CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü
Bu makalede
Özet
Özet
Beyindeki glial hücreleri gibi, astrositler, merkezi sinir sistemindeki çeşitli işlevsel rolleri vardır. Zararlı uyaranların varlığında, astrositler işlevsel ve yapısal özellikler, reaktif astrogliasis denilen bir durum değiştirir. Burada, astrositler morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için protokol verilmektedir. Bu protokol şube yüzey alanı ve bir astrosit (astrosit topraklarında) kapsamında dokusu, şube, hücre gövdesi ve nukleus dahil olmak üzere tüm astrosit, hacmi, yani 12 farklı parametrelerin ölçümü yanı sıra toplam uzunluğu ve numarasını içeren, şiddeti astrosit tespiti için kullanılan antikorların floresan immünoreaktivitesinin ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2) evi. Volocity 6,3 ölçümleri için kullanılmıştır gibi, bu amaç için, üç boyutlu (3D) odaklı mikroskopik resimleri oluşturulur, ve 3 boyutlu görüntü analizi yazılımı gibi bulundu. Amiloid beta 1-40 maruz Sıçan beyin dokusu 1-40) bir yöntem mevcut için kullanılmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, in vivo ya da in vitro koşullarında ya da diğer hücre 3D morfometrik analizi için kullanılabilir.
Giriş
Sağlıklı, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde, astrositler, kan akışı, enerji metabolizmasında, sinaptik fonksiyon ve plastisite ve hücre dışı iyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar ve nörotransmitter 1-3 homeostazı. Buna ek olarak, astrositler farklı zararlı uyaranlara ve hipertrofisi, çoğalması ve astrositler 4,5 fonksiyonel biçimlenme ile karakterizedir reaktif astrogliyozun yoluyla travma, enfeksiyon, iskemi veya nörodejenerasyon gibi anormal şartlarda cevap.
Reaktif astrogliasis terapötik girişimlerin klinik sonuçlarını etkileyebilir, bu nedenle, dokuda inflamatuar yanıtı ve onarım sürecini mühendis ve olabilir. Buna göre, astrocytes MSS etkileyen hastalıkların çeşitli terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler olarak son yıllarda nörobilimci dikkati aldık.
Astrositler normalde iyi-d ile stellat şekli varsoma 6 çevresinde yayıldı efined dalları. Beyindeki hastalıklı durumda, astrosit dalları kıvrık hale gelir ve amiloid beta (Aβ) mevcudiyetinde, örneğin, şiş uçları 7 göstermektedir.
Bu makale konfokal mikroskobu ile elde edilen astrositlerin 3D görüntüleri analiz etmek için bir protokol sunar. Her astrosit için on iki farklı sayısal parametreler ölçüldü: yüzey alanları ve astrosit topraklarında (bir astrosit kaplı dokusu), (şubeler dahil) tüm hücre, hücre gövdesi ve nükleus hacimleri; Toplam uzunluğu ve şube sayısının; astrosit tespiti için kullanılan antikorların flüoresan yoğunluğu; ve astrositlerde yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2). Bu amaçla, ya da bir anti-enflamatuvar madde olarak genistein muamelesi olmadan Aβ 1-40 enjeksiyon intrahipokampal maruz farelerin beyin bölümleri kullanılır. Açıklanan protokol morfometrik An için kullanılabilirin vitro veya farklı koşullar altında in vivo olarak farklı hücre tipleri Analizi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi Etik Komitesi (Tahran, İran) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (NIH) için Kılavuzu'nda belirtilen politikalara uygun olarak yürütülmüştür.
1. Hayvanlar, Cerrahi ve Numune Hazırlıklar
NOT: 3D odaklı mikroskopik analiz için beyin dokusunu hazırlayın.
- Iki gruba rastgele Divide hayvanları: Aβ 1-40 -injection (n = 8) ve genistein, tedaviden Aβ 1-40 -injection (n = 8); ameliyat öncesi sonda 1 saat ile genistein (örneğin, polietoksile hint yağı gibi bir araç içerisinde seyreltilmiş 10 mg / kg) tatbik.
- Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile anestezi. Ayak sıkıştırdıktan sonra geri çekme refleksi eksikliği ile doğru anestezi onaylayın. Kuruluğunu önlemek için ameliyat sırasında göze merhem kullanın.
- Stereotaksik aparat ve tıraş baş hayvanları yerleştirin. IoD Uygulaine çözüm insizyon yapılmadan önce derisini temizlemek ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat sırasında steril operasyon siteyi tutmak için. Sıçan beyin atlas 8'e göre, bregma -3.5 mm posterior, orta hatta kadar ± 2 mm lateral ve dura altında -2.8 mm hipokampus Aβ 1-40 stereotaxically (4 ul) enjekte edilir. Stereotaksik yöntem için bir önceki yayın 9 bakınız.
- Hayvanlar hayvanların rahatı için tam bilinçli kadar post-operatif gözlem / bakım sağlar. Kurtarma sırasında sıcak hayvanları tutun ve tam iyileşme kadar diğer hayvanlarla bir kafese dönmelerini yok. Ameliyattan sonra hayvanlarda enfeksiyon belirtisi dikkat edin.
- Üç hafta ameliyat sonrası ketamin (150 mg / kg) ile derin hayvanların anestezisi. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından% 0.9 tuzlu su hayvanları perfüze transcardial tespit gerçekleştirmek, çıkarıp 10 de tarif edildiği gibi tamir/ sup>.
- 4 ° C'de 2-3 gün süreyle% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin.
- Doku gömme ekipman kullanımı ile parafin blokları doku gömün ve doğru hizalama ya da kesit engel olabilir çünkü dolum-under veya aşırı doldurma kaseti kaçının. Parafin blok içinde doku yönüne dikkat edin.
NOT: Sıçan hipokampus, örneğin, serebral hemisferin posterior kısmına yakındır. Böylece doku şekilde gömülü olmalıdır beynin posterior kısmında kesit başlar söyledi. Istenen anatomik yapıyı ulaşmak için bir rehber olarak Paxinos atlas 8 kullanın. - Hava hareketleri zor bölümlerden işlenmesini yapmak beri uzak, hava taslaklar veya kapı gelen mikrotom yerleştirin.
- Bu derinlik gerekli olduğu gibi tam astrositlerin Z-Stack görüntüler üretmek için bir kalınlık ≥20 um ile bölümleri kullanın. Onlar istenmeyen kalınlığa sahip olabilir ısıl e, ilk çift bölümleri kullanmayınXpansion.
- (5 ± 2 ˚C, parafin erime sıcaklığının altında) sadece yeterince uzun bölümler düzleştirmek için ılık su yüzeyinde bölümleri yerleştirin.
NOT: bölümün genişleme yapısının morfoloji rahatsız edebilir Aşırı. Dikkatle bölümleri aktarmak için minik fırça kullanın. Her slaytta iki ya da üç bölümden toplayın. - Mağaza dik bir pozisyonda rafa slaytlar ve çeşitli saat veya O / N 37 ° C'de kurumaya bırakın.
2. İmmünhistokimya
- Deparaffinize ksilen bölümler, 2 x 10 dakika, ve alkol gradyanı ile (99.8,% 95 ve% 70,% 10 dk) ve PBS rehidrate.
- % 0.25 sığır serum albümini (BSA),% 0.25 Triton X-100 ve% 3.5 normal serum (4 ° C'de O / N) içeren PBS içinde 1500: glial fibriler asidik protein (GFAP) yönelik antikorlar ile inkübe 1 seyreltilmiştir.
- 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın.
- İkincil alkalin fosfat ile konjüge edilmiş Antikorların kuluçkalayın1 saat s (PBS içerisinde 1: 100 seyreltilmiş, 21 ° C,).
- 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın.
NOT: Bu arka plan boyama en aza indirmek için ikincil antikorlar sonra düzgün bölümleri yıkamak önemlidir. - Sıvı Daimi Kırmızı kromojeni (15-20 dk) ile karanlıkta bölümleri inkübe edin. Not: Kullanımdan önce en fazla 30 dakika çözeltisi hazırlayın.
- 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın.
- Son olarak, 4-6-diamidino-2-fenilindol çekirdekleri leke (DAPI; PBS içerisinde 1: 500 seyreltilmiş), önceden kapak-kayma. Mikroskopi önce buzdolabı 24-48 saat slaytlar saklayın.
3. Konfokal Mikroskop
NOT: kantitatif değerlendirme (aşağıya bakınız) için, hata riskini azaltmak için şube örtüşen minimum açıkça görülebilir DAPI lekeli çekirdeğe sahip bir astrosit seçin. Z-Stack görüntüler üreten zaman alıcıdır. Sabırlı olun ve işleme sırasında bitmiyor. Dik konfokal lazer tarama mikroskobu u olduğuastrositlerden 3D görüntüler oluşturmak için sed.
- Mikroskop-sahnede slayt yerleştirin ve 63X objektif seçin.
- Görüntüleme yazılımı açın ve Start sisteminde tıklayın. Locate sekmesine tıklayın. Ata gidin ve uygun ışık ayarlamak için GFP seçin.
- Işığı yansıtmak için Shutter açın. Shutter sağ tarafındaki Reflektör Revolver bulun ve astrositler (yeşil, kırmızı veya mor) tarafından yansıtılmalıdır rengi seçin; (FSet20 wf) kırmızı renk burada kullanıldı.
NOT: mikroskobunun oküleri doğrudan resmi odaklanmak unutmayın. - En iyi Odağı bulmak için, tüm kapalı tıklayın ekran modunda mikroskop pimini koymak ve Toplama sekmesine tıklayın.
- Toplama sekmesi altındaki Akıllı Kur tıklayın; Bir pencere açılır. Listeden (geçerli proje yani DAPI ve Alexa Fluor 555) uygun fluorofor seçin. Renk otomatik olarak seçilir.
- En iyi sinyal üzerine tıklayın ve uygulayın, ardından Set Pozlama tıklayın; Daha sonra bilgisayar otomatik olarak pozlama parametrelerini ayarlamak olacaktır.
- Görüntüyü optimize için Kanallar penceresine gidin. Kaldır Track2, Track1 vurgulayın ve canlı tıklayın. Gerekirse görüntü odaklanın.
- Kanallar penceresinde aşağıdaki anahtarları ayarlamak; otomatik iğne deliği optimize etmek 1AU tıklayın. Aksi takdirde konfokal görüntüleri optimal olmayan olacaktır bu adımı yapmak çok önemlidir. En iyi yoğunluğunu (ekstra gürültüyü azaltmak için 800 altında bu ayarı tutmak) için Kazanç ayarlayın. Son olarak, 2 ve 3 arasında Dijital Kazanç ayarlayın.
- Kaldır Track1 Track2 tıklayın ve Track2 için Adım 3.8 tekrarlayın. Sonra Canlı dur.
- Toplama Modu penceresine gidin. Çerçeve Boyutu optimize ve Averaging görüntüyü geliştirin. Değiştirmek için çerçeve boyutu X * Y gidip x 1,024 1.024 seçin. Daha iyi bir görüntü oluşturmak için yavaş Speed seçin.
- Ortalaması gidin ve Numara ≥4 seçin. Bu ortalama değer özel üretmek için ortalama edilecek taramaların sayısını gösteriredinilen görüntüyü e. Şimdi Yapış düğmesini tıklatın ve yakalanan 2B görüntüyü kaydedin.
- 3D görüntüleme için, Z-Stack penceresi açmak için neden Akıllı Kur kapsamında Z-Stack öğeyi işaretlemek.
- Hücrenin derinliği, yani Z-Yığın için ilk ve son pozisyonları ayarlayın. İlk Canlı tıklayınız. Sonra Z-Stack başlatmak için dokuda astrosit en üst pozisyona odaklanmak için mikroskop odak sürücü kullanın. Set İlk tıklayın. Sonra Z-Stack tarama kesilmelidir dokuda astrosit en düşük pozisyona aşağı odaklanın. Set Son üzerine tıklayın. Sonra Canlı dur.
- Aralığı Seçin; 1.01 mikron Bu çalışmada kullanılan; seçme aralığı dilim sayısını ayarlamak için Optimal tıklayarak yapılabilir.
- Başlat Deneyi tıklayın. Tarama tamamlandığında görüntüleri kaydetme. Yüzey alanı ve astrosit topraklarının hacmi, tüm astrosit dahil sutyen: Bu görüntü aşağıdaki parametrelerin ölçümü için kullanılacaknches hücre gövdesi ve çekirdek.
- Adımlar 3,6-3,11 de tarif edildiği gibi, bir 10X ya da 20X objektif kullanarak bir 2D görüntü elde. Bu görüntü ölçümü için antikorların floresan immüno ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 um 2) yoğunluğu kullanılabilir.
4. Astrosit yoğunluğu ve GFAP + Floresans yoğunluğu
- 20X 2B görüntü açın. Görüntü penceresinin sol tarafındaki Histo (Hisogram) tıklayın.
- Astrosit yoğunluğunu hesaplamak için, 20X objektif altında arka arkaya üç görsel alanları seçin. Alanlarda şube örtüşen, minimum net soma sergileyen astrositlerde sayısını.
- Floresan ölçmek için, görüntü penceresinin altbilgi üzerinde uygun bir alet (dikdörtgen veya daire) seçin ve ölçümü için bir alan seçin. Ortalama değer ve standart sapma görüntünün altında otomatik olarak görünür unutmayın. Str arasındaki mevcut çalışmada, 0.7 mm 2 dikdörtgen alaniatum ve dentat girusun medial bıçak kullanılmıştır.
5. Astrosit Şubeler
- Şube uzunluğu ve toplam sayısını ölçmek için, görüntü analiz yazılımı (20X ile kazanılmış) 3D görüntüler kullanın. Seçilen astrosit her dalının uzunluğu boyunca elle bir çizgi çizin. Sonra hat-uzunluk ölçmek için uzman ölçme-aracını seçin. Şube sayısını ölçmek için, işaretli öğelerin sayısını saymak için sayım aracını seçin.
6. Hacim ve Yüzey Alanı
NOT: 3D görüntü analiz yazılımı elle bir yapıya işaretleme odak ve eğitim gerektirir. Bir deney başlamadan önce birkaç kez uygulayın.
- Astrosit çekirdeğinin, soma, hücre gövdesi ve toprak hacim ve yüzey alanı ölçmek için, örneğin Volocity 6.1 gibi 3D görüntü analiz yazılımı (Merdivenleri 3,1-3,16 elde) 3D görüntü aktarmak.
- Yazılımını açın ve yeni bir oluşturmakkütüphane. Yeni kütüphanede sol gri sütuna tüm görüntüleri sürükleyin. Sonra bir 3D görüntü seçin. Sağda, farklı renklerde, farklı kanallar vardır. Çevrede bir kanalda açın; Örneğin DAPI için mavi kanal çekirdeğe ölçerken. Optimal kontrast elde etmek için elle parlaklığını değiştirin.
- Araçlar menüsünü seçin, Ses yapın ve Z-yığın görüntüleri dışarı tek bir 3D görüntü üretmek için gidin. Düzen menüsünde Özellikler'i tıklatın ve X, Y ve Z özellikleri sunulmaktadır emin olun; aksi takdirde 3D analizlerini yürütmek mümkün değildir.
- Araç çubuğundaki Freehand RIO aracı simgesini tıklayın. Astrosit çekirdeğinin hacmi ve yüzey alanı ölçmek için DAPI etiketli çekirdeği etrafında bir çizgi çizin.
- Astrosit hücre gövdesi hacmi ve yüzey alanı ölçmek için şubeler hariç soma etrafında bir çizgi çizin.
- Tüm astrosit (şubeler dahil hücre gövdesi) hacmi ve yüzey alanı ölçmek için aşağıdaki soma etrafında bir çizgi çizintüm branşlarda yüzey.
- Astrosit topraklarının hacmi ve yüzey alanı değerlendirmek için şube uçları arasına bir çizgi çizin.
NOT: Basın istenmeyen çizimleri silmek için klavyedeki Delete. - Bir ölçüm protokolünü oluşturmak için görüntü penceresinin üst kısmında ölçümler menüsüne tıklayın; farklı araçlar içeren bir pencere açılır.
- Sürükle penceresi (bölme) üstüne nesneleri bulun. Nüfus 1 açıklayıcı bir ad verin ilişkili rengi seçin ve Tedbir tıklayın. Başka bir pencere açılır.
- Bir parametre, yani hacim veya yüzey alanı seçin. Tamam'a tıklayın. Veriler tabloda görünecektir.
- Ölçüm menüsünde veri tıklayınız kaydetmek ve Ölçüm Item seçeneğini belirleyin.
- Açılan pencereden adlı yeni bir ölçüm öğesini seçin. Sonra verilere bir ad verin ve Tamam'a tıklayın.
- Son olarak, Graph ped olarak istatistik yazılımı veri ihracat veya programı excel. Verileri analiz t-testi kullanın, ardından 2B gr arsaAPHS.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu bölüm 3B morfometrik analizi ile üretilen, nicel ve nitel gözlemlere ilişkin bazı örnekler verilmektedir. Daha önce de belirttiğimiz 12 parametrelerin tam sonuçlar için, önceki yayın 10 bakın.
Nitel Gözlemler
Astrositler Aβ 1-40 enjekte sıçanlar (Şekil 1) genellikle uzun olan ince veya kalın dalları sergiledi. Kısa dalları ile birkaç küçük stellat şeklindeki astrositler serebral korteks gözlendi ve astrositlerde kompakt b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Geçerli protokol, astrosit morfolojisi ile ilişkili 12 farklı parametrelerini değerlendirmek için 3D konfokal morfometrisi kullandı. Bu amaçla, Aβ 1-40 olan sıçanların hipokamp dokusunda - ya da bir anti-enflamatuvar ajan olarak genistein, ön muamele olmaksızın uyarılan astrogliyozun kullanılmıştır. 3D görüntüler ve morfometrik yazılımını kullanarak, astrositlerde morfolojisi yani astrogliyozun üzerinde genistein etkisini göstermek başardık.
Beyin dokusu içi ve...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi (Tahran, İran) Östergötland County Konseyi (İsveç) ve Hücresel ve Moleküler Araştırma Merkezi hibe ile desteklenmiştir.
Teşekkürler
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amiloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | -70 &°C'de tutun; C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | -20 & derece; C |
| glial fibriler asidik proteine karşı polikolonal tavşan antikorları | DAKO | Z0334 | |
| alkalin fosfat konjuge domuz anti-tavşan IgG antikorları | DAKO | ||
| Sıvı Kalıcı Kromojen | DAKO | K0640 | |
| Sıvı kalıcı Kırmızı Yüzey Tamponu | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polietoksillenmiş hint yağı - Adım 1.1 |
| LSM 700 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc.,Görüntü | ||
| Analizi 2000 | Tekno Optik | ||
| Streotaksik aparat | Çalma | ||
| Grafik pedi Prizma 5 | Grafik pedi yazılımı Inc. |
Kaynaklar
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
