Yöntem makalesi

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53105

⸱

31 Ağustos 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

Bu makalede

Özet

Bakteriyel pyomelanin üretimi, oksidatif strese ve virülansa karşı direncin artmasına neden olur. Pyomelanin üretiminin inhibisyonunu belirlemek ve bakterilerde oksidatif strese duyarlılıkta ortaya çıkan artışı test etmek ve ayrıca antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için kullanılabilecek teknikleri rapor ediyoruz.

Özet

Pyomelanin, çeşitli bakteri ve mantar türleri tarafından üretilen hücre dışı kırmızı-kahverengi bir pigmenttir. Bu pigment, tirozin katabolizma yolundan türetilir ve oksidatif stres direncinin artmasına katkıda bulunur. Pseudomonas aeruginosa'da pyomelanin üretimi, 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) ile muamele yoluyla doza bağlı bir şekilde azaltılır. Bakterilerde pyomelanin üretimini azaltacak veya ortadan kaldıracak ilaç konsantrasyonunu belirlemek için çoklu NTBC konsantrasyonları kullanan bir titrasyon yöntemini tarif ediyoruz. Titrasyon yöntemi, artan ilaç konsantrasyonları ile pigment üretiminde gözle görülür bir azalma gibi kolayca ölçülebilir bir sonuca sahiptir. Ayrıca bakterilerde antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) test etmek için bir mikrotitre plaka yöntemi de tarif ediyoruz. Bu yöntem minimum kaynak kullanır ve bir bakteri türü için bir mikrotitre plakasında birden fazla antibiyotiği test etmek için kolayca ölçeklendirilebilir. MIC testi, antibiyotik olmayan bileşiklerin belirli konsantrasyonlarda bakteri üremesi üzerindeki etkilerini test etmek için uyarlanabilir. Son olarak, H2O2'yi agar plakalarına dahil ederek ve plakalar üzerinde çoklu bakteriseyreltmelerini tespit ederek oksidatif strese karşı bakteriyel duyarlılığı test etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. Oksidatif strese duyarlılık,H2O2 içermeyen bir H2O 2kontrolüne kıyasla H 2 O2 içeren plakalar üzerindeki farklı seyreltmeler için koloni sayısı veboyutundaki azalmalarla gösterilir. Oksidatif stres nokta plakası testi, minimum kaynak ve düşük konsantrasyonlardaH2O2kullanır. Daha da önemlisi, aynı zamanda iyi bir tekrarlanabilirliğe sahiptir. Bu nokta plakası testi, bileşikleri agar plakalarına dahil ederek ve ortaya çıkan bakteri büyümesini karakterize ederek çeşitli bileşiklere bakteri duyarlılığını test etmek için uyarlanabilir.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa, oksidatif stres1-4'ten koruma sağlamaya yardımcı olan ve aminoglikozit antibiyotikler5-7 dahil olmak üzere çeşitli bileşikleri bağlayan kırmızı-kahverengi bir pigment olan pyomelanin dahil olmak üzere çeşitli pigmentler üreten Gram negatif bir bakteridir. Piyomelanin üretimi, homogentizat 1,2-dioksijenaz (HmgA)1,9'u kodlayan genin delesyonları veya mutasyonları yoluyla veya yol10'daki çeşitli enzimlerdeki dengesizlikler yoluyla tirozin katabolizma yolu4,8'deki bir kusurdan kaynaklanır. Homogentizat, HmgA'nın inaktivasyonu nedeniyle birikir ve pyomelanin11 oluşturmak üzere salgılanır ve oksitlenir. Pyomelanin üretimi, tirozin katabolizma yolağında 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenazı (Hpd) inhibe eden herbisit 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) 12 ile muamele yoluyla doza bağlı bir şekilde ortadan kaldırılabilir veya azaltılabilir. Hpd, homojenizat oluşumu için gereklidir ve bu nedenle pyomelanin11.

P. aeruginosa'nın pyomelanin üreten suşlarının NTBC tedavisi çalışmalarımızda önemli olan üç tekniği ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu teknikler arasında, laboratuvar ve klinik pyomelanin üreten suşlarda pyomelanin üretimini ortadan kaldıracak veya azaltacak konsantrasyonları belirlemek için NTBC titrasyonu, bakteriler NTBC ile tedavi edildiğinde antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) belirlenmesi ve NTBC tedavisi ile oksidatif strese karşı ortaya çıkan duyarlılık yer almaktadır.

Geliştirdiğimiz titrasyon testi iki amaca hizmet eder. İlk olarak, tahlil, kullanıcının NTBC'nin incelenen bakteride pyomelanin üretimini ortadan kaldırıp kaldıramayacağını veya azaltıp azaltamayacağını ve hangi konsantrasyonlarda olduğunu belirlemesine izin verecektir. Bu, kullanıcının NTBC'ye duyarlılığı belirlemesine izin verecektir, çünkü P. aeruginosa12'de gözlemlendiği gibi, farklı bakteri türleri bu bileşiğe karşı farklı hassasiyetlere sahip olabilir. İkinci olarak, NTBC titrasyon testi, amaç pyomelanin üretimini ortadan kaldırmak veya azaltmak ve pigment azaltmanın etkilerini belirlemekse, kullanıcının antibiyotik MIC ve oksidatif stres yanıtı testleri gibi sonraki deneylerde kullanmak üzere uygun NTBC konsantrasyonunu belirlemesine izin verecektir.

Titrasyon testi işe yarar çünkü NTBC ile tedavi edilen suşlarda pyomelanin üretiminde gözle görülür bir fark görülebilir ve piyomelanin üretimindeki farklılıklar doza bağlıdır12. Ek olarak, bu teknik, bakterilerde pigment üretimini ortadan kaldırabilecek veya artırabilecek diğer bileşiklerin incelenmesine uygulanabilir.

Antibiyotik MİK'ler, bakterilerin antibiyotiklere duyarlılığını belirlemek için kullanılır. Agar seyreltme plakaları ve et suyu seyreltmeleri14 dahil olmak üzere MIC'leri belirlemek için çeşitli yöntemler vardır. Et suyu seyreltmeleri, küçük test tüplerinde veya 96 oyuklu bir mikrotitre plakasında gerçekleştirilebilir. Burada açıklanan MIC tayininde kullanılan mikrotitre plaka yöntemi, kullanıcının minimum kaynak kullanarak çok çeşitli antibiyotikleri test etmesine olanak sağlayacaktır. Test, bu yöntemle test edilen antibiyotik ve suş sayısında esnekliğin yanı sıra tekrarlanabilirlik sağlar. Ek olarak, NTBC'nin teste dahil edilmesiyle, kullanıcı, pyomelanin üretiminin ortadan kaldırılmasının veya azaltılmasının pyomelanin üreten bakterilerde antibiyotik duyarlılığını değiştirip değiştirmediğini belirleyebilir.

Oksidatif strese bakteriyel yanıt çeşitli şekillerde test edilebilir. Açıklanan en yaygın yöntemler, bir süre boyunca oksidatif strese maruz kalan canlı bakteri sayıları1 veya oksidatif stres diski difüzyon deneyleridir15. Bu yöntemler, bakterilerde oksidatif stresin etkilerini incelemek için yüksek konsantrasyonlarda oksidatif stresörler kullanma eğilimindedir ve sonuçlar biyolojik kopyalar arasında oldukça değişken olabilir. Uygulanabilir sayım tahlili ayrıca diğer yöntemlerden daha fazla agar plakası kullanma eğilimindedir. Tanımladığımız nokta plakası testi, düşük konsantrasyonlardaH2O2kullanır ve kullanıcının minimum plaka kullanarak çoklu suşların oksidatif stres tepkisini test etmesine olanak tanır. Tahlil ayrıca teknik ve biyolojik kopyalar arasında tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir. Piyomelanin oksidatif strese karşı dirençte rol oynadığından, NTBC'nin teste dahil edilmesi, kullanıcının pyomelanin üretiminin ortadan kaldırılmasının oksidatif stres direnci üzerindeki etkilerini belirlemesine olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kültür Ortamı Antibiotics hazırlanması 1. ve 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC)

  1. Uygun birimlere LB suyu (% 1 Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H 2 O) ve kısım sağlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayınız.
  2. 100 ml LB agar (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H2 O% 1.5 ağar) 250 ml'lik şişelere sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. Agar tabak içine dökülmeden önce eritilir emin olun.
    Not: 4 plakayı verecektir LB agar 100 ml ihtiva eden şişeler. LB agar miktarı tayini için gereken levha sayısı uygun şekilde değiştirilebilir.
  3. (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16 PBS sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav veya filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin.
  4. Gentamisin antibiyotik stok çözümleri hazırlayın, kanamisin, bird tobramisin.
    1. P. uygun antibiyotik stok konsantrasyonları hazırlayın 100 mg / ml gentamisin, 30 mg / ml kanamisin ve 10 mg / ml tobramisin ihtiva eden aeruginosa suşu. 4 ° C'de su, filtre ile sterilize (0,2 um) ve deposunda antibiyotik çözülür. Çalışılan bakteriye bağlı antibiyotik ve konsantrasyonları değiştirin.
  5. NTBC stok çözümleri hazırlayın. DMSO 400 ul NTBC 10 mg eritin. Bu 75,9 mM NTBC bir konsantrasyon elde edilir. -20 ° C'de saklayın NTBC stok çözümleri. Oda sıcaklığında çözülme çözümler gerektiği gibi.
    NOT: NTBC Farklı kaynaklardan çözünürlüğündeki farklılıklar var. Üreticinin önerilerine dayanan NTBC çözülür ve Adım 1.5 buna göre ayarlamak için hangi uygun araç belirleyin.

2. Bakteriyel Suşlarının NTBC Titrasyonları

  1. Suşların kurmak gecede kültürleri test edilecek. 2 ml LB suyu 16 x 150 mm test tüpünü ekles (suş başına bir tane) ve her bir suş 1 izole koloni aşılamak. Bir hava kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator havalandırma ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Ertesi gün, LB suyu NTBC arasında titrasyonları hazırlar. Farklı suşları NTBC duyarlılık farklılıkları beri 0'dan 900 mcM NTBC bir başlangıç ​​aralığı kullanın.
    1. Suş başına 4 ila 5 test tüpleri (16 x 150 mm) 1 ml LB suyu ekleyin.
    2. Bir konsantrasyon aralığında test tüpleri (16 x 150 mm) NTBC stok solüsyonu (75,9 mM) eklenir. LB brot, 1 ml eklemek NTBC konsantrasyonları ve karşılık gelen hazır hacimleri için Tablo 1'e bakınız.
  3. Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce kültürleri yıkayın.
    1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Süpernatantı ve herhangi gevşek pelet hücreleri ile kaldırBir mikropipet ve 1 ml LB katı hücre pelletini
  4. OD 600 0.05 titrasyon tüpleri inoküle edin. Tüpleri aşılamak için gerekli yıkanmış kültür miktarını hesaplayın.
    NOT: Bu olmamalı pyomelanin beri ekimlerde için yıkanmış kültürleri kullanın.
  5. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 24 saat için titrasyon inkübe edin.
  6. Titrasyon tüpleri fotoğraf ve MIC ve oksidatif stres testleri için kullanmak NTBC miktarını belirlemek için içinde ve suşları arasında pigment üretimini karşılaştırın. Hücre içermeyen kültür süpernatanında pyomelanin miktarını belirlemek ve hücre yoğunluğu belirlemek için OD 600 değerlendiriniz.
    Not: hücrelere kültür yüzey maddesinde pyomelanin OD 600 oranı NTBC ile muamele edildikten sonra pyomelanin üretim farklılıkları ölçmek için hesaplanabilir.

3. Antibiyotik Asgari inhibitörlerinin96 oyuklu plakalar içerisinde edici Konsantrasyon (MİK) Deneyi

  1. Suşların ayarlama gece boyunca kültürler ile NTBC olmadan LB içinde test edilmelidir.
    NOT: Bu protokol, 300 mcM NTBC temsilcisi seviyesini kullanarak tarif edilir. Kullanılacak NTBC uygun düzey Aşama 2,6 belirlenir.
    1. 2 ml LB 300 uM NTBC ekleme Herhangi bir NTBC durum için 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim.
    2. Steril kürdan kullanarak, bakteri, bir izole edilen bir koloninin Tüpleri inoküle. NTBC ile tek kültür ve her bir suş için NTBC olmadan tek kültür olacak. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Ertesi gün, MIC tahlil kurmak için LB + NTBC ve LB + DMSO usta çözümleri yapmak. Aşı ilave edildiğinde, bu da 600 uM bir konsantrasyonda NTBC ekleyin 300 uM'lik bir nihai konsantrasyon verecek şekilde, iki kat seyreltilmiş olacaktır.
    1. Bir antibi test etmek içintek zorlanma, 2 ml LB 600 mcM NTBC ekleyebilir ve NTBC ana çözüm yapmak mix otik. 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim ilave edin ve herhangi bir NTBC ana çözelti yapmak için karıştırın. Antibiyotik stok solüsyonları oluşturmak için hem de 96-yuvalı plakalar içinde bir seyreltme serisi ayarlamak için bu çözüm kullanın.
      NOT: Master çözüm formülasyonları pipetleme hataları hesaba ekstra bir çözüm sağlayacaktır. Test antibiyotik ve suşların sayısına bağlı olarak gerektiği gibi usta çözümleri yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir.
  3. LB + NTBC veya LB + DMSO usta çözümleri antibiyotik çözümler hazırlayın.
    Not: Bu çözeltiler antibiyotik konsantrasyonu iki istenen son konsantrasyonu olmalıdır. Yeterli çözelti 96 oyuklu bir plaka içerisinde dört gözeneğe 100 ul aktarma yapılmalıdır.
    1. Gentamisin +/- 64 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. 450 gentamisin stokunun 0.288 ul (100 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmakul LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözüm.
      NOT: P. gentamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 32 ug / ml'dir.
    2. Kanamisin +/- 256 ug / ml NTBC stok solüsyonu olun. 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere kanamisin stokunun 3,84 ul (30 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmak için.
      NOT: P. kanamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 128 ug / ml'dir.
    3. Tobramisin +/- 8 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti yapmak 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere tobramisin stokunun 0,36 ul (10 mg / ml) ekleyin.
      NOT: P. İçin aeruginosa PAO1 tobramisin maksimum konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
      Not: Test edilecek bakteriler için antibiyotikler ve konsantrasyonlar ayarlanabilir.
  4. Bir 96-yuvalı plaka içinde dört gözeneğe her 2x antibiyotik çözeltisinin 100 ul ekle. Exampl için satır A'da bu çözümleri yerleştirine, gentamisin A4 boyunca A1 yerleştirilmelidir, kanamisin A8 ile A5 yerleştirilmelidir ve tobramisin A12 ile A9 yerleştirilmelidir. Kurmak 96 oyuklu bir plakanın şeması için Şekil 1A bakınız.
    Not: Çoklu antibiyotik bir plaka olarak test edilebilir, ancak yalnızca tek bir suş başka türlerden gelen çapraz kirlenme ihtimalinin ortadan kaldırılması için plaka başına test edilmelidir.
  5. 96 oyuklu plakanın H den satır B LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözeltisi 50 ul ekle. Bu bir tabak olun LB + NTBC ve bir tabak LB + DMSO olduğunu. Şekil 1A bakınız.
    1. LB + antibiyotiklerin NTBC LB + NTBC kullanın. LB + DMSO antibiyotikler için LB + DMSO kullanın.
  6. Bir mikropipet pipet ipuçları değiştirmek, B. karıştırın çözüm satır satır A solüsyonu 50 ul aktararak antibiyotik iki kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek kullanarak ve satır B solüsyonu 50 ul transferi C. tekrarlayın satır remaining satırlar. Satır G sulandırarak sonra o satır ve artıklar gelen çözelti 50 ul çıkarın. Bakteriyel büyüme için hiçbir antibiyotik kontrol olarak satır H kullanın. Şekil 1B bakınız.
    NOT: G aracılığıyla her biri iyi satırlarda A şimdi 2X LB + NTBC veya LB + DMSO antibiyotiğin 50 ul nihai istenen konsantrasyon içerir. Satır H hiçbir antibiyotik LB + NTBC veya LB + DMSO içerir.
  7. Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce tüm kültürleri yıkayın.
    1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Bir mikropipetöre ile Süpernatantı ve 1 ml LB hücre pelletini
  8. LB içinde 2.75x10 5 CFU / ml gecede kültürleri sulandırınız
    NOT: Bir OD 600 adet P. 1x10 9 CFU / ml eşdeğer olduğunu varsayalım aeruginosa. CFU / ml dönüşümleri OD d edilebilirDiğer bakteri ifferent.
  9. Uygun kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürü 50 ul ekleyin.
    Not: NTBC yetiştirilen kültürler DMSO içinde yetiştirilen NTBC ve kültürler DMSO ihtiva eden oyuklara ilave edilmelidir içeren oyuklara ilave edilmelidir. Şekil 1B bakınız.
    1. Her bir suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyu bakteriler ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak hareket etmek dördüncü kuyuya LB 50 ul ekleyin. Şekil 1B bakınız.
    2. Boşlukların aşılanması için çok kanallı bir micropipettor kullanın. Komşu kuyuların kirlenmesini önlemek için inokulum eklerken ipuçları kuyuların dibine yakın olduğu pipet olun.
      NOT: kuyulara bakteri kültürü eklemek antibiyotik ve NTBC yoğunluklanyla iki kat sulandırmak olur.
  10. Parafilm, 96 gözlü levhalar kapatılır ve 37 ° C'de yaklaşık 24 saat inkübe edilir. Bir hava kuluçka makinesi içinde, statik 96 oyuklu inkübe edin.
  11. Incelemekkuyularda bakteriyel büyüme için plakalar. MIC bakteriyel büyüme her suşun her üç kopya için görülebilir olduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu.
    1. Görme büyüme için plaka incelemek veya OD 600 plaka okuyucu seti kullanarak okuyun.

Oksidatif Stres Tepki için 4. Nokta Plaka Testi

  1. Aşama 3.1'de tarif edildiği gibi suşların ayarlama gece boyunca kültürler NTBC LB ve olmaksızın test edilecek.
  2. Sonraki gün, bir oksitleyici zor olarak H2O 2 ihtiva eden LB agar plakaları hazırlamak. 0 ila 1 mM, H bir dizi 2 O 2 konsantrasyonları için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
    1. LB agar şişeler eritin. Oda sıcaklığında, yaklaşık 50 ° C'ye soğutun ortam.
    2. Arzu edilen konsantrasyonlarda soğutuldu ortam doğrudan O 2 H 2 ekleyin. Girdap şişeler karıştırın. H konsantrasyonları için Tablo 2'ye bakınız 2 O 2ve konsantre H 2 O 2 hacimleri ekleyin. Bu değerler, LB agar 100 ml dayanmaktadır.
    3. Hemen kabarcıklarını çıkarmak için H 2 O 2 ve alev yüzeyi ekledikten sonra plakaları dökün. Verim LB agar 100 ml başına 4 plakalarının. H 2 O 2 konsantrasyonu ile plakaları işaretleyin.
    4. Plakalardan fazla nemi çıkarmak için 30 dakika boyunca çalışan fan ile biyolojik akış kaputu ele tabak yerleştirin.
      NOT: tabak onlar hazırlanır aynı gün kullanın. Bunu yapmamak tutarsız verileri neden olabilir.
      NOT: paraquat oksidatif stres, bu tahlilde, H2O 2 ikame edilebilir. Diğer oksidatif stres için kullanılan konsantrasyonlar, H2O 2 için kullanılanlardan farklı olabilir.
  3. Yıkayın ve adım 3.7'de açıklandığı gibi OD gecede kültürlerin 600 ölçün.
  4. Bütün gece boyunca cu OD 600 Normalesuşları seti için en düşük değere ltures denenmektedir. P. aeruginosa genel LB + NTBC ya da LB + DMSO içinde gece boyunca büyütülmüştür, yaklaşık 2.5 OD 600 yer alır.
    1. 1 ml 'lik bir toplam hacim içinde düşük OD 600 kültürün seyreltilmesi için ihtiyaç duyulan kültür hacminin belirlenmesi. Bir kültür OD 3 600 ve suşlar grubu için en düşük OD 600 yer alır, örneğin, 2.5 olan aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek: (2.5) (1 mi) = (3) (x). x = 0.833 mi. Kültür 0,833 ml kadar bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir.
    2. 1 ml kültür hacmi getirmek için gerekli LB + NTBC (300 uM) ya da LB + DMSO miktarını hesaplayın. Aşama 4.4.1 Örneğin, LB + NTBC ya da LB + DMSO miktarı 0,167 ml (- 0,833 ml kültür, 1 ml toplam hacim) olacak kültüre ilave edildi. LB + NTBC ve LB + DMSO stok çözeltileri, tüm suşları seyreltilmesi için gerekli hacme dayanarak bu dilüsyonları için kullandığınızdan emin olun.
    3. Kültür ve LB + N MixVorteks TBC veya LB + DMSO.
  5. NTBC veya DMSO sabit bir konsantrasyonda kültürleri korumak için, PBS + NTBC veya PBS + DMSO normalize gece boyunca kültürler on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek.
    1. PBS + NTBC ve PBS + DMSO stok çözümleri olun. Bir suşu için seyreltileri bir set için, 720 ul bir toplam hacim elde etmek üzere 300 uM NTBC veya PBS ile eşdeğerli bir DMSO hacmi karıştırın. Test kaç suşları bağlı yukarı veya aşağı bu stokları Scale.
    2. 10 -7 seri seyreltme ile 10 -1 Label mikrofuge'de tüpleri. Uygun tüplere PBS + NTBC veya PBS + DMSO 90 ul ekle. LB + NTBC yetiştirilen suşları için PBS + NTBC kullanımı ve LB + DMSO içinde yetiştirilen suşları için PBS + DMSO kullanılır.
    3. Uygun 10 -1 seyreltme tüp kültür 10 ul ekleyin. Vorteks karıştırın ve 10 -2 seyreltme tüpüne 10 -1 seyreltme 10 ul aktarın. Tüm seyreltmeler perfo olmuştur kadar tekrarlayınonaylanmamis. Seyreltilerde arasındaki pipet ipuçları değiştirin.
  6. Her bir suş için kopya halinde LB + H 2 O 2 plakaları üzerinde 10 -7 seyreltileri 10 -3 Spot 5 ul. Noktalar kaplanır, en az seyreltilmiş (10 -7 -3 10) sulandırmak itibaren bir pipet ucu kullanın. İpucu veya sıvı plakasına kuruyana kadar plaka eğmeyin.
  7. Suşuna bağlı olarak 37 ° C'nin (hava kuluçka makinesinde) de 24-48 saat süreyle inkübe edin.
    NOT: P. aeruginosa PAO1 inkübasyon 24 saat sonra LB iyi ölçekli koloniler olacaktır. Bunlar koloniler PAO1 ile yaklaşık olarak aynı boyuta sahip olana kadar suşları inkübe edin.
  8. Bir transluminator üstünde bir CCD kamera kullanarak plakaları fotoğrafını. İsteğe bağlı olarak, aynı boyutta aksine ve ekme için fotoğraflarınızı düzenleyebilir. Oksidatif strese duyarlılık değişiklikleri belirlemek için her yerde koloni sayısını sayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NTBC titrasyonları

NTBC P. pyomelanin üretimini azaltmak mümkün olsaydı NTBC titrasyonları belirlemek için kullanıldı aeruginosa ve aynı zamanda ortadan kaldırır ya da ek tahlillerinde kullanım için üretim pyomelanin azaltır NTBC konsantrasyonunu belirler. Farklı tekrarlamalı üretilen pyomelanin seviyelerindeki varyasyonlar olabilir, ama genel eğilimler sabit kalabilir. NTBC titrasyon testi, diğer bakterilerde pigment üretiminin etkileyebilecek diğer bileşikleri test etmek ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde açıklanan NTBC titrasyon yöntemi, kullanıcının NTBC'nin bakterilerde pyomelanin üretimini azaltıp azaltamayacağını veya ortadan kaldırıp kaldıramayacağını belirlemesine ve gerekli NTBC konsantrasyonunu belirlemesine olanak tanır. NTBC titrasyon testindeki en kritik adım, testte kullanılacak NTBC konsantrasyonlarının aralığını belirlemektir. Farklı P. aeruginosa suşları NTBC'ye karşı farklı duyarlılıklara sahiptir ve laboratuvar suşları NTBC'ye klinik izolatlardan12 daha duyarlı olabilir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, suşlara cömert katkıları için Dara Frank ve Carrie Harwood'a teşekkür eder. Wisconsin Üniversitesi Milwaukee Araştırma Vakfı, 8,354,451 numaralı patente sahiptir; 2-[2-nitro-4- (triflorometil)benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC) gibi bir 4-hidroksifenilpiruvat dioksijenaz inhibe edici bileşik uygulayarak bir hastada bir mikroorganizmanın enfeksiyonunun ilerlemesini tedavi etmeye veya inhibe etmeye yönelik iddialarla. Mucitler Graham Moran ve Pang He'dir. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R00-GM083147) tarafından desteklenmiştir. Washington Üniversitesi P. aeruginosa transpozon mutant kütüphanesi NIH P30 DK089507 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC)Sigma-AldrichSML0269-50mgAyrıca nitinon olarak da adlandırılır. DMSO'da çözünür.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100MLağırlıkça %30 H2O.  Stabilize.
GentamisinAltın BioG-400-100H2O.  Filtre sterilize eder.
KanamisinFisher ScientificBP906-5H2O.  Filtre sterilize eder.
TobramisinSigma-AldrichT4014-100MGH2O.  Filtre sterilize eder.

Kaynaklar

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NTBC TitrasyonuOksidatif Stres AnaliziMIC AnaliziBakteriyel Duyarl l kHidrojen PeroksitAntibiyotik DirenciSpot Plaka Y ntemiSeri Dil syonPseudomonas Aeruginosa

İlgili makaleler