Analizi Yersinia enterocolitica Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Tip III salgılama sistemleri, doğrudan ökaryotik hedef hücrelere bakterisel olarak kodlanmış proteinlerin efektör sağlamak için gram negatif bakterilerin farklı cins tarafından kullanılan özel bir protein ihracatı makinelerdir. Salgılanması mekanizmasının kendisi yüksek ölçüde korunmuş olsa da, efektör proteinler uzman setleri hücresel sinyal yolları değiştirmek ve belirli bir bakteriyel hastalık stratejileri ¹ kolaylaştırmak için farklı bakteri türleri arasında gelişmiştir. Yersinia durumunda, yedi efektör proteinler olarak adlandırılan Yops (Yersinia dış proteinler) 'ye kadar, konakçı hücre temas üzerine transloke ve örneğin, fagositoz ve sitokin üretimi, immün hücresi tepkilerini bozmak için birlikte hareket edilir, bakterilerin hücre dışı sürdüreceği ^2-4. Translokasyon süreci sıkı farklı aşamalarında ⁵ kontrol edilir. Bu T3SS birincil aktivasyon hedef ce onun temas ile tetiklenen olduğunun tespit edilmesill ^6. Ancak, bu inisiyasyon kesin mekanizması henüz aydınlatılamamıştır olmaktır. Yersinia ise translokasyon sözde ince ayar bir ikinci düzey Up-by veya aşağı-düzenleyen hücresel Rho GTP-bağlayıcı proteinlerin Rac1 veya RhoA aktivitesini elde edilir. Invazın veya sitotoksik nekrotizan faktör Y (CNF-Y) örneğin Rac1 Aktivasyon GAP transloke YopE işlevini (GTPaz protein aktive) ise Rac1 aktivitesini aşağı düzenler ve buna göre bir negatif geribildirim türü translokasyonu azaltır, artan translokasyon ^7-9 yol açar mekanizması ^10,11.

Geçerli ve hassas yöntemler translokasyon Yersinia konak hücre etkileşim sırasında nasıl düzenlendiği araştırmak için önkoşuldur. Birçok farklı sistemleri özel avantajları ve sakıncaları ile birlikte, her biri bu amaç için kullanılmaktadır. Bazı yaklaşımlar western blot analizi ile, ardından farklı bir deterjan enfekte hücrelerin parçalanması değil, bakteri dayanmaktadır. ThBu yöntemlerin e ortak dezavantajı küçük ama kaçınılmaz bakteriyel lizis potansiyel bakteri ilişkili efektör proteinleri ile hücre lizat kirletir olmasıdır. Ancak, hücre dışı proteinler ve efektör ökaryotik hücrelerde seçici parçalanması digitonin sonraki kullanımının indirgemek için proteinaz K ile hücrelerinin tedavi, bu sorunu ¹² en aza indirmek için önerilmiştir. Önemli olarak, bu deneyler, en önemlisi, çoğunlukla, ticari olarak mevcut değildir, yüksek kaliteli, anti-efektör antikorları bağlıdır. Girişimleri floresan proteinleri küresel üçüncül yapısı ve sekresyon ¹³ önce onları açılmak için salgılama aygıtının yetersizlik muhtemelen başarılı nedeniyle değildi translokasyon izlemek için GFP gibi efektör proteinlerin çeviri füzyonlarının ve floresan proteinleri kullanmak için. ¹⁴ ya da Flash cyclolysin Bordetella pertussis toksin Ancak, CYA gibi birçok farklı raportör etiketleri (kalmodulin-bağımlı adenilat siklaz) etki alanıetiketi başarıyla translokasyon analiz etmek için kullanılmıştır. Flash etiket, çok kısa bir Tetracysteine ​​(4Cys) motifi etiketi, sekresyon işlemi bozmadan biarsenical boya Flash ile etiketlenmesi için izin verirken, eski deneyinde CYA enzimatik aktivitesi, hücre içi füzyon proteininin sinyal yükseltmek için kullanılır ^15.

Burada uygulanan yaklaşım, Charpentier vd., Ilk kez bildirilmiştir transloke efektör TEM-1 beta-laktamaz füzyonları ¹⁶ (Şekil 1 A) Förster rezonans enerji transferi (FRET) boya CCF4 hücre içi dönüşüm dayanır. CCF4 / AM kumarin türevi (donör) ve flöresan kısmı (akseptör) bir cephalosporin çekirdek ile birbirine takılmış olduğu, bir hücre nüfuz edici bileşiktir. Ökaryot hücreye pasif girmesinden sonra, CCF4 / AM bileşik esterlenmiş floresan olmayan ücret ve floresan CCF4 hücresel esterazlarla işlenir ve bu sayede tuzakhücre içinde. 530 nm'de bir yeşil floresan sinyali yayan floresein kısım için FRET 405 nm sonuçlara kumarin parçasının Uyarım. Beta-laktamaz FRET tarafından sefalosporin çekirdek ayrılmasından sonra bozulur ve kumarin kısmının uyarma nm AR460 mavi floresan emisyonuna yol açar. Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, in vitro olarak translokasyonu analizi sağlar ve aynı zamanda in vivo, örneğin, bu teknik, in vivo ^17-19 translokasyon için hedeflenen lökosit popülasyonları tanımlamak için, bir fare enfeksiyon modelinde kullanılmıştır. Sinyallerin okunması plaka okuyucusu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Unutmayın ki, yöntem aynı zamanda enfeksiyon süreci ^20,21 sırasında canlı hücre mikroskopi gerçek zamanlı translokasyonu izlemek için imkanı sağlar. Burada lazer tarama mikroskobu readou floresan uygulanmıştırfloresan sinyalleri t en yüksek hassasiyet ve doğruluk sağlar olarak. Özellikle, yetenek yüksek duyarlı dedektörler ile birlikte nanometre hassasiyetle emisyon penceresini floresens optimize edilmiş ve çapraz konuşma minimize kolaylaştırır ayarlamak için. Buna ek olarak, bu mikroskopi kurulum translokasyonun gerçek zamanlı izleme için uyarlanabilir ve potansiyel olarak hücresel düzeyde-konak etkileşim aynı anda analiz için izin verir.

Bir Y. Bu çalışmada translokasyon oranları enterocolitica vahşi tip suş ve hypertranslocator fenotip ^10,11 sergileyen YopE silme mutant örnek bir analiz edildi.

1. Tepe Emisyon ve Çapraz-talk Tayini (Ayrıca Bakınız Şekil 2)

1. Emisyon tepe ve verici arasındaki çapraz konuşma (kumarin türevi V450) ve akseptör (fluorescein), boyalar miktarını belirlemek 405 nm eksitasyon bireysel fluorophores hem ile etiketlenmiş hücrelerin spektral tarama işlemi gerçekleştirmek için.
2. Verici ve alıcı kanalları (buradan 455-465 nm ve 525-535 nm) için kullanılacak olan her bir boyadaki zirve içinde 10 nm bant genişliği belirler. Dalga boyu üzerinde normalleştirilmiş yoğunluğu arsa ve alıcı kanalı ve tersi (Şekil 2) donör boya çapraz konuşma ortalama yüzdesini hesaplamak.

Y'nin 2. Hazırlık Hücre Kültürü Enfeksiyon için enterocolitica Suşları

1. Aşağıdaki suşları kullanın: WA-314 PMK-ova ve (WA-314 ¹⁷ PMK-bla ve PMK-ova ^17, sırasıyla plazmidler ile transforme) WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-) ¹⁷ 314ΔYopE plazmid ile transforme PMK'yi-bla
2. Enfeksiyon çizgi Y. önce en az iki gün enterocolitica suşları WA-314 PMK-ova, WA-314 PMK-bla ve WA-314ΔE WA-314 PMK-bla ve WA-314 PMK-ova için (kanamisin gerekli antibiyotikleri içeren LB-agar plakaları üzerinde hisse senedi kriyo gelen PMK-bla ; kanamisin ve WA-314ΔE PMK-bla için tetrasiklin) ve 27 ° C'de O / N büyür. Daha sonra bir haftaya kadar 4 ° C plakaları tutun.
3. Enfeksiyondan bir gün önce, ilgili suşlarının bir koloni ile istenen antibiyotik içeren LB-ortamı içinde 3 ml inoküle ve 180 rpm'de bir çalkalama 27 ° C 'de O / N inkübe edin.
4. Enfeksiyonun günde antibiyotikler olmadan, taze LB-ortamı içinde 40 ml O / N kültürünün 2 ml'sini aşılamak ve tip III sekresyon sisteminde ekspresyonunu indüklemek için 180 rpm'de bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C 'de 90 dakika boyunca inkübe edin.
5. Uygun bir tüp içine kültürleri aktarın ve C buz üzerinde veya 4 ° kültürleri tutmakbundan sonra. 5000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca kültürler santrifüj.
6. Buz 2-3 ml soğuk PBS bakteriyel pelletini. Bir spektrofotometre kullanılarak, 8 x 10 ⁸ cfu / ml'lik bir konsantrasyona kadar bakteri süspansiyonu ile seyreltilir. Ayrı ayrı ilgili optik yoğunluk belirlenir. HeLa hücrelerini enfekte kadar buz üzerinde bu süspansiyon tutun.

3. Kaplama HeLa Hücreleri

1. 96 gözlü bir levhanın gözleri içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden ve 37 ° C'de _bir% 5 CO2 inkübatörü içinde yetiştirmek 200 ul DMEM içinde bir gün enfeksiyon tohum önce 1.5 x 10 ⁴ hücre HeLa hücreleri. Her bir suş (üç farklı inkübasyon kez) üç kuyu Seed.

4. HeLa Hücreleri Enfeksiyon ve CCF4 ile yükleme

1. Orta bakteriyel süspansiyon 3.5 ul ekleyerek HeLa hücreleri enfekte ve nazikçe orta kez pipetleme karıştırın. Bakteriler üzerinde çökelmesi için izin verHücre başına yaklaşık olarak 100 bakteri MOI (enfeksiyon kısmı) hücrelere. Bir zaman süreci için -90 dakikada, -60 dakika ve -30 dakikada enfeksiyonları başlatmak ve ortak bir uç noktası elde etmek için 0 dakika kadar _bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
2. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde HeLa hücreleri çıkarmadan orta aspire ve CCF4 ihracat azaltmak için efektör ve 2.5 mM probenesid ekspresyonunu durdurmak için 20 ug / ml kloramfenikol içeren PBS 50 ul ekle.
3. Bu noktada, bir mikroskop kademesine 96 oyuklu plaka transfer ve de her biri daha sonraki analizler için uygun noktalar tanımlar. 10 dakika içinde bu adımı tamamlayın (edinim ayrıntıları için bakınız bölüm 5.1).
4. Ortalama de, 20 içeren CCF4 / AM yükleme çözeltisi (0.24 ul çözelti A, 1.2 ul çözelti B, 70 ul, 18.56 ul çözelti C (çözelti A, B, ve C CCF4 / AM yükleme kiti içinde temin) ve 50 ul PBS (ekleme Çok p kullanılarak ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesid)ipette oda sıcaklığında 5 dakika inkübe vb. Şimdi çalışma kesintisiz itibaren.
5. Yükleme solüsyonu aspire ve çok pipet kullanılarak 20 ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesit içeren 100 ul PBS ilave edin. Sonra hızla mikroskop aşamaya 96 plaka aktarmak ve yükleme çözümünün aspirasyonu 10 dakika içinde alımı başlatabilirsiniz.

5. Lazer Tarama Mikroskopi ve Veri Analizi

1. Görüntü edinimi
   1. Fototoksisite, Photobleaching ve çapraz uyarma toplam foton sayısını en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için bir şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın.
      1. Modern bir konfokal lazer tarama mikroskobu, aynı anda aktif donör ve alıcı kanalları, 8 bit derinliği ile yüksek hassasiyet GaAsP-dedektörleri seçin 2.5 Airy birimlerinin (yani, geniş optik kesit) detektör iğne deliği açmak, 20X yüksek sayısal açıklık daldırma objektif kullanın ~ 750 nm piksel boyutu, 3 kat çerçeve ortalama ve Excit405 nm diyot lazer% 10 e.
      2. Doğru miktar aynı değere her iki kanal dedektör kazancını ayarlamak sağlamak ve herhangi doymuş piksel önlemek için.
         Not: Burada kazançları% 150 kuruldu.
   2. 1 ml şırınga ile, örneğin kuyu dibine batırma orta yayarak sürekli daldırma emin olun ve herhangi bir hava kabarcığı yakalama kaçının.
   3. Iletilen ışık etkinleştirin ve her kuyuda bir görüş temsilcisi alanını bulmak. Bir doğru kalibre otomatik sahne kullanın ve yazılımı konumunu işaretleyin.
   4. Boyama için plakasının sökülmesinden sonra, (bölüm 4.3) plaka takın ve fokal sürüklenme önlemek için üst kısmında bir ağırlık ilave. Lazer tarama modu ile kaydedilen pozisyonları gözden geçirin ve düzgün odaklama ve yanal konumunu ayarlamak.
   5. 2 saat kadar, 2 dakika süre zaman atlamalı ayarlayın ve alımı başlatabilirsiniz.
2. Resim miktar (örneğin Bitplane Y verilecek) bu tür IMARIS gibidir
   1. Piksel matrislerin aritmetik hesaplamaları izin veren yazılım içine veri kümesi aktarın. Sürükleyip bağışçı ve yazılım simgesine alıcı kanalı hem de içeren kaynak dosya bırakarak bunu yapın.
   2. Aynı ofset kullanarak her iki kanallarda arka plan çıkarın. Bunu yapmak için, Menü'yü tıklatın ve sonra Görüntü tıklayın> İşleme> Baseline Çıkarma. Her kanalı seçin ve bazal değeri girin.
   3. Yeni bir kanal oluşturarak, önceden belirlenmiş düzeltme faktörü f (1.1 bakınız) ile alıcı kanalı (CH2) içine donör kanalı (Ch1) ve boşaltma-through düzeltin:
      Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
      Not: verici kanalı içine alıcı bir boşaltma yoluyla gürültü seviyesi üzerinde tespit edilememiştir.
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Arithmetics tıklayın ve butonu abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Daha sonra Menü> Düzenle> Kanallar Sil'i tıklatarak Kanal 2 silin. Emin olunkanamaya-yoluyla düzeltilmiş alıcı kanalı olarak kalır yeni Kanal 2. İsteğe bağlı: Menü> Düzenle> Görüntü Özellikleri giderek orijinal rengine gri kanal rengini değiştirin. Channel 4> Haritalı Renk> Temel Rengi seçip yeşil, örneğin değiştirin.
   4. Göreceli FRET katsayısını belirlemek için aşağıdaki işlemi ile yeni bir kanal oluşturun:
      = CH3 Ch2 '/ (Ch1 + CH2'),
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Aritmetik gidin ve ./ (CH1 + CH2) CH2 girin
   5. 8 bit görüntüde FRET kanalının uygun görünüm için, dördüncü kanal oluşturmak:
      Ch4 = 255 * Ch3
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Aritmetik gidin ve 255 * CH3 girin. Menü> Düzenle> Görüntü Özellikleri giderek kanal rengini değiştirin. Channel 4> Haritalı Renk> Renk Tablosu Dosya> Jet seçin.
   6. Kanallar CH3 ve Ch4 tha bir 3x3 medyan filtre uygulamakt görüntüler gürültüyü azaltır. Bunu yapmak için, Menü> Görüntü İşleme> Düzleştirici> Medyan Filtre tıklayın. Her iki kanal seçin ve bir filtre boyutu "3x3x1" uygulanacaktır.
   7. Hücresel sinyal ölçümü için doğru ofset ayarlayarak Ch4 hücrelerin tespit etmek ve çok küçük yapılar dahil büyüklük olarak yapı filtre.
      1. Seçin Görünüm Aşan ve simgesi "Yeni Yüzey Ekle" düğmesine tıklayın. Yüzey penceresinde algılama algoritma parametreleri tanımlayın. Daha hızlı işlem için, iki onay kutularını "Segment İlgi sadece Bölge" ve "nihayet Süreç tüm Image" etkinleştirin. Boyutlarını düzenleyerek ilgi bölgeyi tanımlamak.
      2. Kaynak kanalı olarak Kanal 4 seçip eşik> Arka Plan Çıkarma (Yerel Kontrast) tarafından eşiğini ayarlamak ve 10 um çapı ayarlayın. Maksimum intensi elle 0'a asgari yoğunluk eşiğini ve maksimum eşik ayarlamakty. Alana göre yapılarını Filtre ve örneğin, 187 μm² minimum değeri ayarlayın. Yüzey algılama bitirin.
   8. Donör floresan yoğunluğu (Ch1) ve bağıl FRET katsayısı (Ch3) ve hücresel varlık kendi standart sapmaları için ortalama değerler ayıklayın. Bunu yapmak için, Yüzey özelliklerine gidin. Yüzeyler Stil / Kalite> Yüzey seçerek yapıların görünümünü değiştirin. Filtreler sekmesini tıklayarak bütün yapıları seçiniz. Seçimi> birleştirmek Süreç giderek tespit yapıları birleştirin. Istatistik sekmesini tıklayarak MS Excel yüzey istatistiklerini İhracat> İhracat Tüm istatistikleri Dosyaya.
   9. Zaman içinde bu değerler çizilir. Transloke efektör miktarını temsil ettiği uygun bir parametre olarak her bir durum için donör kanalı floresan artış maksimum eğim 10 dakika aralığını belirlemek. M = Δ donör floresan yoğunluğu / Δ süresi (min) olarak eğimi hesaplayın.

Kantitatif hedef hücrelere efektör translokasyon analiz etmek için tarif edilen yönteme kapasitesini göstermek için, farklı bir translokasyon kinetiği iki Yersinia suşlar üzerine çalışıldı: Y. ve onun türevi WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 barındıran WA-314) (virülans plazmid pYVO8 22 barındıran serogrup O8) enterocolitica vahşi tip suş WA-314. Daha önce iş olduğunu gösterdi Y. Fonksiyonel YopE sergilediğini anlamlı olarak yüksek Yop translokasyon oranı 10 eksik enterocolitica mutantlar. Her iki suş da YopE ve TEM-1, beta-laktamaz (bla PMK-) 17 N-terminal salgılama sinyalinin füzyonlar için vektörler kodlama ile dönüştürülmüştür. WA-314 ek olarak bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere bir ilgili YopE ovalbümin füzyon (PMK-ova 17) bir vektör ile transforme edildi. 30, 60 ve 90 dakika inkübasyon süreleri daha method`s etkili menzili a değerlendirmek için uygulandıölçümü için nd uygunluk. İki farklı okuma veri analizi için kullanılmıştır: donör floresan (Ch1) ve bağıl FRET katsayıları (Şekil 1B ve 1C) (Ch3 CH2 '/ (Ch1 + Ch2') =).

Zamanla negatif kontrol suşu (Ch1) donör kanal şiddetlerinin WA-314-PMK-ova çizimi için bakılmaksızın inkübasyon süresi (Şekil 1B) floresan emisyon hiçbir artış göstermektedir. Bunun aksine, WA-314-PMK'yi-bla enfekte olmuş hücrelerde zamanla floresan yoğunluğunun artışı, hedef hücre sitoplazmasında YopE beta-laktamaz füzyon varlığına işaret tespit edilmiştir. Beklendiği gibi floresan yoğunluğunun maksimum eğim pozitif enfeksiyon (0.10 / dakika, 60 dakika enfeksiyonu: 0.33 / dakika, 90 dakika enfeksiyonu: enfeksiyon 30 dakika 0,76 / dakika) uzunluğu ile ilişkilidir belirten transloke beta- farklı konsantrasyonlarda laktamaz ayırt edilebilir. Önceki çalışmalar WA-31 uyarınca(: 1.28 / dakika, 60 dakika enfeksiyonu: 1.53 / dakika, 90 dakika enfeksiyonu: 1,41 / dakika enfeksiyonun 30 dakika) 4ΔYopE-PMK'yi-bla enfekte edilmiş hücreler daha hızlı olarak vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında floresan yoğunluğunun artışı sergiler. İlginç bir şekilde, 90 dakika enfeksiyonu daha fazla genişlemek enfeksiyonun 60 dakika boyunca (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında donör floresan artışı etmeyi hızlandırmamıştır. Bu bulgu, bunun nedeni, muhtemelen plazma zarı bütünlüğünün bozulmasına enfeksiyonun 60 dakika ötesine etkin translokasyon inhibe veya floresan boyaların kaybına neden olabilir, ya WA-314ΔYopE-PMK-bla, uyguladığı artan sitotoksik etkisi ile açıklanabilmektedir. Analiz için görece FRET katsayısı (CH3) kullanılarak sağlanan sonuçlar, tek başına donör kanal ile elde edilen sonuçları ile uyum içindedir. Bununla birlikte, transloke beta-laktamaz füzyon çok büyük miktarlarda temsil eden bazı koşullar altında (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 ve 90 dakika enfeksiyonu), tabii ki CCF4 substrat olduğuGörüntüleme başlamış olabilir önce parametreler sürekli işlenir. Bu koşullar eğrisinin ilgili kısmı bu veri gösterimi (Şekil 1C) cevapsız çünkü makul bir maksimum negatif eğiminin hesaplanması için izin vermez. Göreceli FRET katsayısı kanalının görüntüleri tek tek hücrelerin (Şekil 1D) arasındaki farklılıkları karşılaştırma olanağı sağlamaktadır.

Y. TEM-1 YopE füzyonları tarafından efektör translokasyon Şekil 1. kantitatif analizi enterocolitica. Transloke TEM-1, beta-laktamaz göre CCF4 alt-tabaka (A) hidrolizi lazer tarama mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Sağlam alt tabakanın yeşil floresan emisyon (530 nm) ve bölünmüş hidroliz pr mavi floresans emisyon (460 nm) sonuçlandı nm 405 uyarmaoduct (kumarin). (B, C) ​​Mikroskopi verileri nicel göreceli FRET katsayılarının verici kanal yoğunluğunu (Ch1) ya da hesaplama ve komplo (Ch3 Ch2 '/ (Ch1 + CH2' =)) komplo tarafından analiz edilmiştir. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. (D) tasvir mikrograflan (kanal FRET) belirtilen zaman noktalarında temsili film alınmıştır. WA-314ΔE-PMK-bla enfekte hücreler yabani tip WA-314-PMK-bla (60 dk enfeksiyonu) ile karşılaştırıldığında göreceli FRET katsayılarının daha hızlı bir düşüş göstermektedir. Ölçek çubuğu, 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Fluorophores V450 ve FITC Şekil 2. Çapraz konuşma belirlenmesi.Her iki münferit fluorophores spektrumları konfokal mikroskop ile ölçüldü. Akmalarını donör V450 arasında 525-535 nm dedektör aralığında alıcı kanalına bir lineer regresyon (insert) hesaplandı. İki ölçümlerinden hesaplanan çapraz-karışma ortalama yüzdesi 0.33 eşittir. Bleed-through alıcı FITC verici kanalı (455-465 nm) içine gürültü seviyesi üzerinde saptanabilir değildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.