspresyonu analizi. Buna ek olarak, bu model sıralı bir hormon tedavisinin etkilerini test etmek için uygun olan; örneğin, bir hafta boyunca hormonların diğer hormon / kombinasyonu ile ilk haftasında estradiol ile muamele değiştirildikten sonra. örneğin ICI 182.780 olan östrojenik bileşikler ve antiöstrojenler, etkisi de stu edilebilirBu 3D kültür modeli 12 kullanılarak öldü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Reaktiflerin 1. Hazırlık

  1. 10 -3 M stok solüsyonlar yapmak üzere, sentetik progesteron promegeston (R5020) ve etanol 17 β-estradiol (E2) içinde çözülür. 1 mg / ml stok çözelti yapmak için damıtılmış, deiyonize su içinde prolaktin eritin. 10 -2 M stok çözelti yapmak için DMSO içinde antiöstrojen ICI 182.780 eritin. en fazla 6 ay süreyle -20 ° C'de bu çözümleri saklayın.
  2. Kömür dekstran (CD) serum ve CDFBS orta elimden:
    1. 30 dakika boyunca 57 ° C su banyosu içinde cenin sığır serumu (FBS) ısı etkisiz hale getirirler.
      Not: kullan Bu protokolün geri kalanı için sadece asitle yıkanmış cam.
    2. ihtiyaç duyulan kömür miktarını hesaplayın. , Kömür nedeniyle yerinden telafi% 5 ağırlık / hacim toz kömür aktif tartmak serum miktarının% 10'undan fazla hacim kullanma.
    3. serum miktarı aynı hacim kullanılarak soğuk deiyonize distile su ile iki kez kömür yıkayın. Her yıkama ckömür pelet 2 dakika 50 xg'de entrifuge. yıkar arasında su çıkarmak. Son karbon pelet,% 0.5 ağırlık / hacim Dekstran T-70 ekleyin. 5 dakika boyunca 100 x g'de damıtılmış, iyonu giderilmiş su ve santrifüj ile yeniden askıya. su aspire.
    4. pelet serum uygun hacim kazandırmak ve serum içine kömür dekstran pelet yeniden askıya. 60 dakika boyunca 37 ° C'de, (6 RPM) hareket ettirirken, inkübe edin. 20 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant bulutlu görünürse, santrifüj tekrarlayın; Ancak, serum, şu anda tamamen net olmayabilir ama filtrasyon sırasında temizlenecektir.
    5. Daha büyük parçacık maddenin ayrılması için 0.45 mikronluk bir filtreden sonra tekrar 0.80 mikronluk bir filtreden filtre edilir ve. Son olarak, 0.20 mikron filtre ile filtre sterilize edin. Mağaza -20 ° C'de cam tüpler ya da T-25 kültür şişelerinde CDFBS süzülür.
    6. Kömür Dekstran fetal ortamı (CDFBS ortamı) Sığır içeren Soyulmuş: fenol kırmızısı içermeyen DMEM 375 ml ve DMEM 125 ml karışımı/ F-12. 37.5 ml çıkarın ve Kömür Dextran Stripped Fetal Sığır serum aynı hacimde ile değiştirin. 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar 10 6 U / ml penisilin ve L-glutamin ekleyin. Elde edilen ortam% 75 DMEM,% 25 DMEM / F-12,% 7.5 kömür dekstran soyulmuş FBS, 2 mM L-glutamin ve 10 6 U / ml penisilin.
  3. 10X PBS, 1 N NaOH ve damıtılmış iyonu giderilmiş su hazırlayın. gerekli kollajen çözüm hacmine göre her yeterli hacim hazırlayın. filtreleme bütün çözümleri sterilize edin. 1 aya kadar 4 ° C 'de 10 x PBS ve steril damıtılmış iyonu giderilmiş su saklayın. 1N NaOH çözeltisi tutmayın.
  4. Üretici tarafından sağlanan "Kollajen I, fare kuyruk için alternatif Jelleşme Prosedürü" protokolüne göre 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, kolajen çözeltisi hazırlayın. Her bir kolajen jel çözeltisi, 1.5 ml yapılmıştır. Örneğin hazırlanması için kollajen çözeltisi (pipetleme sırasında hasar hesaba 0.5 mi) 18.5 ml hazırlanması12 jeller. hemen kollajen çözümü kullanın veya en fazla 2-3 saat buz üzerinde tutun.
  5. Carmine Şap boya:
    1. 500 ml damıtılmış su içinde 1 gr Carmine ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat birleştirin. 20 dakika boyunca karıştırılarak kaynatılır. üzerine kaynar önlemek için dikkatle izleyin. Ek damıtılmış su ile geri 500 ml son ses seviyesini ayarlayın.
    2. antimikrobiyal aktivitesi için timol bir kristal ekleyin ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile bir şişe kapağı. Her kullanımdan önce, bir laboratuvar sınıfı kağıt filtre içinden filtre ediniz. en fazla üç ay süreyle karmin çözümü tekrar kullanın. Oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır.
  6. Kolagenaz çözelti: a / h% 0.125'lik bir konsantrasyonda DMEM / F12 ortamı içinde kolajenaz çözülür. Bu çözüm tutmayın.

Sıçan Kuyruk Kollajen Tip 1 jeller ve Hormon Tedavisi 2. 3D Kültür T47D hücreleri

Not: 4 ° C'de steril serolojik pipetler ve pipet uçları tutun.

  1. PrepaBir tek hücre süspansiyonu tekrar ve hücre sayımı gerçekleştirin. Bölünmüş T47D hücre kültürleri onlar% 70 izdiham ulaşmadan. gerekli hücrelerin miktarını içeren birim santrifüj. bir jel yaklaşık 75.000 T47D hücreleri içermesi gerektiğini düşünün.
  2. Soğuk pipet kullanarak, kollajen, uygun hacimde hücre pelletini yeniden askıya. Her bir kolajen jel 1.5 ml oluşur düşünün. kabarcıkları almaktan kaçınması yavaşça hücreleri ve kollajen karıştırın.
  3. , Hücre dağılımı üzerinde statik elektriğin etkisini önlemek plaka unwrapping sonra bir statik düşürücü fırça ile 12 plaka sınırları, üst ve alt fırçalayın. başlık çalışma yüzeyi ile temas sırasında statik yük birikmesini önlemek için, statik düşürücü brush.Gently fırçalanmış edilmiş bir 12-çukurlu bir tablaya (boş levha) üzerine, bu plaka yerleştirmek karışımı 1.5 ml dökün 12 oyuklu plakanın her oyuğuna.
  4. 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir kuluçka plaka koyun. th kaldıre inkübatör plaka ve kaputu geri yerleştirin.
  5. P200 steril ucu kullanarak, dikkatle kuyunun sınırına yumuşak dairesel hareketlerle jel ayırın. bir jel kuyunun dibinden ayırmak gerekir.
  6. CDFBS medya seyreltilir hormonlar oyuklara ilave edin. 10 7 M son konsantrasyonda bir bir 10 -10 M son konsantrasyon ve prolaktin E2 ve R5020 kullanın. Kontrol olarak, katma hormonların ama hala kullanılan hormon stoklarının eşit DMSO yüksek ses içeren olmadan CDFBS ortamını kullanın. Her iyi medya 1.5 ml içerdiğinden emin olun. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 içinde 3B kültürleri yerleştirin nem doku kültürü inkübatör. her 2 günde bir ortam değiştirme, 1 ya da 2 hafta kültür koruyun.

Tüm Mounts 3. Jel İşleme

  1. Kültür ortamını çıkarın ve her bir oyuğa, PBS, 1.5 ml ekleyin.
  2. Bir slayta jel aktarın. Bir eğrisi kullanılarak yarısında jel kestid cerrahi bıçak. yarısı ile işleme devam edin ve histolojik analiz için diğer yarısını kaydedin.
  3. Bütün bir slayt monte yarım jel aktarın. 5 dakika boyunca jel kurumaya bırakın ve daha sonra% 10 formalin içeren bir coplin kavanoza slayt aktarın.
    Not: Bütün inkübasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
  4. Bir sallama O / N bir coplin kavanoza jeller sabitleyin.
  5. Yıkama çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile. Aktarım% 70 EtOH için slaytlar; çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin. Carmine Şap O / N Transfer slaytlar.
  6. Bir sonraki gün, 1 saat için her% 70 EtOH,% 95 EtOH ve% 100 EtOH içinde bir karıştırıcı üzerinde slaytlar dihidrat. Transferi iki kez 1 saat her ksilen ve çalkalayıcı üzerinde tutmak için slaytlar. jeller ve 1.5 mm kalınlığında lamelleri monte toluen bazlı montaj ortamı kullanın.
  7. Düzenli ışık (mikroskop veya stereoskop) kapsamında tüm bağlar inceleyin. şekil ve lümen daha ayrıntılı bir analizi için konfokal mikroskopi kullanımı ve HeNe 633 nm lazer ile Carmine boya görselleştirmek.

Histoloji Analiz İşleme 4. Jel İşleme

  1. % 10 formalin içeren 20 ml'lik bir cam şişeye jel kalan yarısı aktarın ve çalkalama O / N üzerine sabitlenir.
  2. çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile jeller yıkayın. parafine için işlem kasetleri içine yerleştirin jeller.
  3. % 70 EtOH transfer jeller, 1 saat boyunca inkübe edilir ve 1 saat için% 95 EtOH ile izleyin, 1 saat boyunca, taze% 95 EtOH değiştirmek,% 100 EtOH, 1 saat ve 1 saat süre ile, taze% 100 EtOH değiştirin. 1 saat boyunca, taze ksilen içinde yeniden Bu noktada, jeller oda sıcaklığında% 100 EtOH O / N depolanabilir ya 1 saat süreyle ksilen ile inkübe edilir ve.
  4. Aktarım kasetleri iki kez daha fazla taze parafin ile tekrar vakum inkübatöründe 60 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca Parafin.
  5. temiz parafin ile plastik kalıp doldurun. , Kaseti açın jel çıkarın ve plastik kalıp içeren parafin yerleştirin. parafin ile doldurun ve üstüne etiketi içeren kasetin üst eklemek ve blok soğumaya bırakın.
  6. plast kaldıric kalıp ve bölüm mikrotom kullanılarak blok. HE boyama ve immünsitokimya 5 um kalınlığında kesitler elde edin.

Kollajenaz muamelesi kullanılarak jellerden hücreleri hücreleri 5. Ekstraksiyon

  1. kuyudan jel çıkarın ve PBS içeren bir petri tabağına aktarın. Durulayın jel kısaca.
  2. % 0.125 kolajenaz 2 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe jel aktarın. küçük parçalar halinde jel kırmak için yukarı pipet ve aşağı 4-5 kez.
  3. 25 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir (jel eritildi ve hücreler, süspansiyon içinde olan kadar)
  4. Serum takviyeli kültür ortamında 2 ml ilave edilir. santrifüj (1.000 xg, 5 dk), ıskarta süpernatant hücreleri toplamak, hücrelerin yeniden askıya ve saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, hormona duyarlı 3D kültürleri hazırlanması için prosedürü özetlenmektedir. Epitel yapıları yalnız E2 mevcudiyetinde 2 hafta kültürlendi ve hormonlar ile kombinasyon içinde jeller, tüm bağlar gözlenmektedir. Resim hormonlar kültür ortamında (CDFBS ortamı) (Şekil 2) eklendiğinde sadece tek hücreler veya 2-3 hücre grupları bulunmaktadır. Bu durum, bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir.

şekil, boyut, ve lümen mevcudiyetinde farklılık 3D kültür şe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, hormonların meme epiteli üzerindeki etkisini test etmek için hormona duyarlı bir 3D kültür modeli açıklıyoruz. Hormonlara yanıt, doku morfolojisi, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyon seviyelerinde değerlendirilebilir 12. Bu tekniğin bir sınırlaması, kültürler plastik bir alt plakada büyütüldüğü için kültür periyodu boyunca görselleştirmenin ışık mikroskobu ile sınırlı olmasıdır. 3D kültür sistemi, kültürlerin canlı görüntülenmesine izin vermek için cam alt plakalara uyarlanabilir 1.

<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz büyük ölçüde Cheryl Schaeberle tarafından editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Bu araştırma Avon Hibe # 02-2009-093 ve 02-2011-095 ve AMS NIEHS / NIH ES 08314 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 oyuklu Doku Kültürü Plakaları (Falcon)Fisher Scientific08-772-29
15 ml polistiren konik TüplerFisher Scientific14-959-49D
Aktif KömürSigmaC-5510
Karmin ŞapSigmaC1022-100G
Kollajenaz, Tip 3WorthingtonS0C11784
Konfokal MikroskopZeissLSM510HeNe 633nm lazer ile donatılmış
Dextran T-70Abersham / Pharmacia17-0280-01
DMEM / F-12, HEPES, fenol kırmızısı ve nbsp;Yaşam Teknolojileri11339-021Hormon kullanımı için fenol kırmızısı içermeyen ortam
DMEM, düşük glikoz, piruvat, glutamin yok, fenol kırmızısı yokYaşam Teknolojileri11054-020Hormon kullanımı için fenol kırmızısı içermeyen ortam
17-β-EstradiolEMD Millipore3301etanol etanol içinde çözülmüş
KoptecV1001
Fetal sığır serumhiklonuSH30070.03Hormonlarla kullanım için, Kömür Dekstran soyulmuş olmalıdır 
Filtreler (115 ml)Nalgene380-0080, 245-0045, 120-0020sırasıyla 0.88, 0.45, 0.20 mikron&n;
Formalin, %10Fisher ScientificSF93-20
L-Glutamin (200 mM)Yaşam Teknolojileri25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant)Sigma AldrichI4409-25MGDMSO Mikrotomunda Çözünmüş
 LeicaRM2155
Doku gömme ortamıMcCormick Scientific39502004
PenisilinSigma7794-10MU10 ml damıtılmış deiyonize su içinde çözülmüş
PermountFisher ScientificSP15-500
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su pH 7.4Sigma AldrichP3813-10PAK
ProlaktinSigma AldrichL4021-50UGDamıtılmış deiyonize suda çözülmüş
PromegestonePerkin ElmerNLP004005MGEtanol
Sıçan Kuyruğu Kollajeninde Çözülmüş Corning 354236Lotlar farklı konsantrasyonlar içerebilir, buna göre not edin
Neşter Miltex4311
Yarı Kapalı Tezgah Üstü Doku İşlemcisiLeicaTP1020
Sodyum HidroksitSigma AldrichS58811N NaOH stoğu hazırlayın
StaticMaster Anti-statik fırça AmstatC3500
Stripette Serolojik Pipetler Corning 4101
T-25 şişeleriCorning 
DokuKasetleri Fisher Scientific15-200-403E
Buğday Şişeleri, Cam, 20 mlFisher Scientific03-341-25D 
Ksilen VWR95057-822
430168 Serisi

Kaynaklar

  1. Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
  2. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
  3. Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
  4. Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
  5. Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
  6. Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
  7. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
  8. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
  9. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
  10. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
  11. Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
  12. Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
  13. Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

3B Kültür ModeliHormona Duyarlı HücrelerMeme EpitelyumuT47D HücreleriSıçan Kuyruğu KolajeniEstradiol UygulamasıProgestin UygulamasıProlaktin UygulamasıEpitelyal MorfogenezHücre Proliferasyonu
İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.